共沉默miR-221-3p/222-3p表达抑制骨髓间充质干细胞增殖及促成软骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.004

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (50): 8056-8061.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.004

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共沉默miR-221-3p/222-3p表达抑制骨髓间充质干细胞增殖及促成软骨分化

闫继红，杨姝，孙海梅，曹丹丹，张秀英，季凤清，郭多，吴波，孙婷怡，周德山

首都医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系组织胚胎学教研室，北京市 100069

收稿日期:2015-11-04 出版日期:2015-12-03 发布日期:2015-12-03
通讯作者: 周德山，博士，教授，首都医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系组织胚胎学教研室，北京市 100069
作者简介:闫继红，女，1967年生，吉林省人，汉族，2005年中国协和医科大学毕业，博士，副教授，主要从事干细胞与组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81271728)；北京市自然科学基金面上项目(7152023)

Down-regulation of miR-221-3p/222-3p inhibits cell proliferation and promotes chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells

Yan Ji-hong, Yang Shu, Sun Hai-mei, Cao Dan-dan, Zhang Xiu-ying, Ji Feng-qing, Guo Duo, Wu Bo, Sun Ting-yi, Zhou De-shan

Department of Histology & Embryology, Faculty of Human Anatomy and Embryology, School of Preclinical Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China

Received:2015-11-04 Online:2015-12-03 Published:2015-12-03
Contact: Zhou De-shan, M.D., Professor, Department of Histology & Embryology, Faculty of Human Anatomy and Embryology, School of Preclinical Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China
About author:Yan Ji-hong, M.D., Associate professor, Department of Histology & Embryology, Faculty of Human Anatomy and Embryology, School of Preclinical Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China
Supported by:
Bone Marrow; Mesenchymal Stem Cells; Cell Differentiation; MicroRNAs; Tissue Engineering
Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81271728; the Natural Science Foundation of Beijing, No. 7152023

摘要/Abstract

摘要：

背景：基于干细胞的组织工程技术作为治疗骨关节损伤修复的有效手段，具有广泛的应用前景。研究表明miRNA在调控干细胞向软骨分化过程中具有重要的作用。
目的：探讨共感染慢病毒介导的反义miR-221-3p/222-3p(microRNA-221-3p，microRNA-222-3p)对人骨髓间充质干细胞成软骨分化的作用，为临床软骨损伤修复提供新的策略。
方法：利用miRNA基因芯片技术筛选转化生长因子β3诱导人骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中不同阶段表达差异的miRNA，并利用荧光实时定量PCR(RT-qPCR)验证；构建慢病毒人反义miR-221-3p/222-3p载体(Lv-miR-221-3p-inhibition，Lv-miR-222-3p-inhibition)并共转染人骨髓间充质干细胞，空载体组(Lv-GFP)以及未转染组作为对照。利用CCK-8法检测沉默miR-221-3p/222-3p 6 d后细胞的增殖情况；通过番红O染色法、免疫组织化学方法以及RT-PCR验证各组软骨诱导21 d后软骨分化相关标志物的表达。
结果与结论：构建的Lv-miRNA-221-3p/222-3p inhibition 共转染人骨髓间充质干细胞，成功沉默了细胞中的miR-221-3p/222-3p表达水平；miRNA基因芯片与RT-qPCR验证结果显示miR-221-3p/222-3p在软骨分化后期表达明显降低；转染组与未转染组以及空载体组相比：①细胞增殖明显受到抑制。②番红Ｏ染色以及免疫组织化学显示软骨分化特征标志物硫酸软骨素以及Ⅱ型胶原表达增强。③RT-qPCR也证实硫酸软骨素以及Ⅱ型胶原的mRNA表达也明显上调。结果显示沉默人骨髓间充质干细胞miRNA-221-3p/222-3p，抑制了细胞增殖并促进了成软骨分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 成软骨分化, miR-221-3p, miR-222-3p, 慢病毒表达载体, 骨髓间充质干细胞, 沉默miRNA, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The use of mesenchymal stem cells in the field of tissue engineering for osteoarticular injury repair is a very promising tool since these cells are readily expandable and able to differentiate into chondrocytes. Abundant evidence suggests that microRNAs play critical roles in chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To observe the chondrogenic effect of human bone marrow mesenchymal stem cells transfected with lentiviral vectors bearing miR-221-3p/222-3p inhibition, thereby provding new strategies for cartilage injury.
METHODS: miRNA microarray technology was applied to detect microRNAs expression profiles at three different stages of chondrogenic differentiation induction after transforming growth factor-β3 treatment and verified by
real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR). Human bone marrow mesenchymal stem cells were infected with lentivirus bearing miR-221-3p/222-3p inhibition. After co-suppressing the expression of miR-221/222-3p, cell counting kit-8 was used to determine the cell proliferation, the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells towards chondrocytes was verified by type II collagen protein expression through immunohistochemistry and glycosaminoglycan accumulation was also elevated by sarranine O staining. RT-PCR was used to detect type II collagen and aggrecan mRNA expression at 21 days of chondrogenic induction.
RESULTS AND CONCLUSION: The expression of miR-221-3p/222-3p was inhibited after Lv-miR221-3p/222-3p inhibition co-transfected into bone marrow mesenchymal stem cells. microRNA microarray and RT-qPCR results showed that the expression of miR-221-3p/222-3p was declined significantly at the anaphase of chondrogenic differentiation. The expression levels of chondrogenic markers, Aggrecan and type II collagen were significantly increased in the miR-221-3p/222-3p inhibition group and cell proliferation was also inhibited significantly compared with non-transduced cells or transduced with the empty lentiviral vector group. miR-221-3p/222-3p knockdown in bone marrow mesenchymal stem cells could inhibit proliferation but promote chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

