植物防龋疫苗融合基因表达载体中选择标记基因的去除

doi:10.12307/2023.767

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (1): 7-11.doi: 10.12307/2023.767

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植物防龋疫苗融合基因表达载体中选择标记基因的去除

郎遥玲1，2，王倩1，陈彬1，白国辉1，管晓燕1，刘建国1

1贵州省普通高等学校口腔疾病研究特色重点实验室暨遵义市口腔疾病研究重点实验室，遵义医科大学口腔医学院，贵州省遵义市 563000；2贵阳市口腔医院，贵州省贵阳市 550002

收稿日期:2022-11-03 接受日期:2022-12-24 出版日期:2024-01-08 发布日期:2023-06-28
通讯作者: 刘建国，博士，教授，主任医师，博士生导师，贵州省普通高等学校口腔疾病研究特色重点实验室暨遵义市口腔疾病研究重点实验室，遵义医科大学口腔医学院，贵州省遵义市 563000
作者简介:郎遥玲，女，1990年生，贵州省兴义市人，布依族，2016年遵义医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事龋病的免疫学防治研究，牙列错牙合畸形的矫治。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81260164)，项目负责人：刘建国；贵州省委组织部贵州省第六批人才基地(RCJD2019-9)，项目负责人：刘建国；遵义市首批市级人才基地(遵市科合社字[2017]20号)，项目负责人：刘建国；贵州省教育厅青年科技人才成长项目(黔教合KY字[2022]276号)，项目负责人：陈彬；贵州省卫生健康委科学技术基金项目(gzwkj2021-351)，项目负责人：陈彬

Removal of the selective marker gene in the fusion gene expression vector of plant anti-caries vaccine

Lang Yaoling1, 2, Wang Qian1, Chen Bin1, Bai Guohui1, Guan Xiaoyan1, Liu Jianguo1

1Guizhou Provincial Key Laboratory of Oral Disease Research in Colleges and Universities and Zunyi Key Laboratory of Oral Disease Research, School of Stomatology, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; 2Guiyang Stomatological Hospital, Guiyang 550002, Guizhou Province, China

Received:2022-11-03 Accepted:2022-12-24 Online:2024-01-08 Published:2023-06-28
Contact: Liu Jianguo, MD, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Guizhou Provincial Key Laboratory of Oral Disease Research in Colleges and Universities and Zunyi Key Laboratory of Oral Disease Research, School of Stomatology, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
About author:Lang Yaoling, Master, Attending physician, Guizhou Provincial Key Laboratory of Oral Disease Research in Colleges and Universities and Zunyi Key Laboratory of Oral Disease Research, School of Stomatology, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; Guiyang Stomatological Hospital, Guiyang 550002, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81260164 (to LJG); The Sixth Batch of Talent Bases in Guizhou Province of the Organization Department of Guizhou Provincial Party Committee, No. RCJD2019-9 (to LJG); The First Batch of Zunyi Municipal Talent Bases, No. Zunyi KHSZ[2017]20 (to LJG); Young Scientific and Technological Talent Growth Project of the Department of Education of Guizhou Province, No. QJHKYZ[2022]276 (to CB); Science and Technology Fund Project of Guizhou Provincial Health Commission, No. gzwkj2021-351 (to CB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

番茄果实特异性E8启动子：果实特异性E8启动子可以控制外源基因在番茄植物果实中的高效表达，避免外源基因在番茄植物的其他部位表达，减少对植物的不良影响。番茄的主要食用部位在果实，利用果实特异性启动子控制外源基因在果实中特异性表达具有重要的意义。
DOCK8(dedicator of cytokinesis 8)：是一种非典型鸟嘌呤核苷酸交换因子，参与小分子G蛋白的激活和细胞内信号网络的调节，在免疫应答的信号传导、免疫细胞的功能调节、肌动蛋白骨架的重建和免疫突触形成等方面有着重要的作用。

背景：出于对转基因植物的食用安全和生态安全的考虑，标记基因的存留是影响转基因植物的首要安全问题。
目的：基于免疫防龋原理，课题组针对表面蛋白和葡糖基转移酶这2种致龋毒力因子，构建植物防龋疫苗融合基因表达载体pCAMBIA-E8-APB-DOCK8，为转基因植物疫苗的研发提供基础。
方法：该研究运用DNA重组技术，通过DNA片段分离、连接、转化、克隆子检测、测序等系列步骤，将植物防龋疫苗融合基因表达载体pCAMBIA-E8-APB-DOCK8中的选择性标记基因Km和GUS去除。

结果与结论：标记基因去除效率达99%，该研究为免疫防龋的转基因植物疫苗的安全生产奠定了良好的实验基础，也为其它植物疫苗的载体构建提供思路。

https://orcid.org/0000-0003-2568-5838 (郎遥玲)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 植物疫苗, 免疫防龋, 表达载体, 标记基因, 转基因安全, E8启动子

