造血干细胞移植中人巨细胞病毒检测：荧光定量聚合酶链反应的早期诊断价值

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.28.022

摘要/Abstract

摘要：

背景：动态监测造血干细胞移植受者血浆人巨细胞病毒载量，快速筛选出早期活动性人巨细胞病毒感染者，进而指导临床用药，提高造血干细胞移植的成活率。
目的：探讨荧光定量聚合酶链反应对造血干细胞移植患者人巨细胞病毒活动性感染的早期诊断价值。
方法：收集41例造血干细胞移植患者共656份血标本，应用实时荧光定量PCR方法动态监测血浆人巨细胞病毒DNA载量，并与60例健康体检者血浆人巨细胞病毒DNA载量对比分析。
结果与结论：656份血标本中96份阳性，病毒载量介于5.0×10²-1.0×10⁷IU/mL之间。治疗有效者人巨细胞病毒DNA迅速转阴，治疗耐药者持续阳性，12例连续阳性者2例死于巨细胞病毒活动性感染。实时荧光定量PCR方法检测人巨细胞病毒DNA适用于造血干细胞移植后巨细胞病毒活动性感染的早期诊断。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 造血干细胞移植, 人巨细胞病毒, 实时荧光定量PCR

Abstract:

BACKGROUND: To improve the survival rate of transplanted hematopoietic stem cells, dynamic monitoring of plasma content of human cytomegalovirus (HCMV) and rapid screening of early active HCMV infection in hematopoietic stem cell tranplantation recipients, thus to guide the clinical medication, is preferred.
OBJECTIVE: To evaluate the usefulness of fluorescence quantitative PCR assay for early detection of HCMV activation after hematopoietic stem cell transplantation.
METHODS: Real-time fluorescence quantitative PCR assay was applied for HCMV monitoring in 656 blood samples from 41 hematopoietic stem cell tranplantation recipients and 60 control blood samples.
RESULTS AND CONCLUSION: In 656 blood samples, 96 samples were positive, and the HCMV DNA copies ranged from 5.0×10² to 1.0×10⁷ IU/mL. Timely initiation of therapy resulted in the rapid clearance of DNA-viraemia but it recurrenced in short time by drug-resistent. Two cases from 12 postive recipients died from HCMV infection. The quantitative detection of HCMV DNA by real-time PCR is a rapid method for monitoring HCMV infection and the early diagnosis in patients after hematopoietic stem cell transplantation.

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Key words: hematopoietic stem cell transplantation, cytomegalovirus, cytomegalovirus infections, polymerase chain reaction

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 2

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引言

人巨细胞病毒(HCMV)在人群中的感染率很高，发达国家约为60%，在发展中国家或者某些特殊人群中，感染率超过95%^[1]。造血干细胞移植成为近年来治疗血液病、自身免疫性疾病等的有效手段，但由于移植前的预处理使用了大量化疗和放疗，致使患者免疫力极度低下，体内潜伏的人巨细胞病毒复燃或经输血及供者干细胞而感染^[2]。人巨细胞病毒感染是造血干细胞移植受者早期的主要感染并发症及死亡原因，既往因人巨细胞病毒导致的间质性肺炎病死率高达80%以上。人巨细胞病毒感染可使造血功能重建延迟，抑制造血细胞增殖和分化，导致移植物不能存活^[3]。人巨细胞病毒活动性感染能够诱导急性移植物抗宿主病发生，同样移植物抗宿主病也会伴随人巨细胞病毒感染增加。Cantoni等^[4]认为，巨细胞病毒感染和移植物抗宿主病作为异基因造血干细胞移植后重要并发症，二者有明确的联系。目前认为，移植后人巨细胞病毒感染的发生不仅与移植后免疫功能低下及免疫重建缓慢有关，可能更重要的是与人巨细胞病毒感染时受者免疫功能异常有关^[5]。实时荧光定量PCR检测血液中人巨细胞病毒-DNA载量，能提示人巨细胞病毒激活且体内病毒负荷大小，所以它能预测人巨细胞病毒疾病的发生并指导干预性治疗。实时荧光定量PCR通过检测人巨细胞病毒-DNA水平，监测病毒活跃程度，观察抗病毒治疗的效果有重要意义。研究资料表明，在人巨细胞病毒疾病发生之前，及时使用抗病毒药物治疗，可以有效控制病毒感染，预防和减少人巨细胞病毒疾病的发生，降低移植受者的死亡率^[6]。Torres等^[7]建议如血浆中人巨细胞病毒DNA>4×10⁶ IU/mL，即可诊断为活动性感染。Leruez-Ville等^[8]采用荧光定量PCR法和pp65抗原法同时对50例骨髓移植患者558份血标本进行检测，结果pp65检测出现17次阳性，荧光定量PCR法出现24次阳性，荧光定量PCR法平均比抗原检测法提前8 d出现阳性。可见荧光定量PCR法比抗原检测敏感，更利于早期检测人巨细胞病毒感染。因此，人巨细胞病毒动态监测对人巨细胞病毒疾病的早期诊断及抗病毒治疗，降低移植受者的死亡率极为重要。本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)方法对41例造血干细胞移植患者外周血浆人巨细胞病毒DNA进行动态定量监测，探讨定量PCR法对人巨细胞病毒活动性感染的诊断价值及对临床用药的指导意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：人巨细胞病毒-DNA载量检测。