中图分类号:

R394.2

闫继红，杨姝，孙海梅，曹丹丹，张秀英，季凤清，郭多，吴波，孙婷怡，周德山. 共沉默miR-221-3p/222-3p表达抑制骨髓间充质干细胞增殖及促成软骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(50): 8056-8061.

Yan Ji-hong, Yang Shu, Sun Hai-mei, Cao Dan-dan, Zhang Xiu-ying, Ji Feng-qing, Guo Duo, Wu Bo, . Down-regulation of miR-221-3p/222-3p inhibits cell proliferation and promotes chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(50): 8056-8061.

图/表（结果） 4

参考文献

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引言

疾病和损伤造成的退行性关节病(如骨关节炎)是目前临床治疗尚未完全解决的问题。目前基于干细胞的组织工程技术作为治疗骨关节损伤的有效方法，具有广泛的应用前景。来源于骨髓的间充质干细胞具有自我更新和多向分化潜能，在体内分布广泛，易于获得，并能在体外大量扩增，使其在组织工程应用中优于其他种类的种子细胞^[1-3] 。
在骨髓间充质干细胞诱导成软骨分化过程中，众多生长因子及转录调节因子等参与其调控过程。microRNA (miRNA)是一类约22 nt的内源性非编码单链小RNA，通过与靶mRNA的3’非翻译区(3'-UTR)不完全互补配对，抑制mRNA的翻译或影响mRNA的稳定性，减少蛋白的表达，参与转录后调节。近年来研究表明，miRNA在基因表达调控方面具有重要作用，尤其在干细胞自我更新与多向分化中的调节作用日益受到关注^[4-7]。已有大量研究表明miRNA也调控间充质干细胞成软骨分化^[8-10] 。
在人类的DNA中，miR-221/222基因簇位于染色体xp11.3位点，miR-221和miR-222被分开大约726 bp，在miR-222上游启动子区域含有2个TATA盒序列，这2个基因的核苷酸序列具有很高的相似性^[11-12]。课题组利用microRNA基因芯片技术检测转化生长因子β3诱导人骨髓间充质干细胞成软骨分化不同阶段miRNA的表达情况，筛选出在分化不同时期表达明显差异的miRNA，其中miR-221-3p和miR-222-3p在诱导分化后期其表达明显降低，由此推测 miR-221-3p/miR-222-3p可能是软骨分化负性调控因子。
基于以上研究背景，实验构建慢病毒介导的miR-221-3p/miR-222-3p抑制剂表达载体共感染人骨髓间充质干细胞，观察其对骨髓间充质干细胞增殖以及成软骨分化的影响。