Abstract: BACKGROUND: In consideration of the food safety and ecological safety of transgenic plants, the retention of marker genes is the primary safety issue affecting transgenic plants.
OBJECTIVE: Based on the principle of immune caries prevention, our research team successfully constructed the plant anti-caries vaccine fusion gene expression vector pCAMBIA-E8-APB-DOCK8 for these two caries causing virulence factors surface protein and glucosyltransferase, which provides a basis for the research and development of transgenic plant vaccine.
METHODS: In this study, the selective marker genes Km and GUS in the plant caries vaccine fusion gene expression vector pCAMBIA-E8-APB-DOCK8 were removed by DNA recombination technology through a series of steps such as DNA fragment separation, connection, transformation, clone detection, and sequencing.
RESULTS AND CONCLUSION: The efficiency of marker gene removal was 99%. This study has laid a good experimental foundation for the safe production of transgenic plant vaccine against dental caries, and also provided ideas for the construction of other plant vaccine vectors.

Key words: plant vaccine, immune anti-caries, expression vector, marker gene, transgenic safety, E8 promoter

中图分类号:

郎遥玲, 王倩, 陈彬, 白国辉, 管晓燕, 刘建国. 植物防龋疫苗融合基因表达载体中选择标记基因的去除[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 7-11.

Lang Yaoling, Wang Qian, Chen Bin, Bai Guohui, Guan Xiaoyan, Liu Jianguo. Removal of the selective marker gene in the fusion gene expression vector of plant anti-caries vaccine[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(1): 7-11.

图/表（结果） 4

参考文献

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引言

龋病是口腔最常见的疾病之一，国家卫生计生委发布的全国第三次和第四次口腔健康流行病学调查结果对比，5岁组儿童乳牙患龋率从66%上升到70.1%[1]。龋病如得不到及时的预防，将严重影响到人们的咀嚼功能和生活质量，因此龋病与癌症、心血管疾病被世界卫生组织(World Health Organization，WHO)列为人类需要三大重点防治的疾病。目前预防龋病的方法有氟防龋、控制碳水化合物的摄入、窝沟封闭和口腔卫生宣教等[2-3]，这些方法虽在一定程度上减少了龋病的发生，但防龋效果并不理想。因此，需要寻找一种能有效降低患龋率的方法已成为当今研究的热点[4-5]。
变异链球菌是人类最主要的致龋菌，其中主要的致龋毒力因子是表面蛋白(surface protein antigen，PAc)和葡糖基转移酶(glucosyltransferases，GTFs)[6]，研究表明针对这2种致龋毒力因子的抗体，可以有效抑制龋病的发生和发展。因此，“免疫防龋”可成为当今有效控制龋病的方法[7]。国内外大量研究表明，利用转基因植物作为抗原，能够有效激发动物的免疫应答，而最理想的免疫途径口服免疫能够有效激发黏膜免疫和体液免疫应答[8-9]。作者所在的课题组前期经过大量动物实验研究发现，利用转基因番茄口服免疫兔、大鼠、小鼠等动物实验，观察血液、唾液中均有特异性抗体产生[10-16]。目前，转基因植物口服疫苗的食用安全和生态安全受到了人们的广泛关注，首要安全问题来源于标记基因的存留，将标记基因去除可消除人们对安全性的顾虑[17-18]。此课题为课题组的系列研究，将进一步完善尚未解决的转基因植物中标记基因存留的问题。将植物防龋疫苗融合基因表达载体pCAMBIA-E8-APB-DOCK8(简称pE8AD3)中的标记基因Km和GUS去除，为免疫防龋的转基因植物疫苗的安全生产奠定了良好的实验基础，同时也为其它植物疫苗的载体构建提供思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计分子生物学设计：DNA重组技术。
1.2 时间及地点实验于2014年7月至2016年2月在遵义医科大学口腔疾病研究特色重点实验室完成。
1.3 材料

1.3.1 菌种和质粒大肠杆菌JM109感受态细胞(Escherichia coli JM109 Competent Cells)(宝生物工程大连有限公司)；pCAMBIA2301为植物的表达载体(上海迈其生物科技有限公司)；pE8AD3为课题组构建[19]，是以pCAMBIA2301双元穿梭载体为骨架，将外源基因果实特异性启动子E8，APB中包含cat、PacA和ctxB基因，以及胞质分裂专一蛋白8(DOCK8)依次构建到载体上，其中包含报告基因β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUS)及筛选标记卡那霉素(Kanamycin，Km)，质粒pE8AD3图谱见图1。