时间及地点：于2012年1至12月在南昌大学第二附属院医学分子实验室完成。

对象：南昌大学第二附属医院血液科收治的异基因外周血造血干细胞移植患者41例，男23例，女18例，年龄5-63岁，中位年龄37.6岁。其中急性髓系白血病8例(M₁1例，M_2a 3例，M_2b1例，M_4a1例，M_4b1例，M_5b1例)，急性淋巴细胞白血病10例(ALL-L₁4例，ALL-L₂ 6例)，慢性髓系白血病16例(慢性期7例，加速期9例)，骨髓增生异常综合征7例。41例患者中非血缘异基因造血干细胞移植12例，血缘异基因造血干细胞移植29例；HLA高分辨配型不全相合9例，HLA全相合移植32例。

诊断标准：参考《血液病诊断及疗效标准(第3版)》^[9]。

纳入标准： ①移植类型均为异基因外周血造血干细胞移植。②常规进行移植后巨细胞病毒监测，直至停用全部免疫抑制剂。③供、受者均签署知情同意书，研究过程符合《医疗机构管理条例》。

另选择60名健康体检人群为对照组，各项体检指标均无明显异常，男35例，女25例，年龄3-61岁，中位年龄35.8岁。

方法：

预处理方案：20例患者应用经典的Bu-Cy作为预处理方案：马利兰3.2 mg/(kg•d)×4 d联合环磷酰胺60 mg/(kg•d)× 2 d；另21例采用Cy-TBI方案：具体为总剂量达12 Gy的全身照射分6次给予联合环磷酰胺 60 mg/(kg•d)×2 d；其中所有非血缘移植患者在预处理中加用抗胸腺细胞球蛋白(ATG)5 mg/(kg•d)×4 d。

造血干细胞动员、采集、回输：41例供者接受重组人粒细胞集落刺激因子注射液(国产，商品名：吉赛欣) 8-10 μg/(kg•d)，连续5 d皮下注射，于第5天股静脉置管，每次使用细胞分离机循环10 000-14 000 mL，终产量 200 mL，共采集2次；移植患者回输单核细胞数量为(8.15-22.5)× 10⁸/kg。

移植物抗宿主病预防：全部采用短程甲氨喋呤加环孢素及霉酚酸酯方案。

感染预防：移植前巨细胞病毒-DNA定量阴性的患者预处理前给予1周口服阿昔洛韦0.2 g/次。移植中及移植后：所有患者均应用阿昔洛韦口服0.2 g/次，3次/d或静脉阿昔洛韦5 mg/kg，每8 h 1次进行巨细胞病毒感染预防。移植中血制品均用辐照仪25 Gy照射，并采用巨细胞病毒学检测阴性的血制品。

植活标准：所有患者于回输造血干细胞+1 d，予重组人粒细胞集落因子150 μg/d皮下注射促进造血，并每日监测外周血象。连续3 d不再使用细胞集落刺激因子时，中性细胞数量绝对值>0.5×10⁹ L^-¹的第1天为粒细胞植活时间，在不进行血小板输注的情况下，血小板计数连续7 d> 20×10⁹ L^-¹表示血小板植活。造血干细胞回输+30 d，所有患者复查骨髓，骨髓象为增生活跃或明显活跃，并送短串联重复序列(STR)检查，不同血型患者转变为供者血型为移植成功。

收集血标本：41例患者于造血干细胞移植后每周采集2次抗凝静脉血(周一和周四)，连续抽取8周，共计656份血标本，进行人巨细胞病毒DNA检测。

60名健康体检者分别采集抗凝静脉血1份，进行人巨细胞病毒DNA检测。

DNA提取：无菌操作采集患者EDTA抗凝静脉血2 mL，使用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，然后直接加DNA提取液50 μL充分混匀，沸水浴10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液直接用于PCR或-20 ℃冻存备用。

人巨细胞病毒DNA定量：使用中山大学达安基因有限责任公司提供的人巨细胞病毒荧光定量试剂盒，用ABI-7500扩增仪进行实时荧光定量PCR，其扩增条件为：93 ℃预变性2 min，93 ℃变性45 s，55 ℃退火60 s，10个循环；93 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，30个循环。试剂盒提供的阳性标准品(10⁴-10⁷)以及阴性对照同时扩增，得出所测样本中的核酸载量值，用IU/mL表示。每次试验中，阴性对照的Ct值(循环阈值)不显示任何数值，检测下限为5.0×10² IU/mL。

主要观察指标：41例造血干细胞移植患者共656份血标本的人巨细胞病毒DNA载量，并与60例健康体检者血浆人巨细胞病毒DNA载量对比分析。

统计学分析：统计分析由经过培训的第二作者完成。采用SPSS 17.0 软件进行统计学分析，计量资料以x(_)±s表示，组间均值比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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