材料方法

1.1 设计分组对照观察，细胞学实验。
1.2 时间及地点实验于2013年12月至2015年8月在首都医科大学基础医学院胃肠病理实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞人骨髓间充质干细胞购自赛业生物科技有限公司(Cyagen Biosciences)。
1.3.2 慢病毒载体慢病毒介导反义miR-221-3p/222-3p (lv-221-3p/222-3p inhibition)和control载体(lv-control)由上海吉凯基因化学技术有限公司(Shanghai Genechem Co.，Ltd)合成。
1.3.3 实验试剂人骨髓间充质干细胞基础培养基和成软骨诱导分化完全培养基(广州赛业公司)；胎牛血清(Gibco)；兔抗人 CollagenⅡ多克隆抗体(Abcam)；番红O染液(北京欣经科生物技术有限公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)(武汉博士德有限公司)；Trizol (Invitrogen)；miRNeasy mini kit (QIAGEN)；2X PCR master mix(Arraystar)；miRCURYTM LNA Array (v.18.0) (Exiqon)；免疫组化试剂盒(PV6001)(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养人骨髓间充质干细胞接种于25T的细胞培养瓶中，加入人骨髓间充质干细胞基础培养基(含体积分数为10%的胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素)，置于37 ℃、含体积分数为5% CO2细胞培养箱中。每3 d更换1次培养基，当细胞融合率达到90%左右时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，按照1∶3传代培养。
1.4.2 病毒感染取第3代人骨髓间充质干细胞，细胞融合达60%左右时，PBS洗涤细胞后，加入2 mL培养基，按MOI=10分别加入重组载体病毒(Lv-miR-221-3p/ miR-222-3p inhibition)和空病毒载体对照(Lv-control)，并补充适量polybrane，混匀后置于37 ℃，体积分数为5%CO2细胞培养箱中培养；培养12 h后，吸去含病毒的培养基换新鲜基础培养液继续培养4 d后，倒置荧光显微镜观察荧光表达情况。RT-qPCR 检测miR-221-3p/ miR-222-3p表达水平。同时设置未转染载体组(Control)。
1.4.3 CCK-8法检测转染后细胞的增殖能力取处于生长对数期2D培养的转染后各组细胞，弃掉上清液，PBS洗2遍，用0.25%胰蛋白酶进行消化，使用培养液调整细胞浓度为3×106 L-1，然后接种于96孔板中，每孔100 μL细胞悬液，每组设3个平行孔，置于37 ℃、体积分数为5%CO2饱和湿度的培养箱内孵育4 h待细胞贴壁，然后更换新鲜的培养基，再加入CCK-8液10 μL，在37 ℃条件下孵育1 h，用酶标仪测量450 nm处的吸光度值，连续监测6 d，观察细胞生长状况。
1.4.4 微团培养诱导人骨髓间充质干细胞软骨分化分别取第4代人骨髓间充质干细胞以及转染组、空载体组的人骨髓间充质干细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，离心后按5×108 L-1的细胞数加入软骨诱导完全培养基重悬骨髓间充质干细胞，将0.5 mL的细胞悬液置于15 mL离心管中，800×g离心5 min，过夜后，即成细胞微团(3D培养)，软骨诱导分化完全培养基中包含抗坏血酸盐(50 mg/L)、1%ITS(胰岛素、转铁蛋白、硒)、脯氨酸(40 mg/L)、地塞米松(100 nmol/L)和转化生长因子β3(10 μg/L)。
1.4.5 基因芯片与RT-qPCR筛选及验证成软骨分化过程中差异miRNAs 分别收集软骨诱导分化3，14，28 d的软骨细胞团，每组3个样本，加入适量Trizol试剂，使细胞充分裂解。然后采用miRNA基因芯片进行检测(上海康成生物有限公司完成)，筛选各组差异表达的miRNA，进行RT-qPCR验证。以U6作为内参检测miR-221-3p/222-3p的表达。
1.4.6 番红O染色及免疫组织化学染色收集转染后各组软骨诱导21 d的细胞团经4 g/L多聚甲醛固定后，石蜡包埋切成5 μm厚切片。切片脱蜡入水后，1%盐酸乙醇分化30 s后，清水冲洗，再用0.1%番红O染色10 min，经乙醇脱水后，封固，观察软骨细胞外基质糖胺多糖的表达。切片脱蜡至水后，加入体积分数为3%H2O2室温放置20 min封闭内源过氧化物酶，PBS冲洗，加入兔抗人的Col2A1一抗4 ℃湿盒孵育过夜，PBS清洗后，滴加PV6001二抗，室温孵育20 min，DAB显色，封固后，免疫组织化学染色观察软骨细胞分泌特异的Ⅱ型胶原表达。
1.4.7 实时定量PCR检测收集转染后各组软骨诱导培养21 d的软骨细胞团，检测软骨分化相关基因表达。使用Trizol分别提取各组总RNA，按照反转录试剂盒说明书反转录得到cDNA，并将所获的cDNA样品分别配置Real-time PCR反应体系，置于Real-time PCR仪上进行PCR反应。反应结束后在PCR仪上读取Ct值，以GAPDH为内参分析CollagenⅡ与aggrecan的表达。数据采用2-??Ct法进行分析计算各目的基因mRNA相对表达量。