1.3.2 主要试剂 LB肉汤(环凯微，广东)；琼脂粉(索莱宝，北京)；卡那霉素(索莱宝，北京)；质粒小量提取试剂盒(OMEGA，美国)；琼脂糖凝胶回收试剂盒(OMEGA，美国)；PCR清洁纯化试剂盒(Axygen，美国)；限制性内切酶Xho I、Pml I、Nhe I(Fermentas，加拿大)；DNA连接酶：T4 DNA Ligase(TaKaRa，日本)；琼脂糖凝胶(Biowest，西班牙)；2×Taq PCR MasterMix(博迈德，北京)；Gold View Ⅰ型核酸染料(索莱宝，北京)；DNA Marker-BM5000、BM10000(博迈德，北京)。
1.3.3 主要仪器 PCR仪(BIO-RAD，美国)；恒温制冷摇床(Thermo，美国)；水平电泳仪(六一仪器，北京)；微量移液器(Eppendoff，德国)；高速冷冻离心机(Thermo，美国)；紫外分光光度计(Eppendorf，德国)；全自动凝胶成像分析系统(SYNGENE，美国)。
1.4 方法
1.4.1 实验技术路线寻找酶切位点，提取pE8AD3质粒，在此基础上通过Xho I、Pml I进行双酶切，胶回收目的片段；E8引物合成后进行PCR反应，将带有Xho IR和Pml IF保护碱基的E8进行Xho I、Pml I双酶切、纯化，与胶回收片段进行连接反应，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选出阳性克隆，质粒小量提取，酶切鉴定，公司测序。
1.4.2 pE8AD3质粒提取采用质粒小量提取试剂盒提取pE8AD3质粒，具体步骤参照试剂盒说明。使用紫外分光光度计，测定抽提质粒的吸光度比值A260/A280，计算出DNA的质量浓度，计算公式为：DNA质量浓度(μg/mL)=A260×50×稀释倍数。
1.4.3 质粒pE8AD3酶切及其目的片段的获得通过Xho I和Pml I将提取的质粒pE8AD3进行双酶切，37 ℃水浴12-16 h，如酶切不彻底可适当延长酶切时间；用Double Digestion Designer™
计算出所需的酶量，双酶切缓冲液选用Thermo Scientific公司的Double Digest Calculator。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒将对酶切后的目的片段pCAMBIA-APB-DOCK8(11 kb)进行回收，具体步骤参照试剂盒说明。使用紫外分光光度计，测定酶切回收DNA的吸光度比值A260/A280，并计算出DNA的质量浓度，计算公式为：DNA质量浓度(μg/mL)=A260×50×稀释倍数。
1.4.4 E8连接片段的获得以pE8AD3为模板，E8引物序列见表1，95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；55 ℃，45 s；72 ℃，90 s；34 cycles；72 ℃，10 min；12 ℃，forever。产物大小为1.1 kb；

琼脂糖凝胶电泳胶回收E8片段(513 bp)，具体步骤参照试剂盒说明；将琼脂糖凝胶回收试剂盒回收的E8片段进行Xho I、Pml I双酶切，去除保护碱基，37 ℃水浴12-16 h；使用PCR清洁试剂盒将E8酶切产物纯化，具体步骤参照试剂盒说明。

1.4.5 片段连接计算连接反应DNA片段所需用量：回收的载体片段/回收的插入片段=1∶10，回收的载体片段取0.03 pmol，回收的插入片段取0.3 pmol。1 pmol的1 000 bp大小DNA的质量为0.66 μg，因此回收的载体片段0.03 pmol的质量(μg)=0.03×0.66×(bp数÷1 000)；回收的插入片段0.3 pmol的质量(μg)=0.3×0.66×(bp数÷1 000)。先加入载体片段、插入片段和ddH2O混匀，45 ℃水浴5 min后立即置于冰上冷却，再加入T4 DNA Ligase和10×T4 DNA Ligase Buffer，室温过夜反应。
1.4.6 连接反应产物转化JM109感受态细胞取-80 ℃保存的JM109感受态细胞100 μL/管，加入上述连接反应液10 μL，放置于冰上30 min；42 ℃金属浴热击90 s后立刻取出放于冰上静置2 min；加入500 μL无抗性LB液体培养基，放置于37 ℃振荡培养45 min；室温下4 000 r/min离心5 min，超净台中吸出500 μL上清，剩余上清与菌液混匀后涂布在含有Km抗性的LB固体培养基平板上，37 ℃倒置培养12-16 h。