1.5 主要观察指标 ①转染miR-221-3p/222-3p抑制剂后，对人骨髓间充质干细胞增殖的影响。②转染miR-221-3p/222-3p抑制剂后，对诱导人骨髓间充质干细胞成软骨分化相关基因和蛋白表达的影响。
1.6 统计学分析采用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析和处理，两组间比较采用非配对t 检验，多组间比较采用方差分析，数据以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近年研究证明miRNA在干细胞的分化过程中发挥极其关键性的作用。研究证实miRNA-143可以调控脂肪干细胞向脂肪细胞方向分化^[6]，miRNA-1和miRNA-133可以调控胚胎干细胞向心肌细胞的分化^[7]。近年来有研究人员通过基因芯片技术和荧光素酶检测发现，miR-145可直接作用其靶基因sox9，对骨髓间充质干细胞成软骨分化起负性调节^[9]，另外还有研究发现miR-199a通过抑制Smad1转录因子而影响C3H10T1/2细胞早期软骨分化^[10]。目前已有研究表明，在多种肿瘤细胞中miR-221/222呈高表达，并且其可通过作用p21，p27kip和p57kip2等细胞周期依赖激酶抑制因子来调节细胞周期，促进肿瘤细胞以及神经细胞等多种细胞增殖^[11-24]。另外，miR-221/222可作用于血管平滑肌细胞和内皮细胞，在心血管疾病的发生和治疗中具有重要作用^[24-29]。也有研究发现miR-221可以调节鸡骨髓间充质干细胞软骨分化^[30]，并在诱导脐血干细胞软骨分化过程中表达明显下调^[31]。
本实验室利用miRNA芯片检测人骨髓充质干细胞成软骨分化不同阶段miRNA的表达谱，发现miR-221-3p和miR-222-3p在软骨分化晚期即软骨细胞成熟阶段二者表达均明显降低，推测miR-221-3p和miR-222-3p可为骨髓间充质干细胞软骨分化的负调节因子。本研究拟敲低骨髓间充质干细胞中的miR-221-3p/miR-222-3p，观察对骨髓间充质干细胞软骨分化的影响。
由于体外软骨诱导分化过程时间较长，在本研究中采用慢病毒载体介导反义miR-221-3p和miR-222-3p，可将外源的shRNA整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的基因的效果^[32]，与化学合成的miRNA抑制剂相比具有更强、更长久的抑制效力和更低的细胞毒性。RT-qPCR结果显示该载体对骨髓间充质干细胞有较高感染效率，在体外导入骨髓间充质干细胞中，有效地抑制了内源性miR-221-3p/222-3p的表达。人细胞中miR-221和miR-222核心种子序列(68-72)完全同源，有研究表明miR-221-3p/222-3p可以协同作用^[33-34]，因此，本研究共转染反义miR-221-3p/222-3p，同时抑制miR-221-3p/222-3p的表达。
实验结果显示同时沉默骨髓间充质干细胞中的miR-221-3p/222-3p，抑制了骨髓间充质干细胞增殖并促进了向软骨分化，这为利用骨髓间充质干细胞和RNA干扰技术进行软骨损伤修复及对骨性关节炎的治疗提供一定的理论基础和实验依据，具有十分重要的意义。

共沉默miR-221-3p/222-3p表达抑制骨髓间充质干细胞增殖及促成软骨分化

Down-regulation of miR-221-3p/222-3p inhibits cell proliferation and promotes chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells

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