1.4.7 菌液PCR初步鉴定用消毒牙签挑取单菌落到700 μL含Km抗性的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养两三个小时，将未挑取菌落的LB液体培养基700 μL做为空白对照组，室温下10 000 r/min离心1 min，E8部分序列用“e8”表示，载体鉴定引物序列见表2，菌液采用PCR进行初步鉴定，反应条件：95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；52 ℃，30 s；72 ℃，45 s；32 cycles；72 ℃，10 min；12 ℃，forever。

1.4.8 阳性克隆扩大培养并提取质粒，用PCR及酶切鉴定将阳性克隆扩大培养，质粒小量提取试剂盒提取质粒，具体步骤参照使用说明。紫外分光光度计测值并计算DNA浓度，E8片段及载体鉴定引物序列见表2，APB部分序列用“apb”表示，D3部分序列用“d3”表示，载体鉴定引物序列见表3；酶切鉴定：Xho I单酶切，Xho I、Pml I双酶切，Xho I、Pml I、Nhe I三酶切；37 ℃水浴12-16 h。

1.4.9 质粒DNA测序将重组后去除Km、GUS抗性基因的质粒pE8AD3取菌液1.0 mL送苏州金唯智科技有限公司测序。
1.5 主要观察指标 ①提取pE8AD3质粒，通过Xho I、Pml I进行双酶切，观察胶回收目的片段大小；②E8引物合成后进行PCR反应，将带有Xho IR和Pml IF保护碱基的E8进行Xho I、Pml I双酶切、纯化，与胶回收片段进行连接反应，观察是否连接成功；③转化大肠杆菌JM109感受态细胞，阳性克隆筛选，质粒小量提取，酶切鉴定是否正确。

讨论

转基因植物的首要安全问题来源于标记基因的存留，目前人们对标记基因的安全顾虑主要有以下几个方面[20-22]：①标记基因是否会对机体产生潜在的过敏原性、毒性和抗营养因子；②是否会破坏生态环境；③标记基因是否会传播到亲缘品种中，使现有的除草剂除灭不了超级杂草；④标记基因是否会转移到微生物中，导致抗生素失效。标记基因主要分为除草剂标记基因和抗生素标记基因。除草剂标记基因包括5-烯醇丙酮酰草莽酸-3-磷酸合成酶基因(5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase，epsps)、膦丝菌素乙酰转移酶基因(phosphinothricin acetyltransferase，pat)和乙酰乳酸合成酶基因(acetolactate synthase，als)。而抗生素基因主要包括新霉素磷酸转移酶基因(neomycin phosphotransferase gene，nptⅡ)[23]、潮霉素磷酸转移酶基因(hygromycin-B-phosphotrans-ferase，hpt)[24]。nptⅡ是番茄遗传转化中运用最广的基因，虽然已有动物实验证明nptⅡ基因的编码产物会在胃液中迅速降解，该产物对小鼠并没有毒副作用[25]，其蛋白表达量仅占番茄果实的0.000 05%-0.001%[26]。但是由于nptⅡ基因的编码产物对有毒性的新霉素和卡那霉素存在抗性，因此以nptⅡ基因作为标记基因的转基因番茄目前尚未用于人体试验[27]。
早在1987年，番茄就已被用于基因遗传转化，抗苜宿花叶病毒[28]、抗鳞翅目幼虫的转基因番茄在同年问世[29]，随后又出现了抗黄瓜花叶病毒[30]、抗黄曲叶病毒[31]、抗烟草花叶病毒和抗致病疫霉等转基因番茄[32-33]。2000年番茄首次被用于生产口服疫苗，成功表达呼吸道合胞病毒F蛋白，诱导小鼠产生全身性的免疫反应[34]。番茄作为生物反应器用于多种疫苗的制造，如霍乱毒素B亚单位疫苗[35-36]、乙肝病毒和艾滋病毒双价口服疫苗[37]、肠道病毒71型疫苗以及狂犬病疫苗等[38]。此外，随着表达芯片、蛋白芯片、miRNA芯片和SNP芯片等多种高通量分析手段的问世，成为转基因番茄口服疫苗研究的有效手段。
目前通过以下3种策略消除标记可能存在的安全问题：①使用没有争议的安全标记基因；②运用无选择标记基因体系进行遗传转化；③标记基因的去除。由于位点特异性重组系统重组酶基因和选择标记基因的表达元件位于不同的载体中，需通过杂交或多次转化才能去除选择标记基因，前2种方法存在费时低效等缺点，因此，利用DNA重组技术将标记基因去除更精准高效，成为培育转基因植株的重要途径[39]。转基因植物安全性的提高，将会给人类带来更大的经济效益和社会效益。目前，关于去除标记基因后是否影响其它基因的表达，国内外罕见报道，后期实验可做相关性研究分析。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

植物防龋疫苗融合基因表达载体中选择标记基因的去除

Removal of the selective marker gene in the fusion gene expression vector of plant anti-caries vaccine

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