热敏灸银屑病模型大鼠外关穴的生物学变化

doi:10.12307/2023.598

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (32): 5150-5154.doi: 10.12307/2023.598

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热敏灸银屑病模型大鼠外关穴的生物学变化

陈楚，欧阳厚淦，朱绪映，齐艳喆，王姿

江西中医药大学，江西省南昌市 330004

收稿日期:2022-08-15 接受日期:2022-10-24 出版日期:2023-11-18 发布日期:2023-03-23
通讯作者: 欧阳厚淦，博士，教授，江西中医药大学，江西省南昌市 330004
作者简介:陈楚，女，1995年生，江西省赣州市人，汉族，2022年江西中医药大学毕业，硕士，主要从事中西医结合方面的研究。
基金资助:
江西省自然科学基金面上项目(20202BABL206143)，项目负责人：欧阳厚淦；江西省教育厅科技项目重点课题(GJJ201213)，项目负责人：欧阳厚淦

Biological changes of Waiguan acupoint in a rat model of psoriasis undergoing heat-sensitive moxibustion

Chen Chu, Ouyang Hougan, Zhu Xuying, Qi Yanzhe, Wang Zi

Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China

Received:2022-08-15 Accepted:2022-10-24 Online:2023-11-18 Published:2023-03-23
Contact: Ouyang Hougan, MD, Professor, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China
About author:Chen Chu, Master, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Jiangxi Province (General Program), No. 20202BABL206143 (to OHG); Key Scientific Project of Education Department of Jiangxi Province, No. GJJ201213 (to OHG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
太赫兹波：指频率在0.1-10 THz范围内的电磁波，在长波段与短波段分别与毫米波和红外光相重合，对于分子之间的信息应答以及分子的精确调控方面异常敏感，并在有关腧穴上具有特异性表现。
结缔组织：由细胞和细胞基质构成，包括神经、淋巴等，具有连接、保护、营养等作用；研究发现其可能对人体产生调控作用，该实验所研究的筋膜也属于广义的结缔组织。

背景：在临床治疗以及基础研究中热敏灸运用广泛，但其敏化穴位的生物学特性尚未完全明确。
目的：探讨热敏灸对银屑病模型大鼠结缔组织、钙离子以及太赫兹波的影响以及相互之间的关系。
方法：采用5%咪喹莫特乳膏诱导银屑病SD大鼠模型，将实验大鼠随机分为空白组、模型组、治疗组。除空白组外，其余各组大鼠背部和手少阳三焦经循行路线处皮肤进行银屑病皮损造模，造模成功后治疗组于每日同一时间对手少阳三焦经外关穴进行灸疗，每次40 min，连续7 d，在治疗期间尾温波动> 1 ℃为热敏灸组，尾温波动≤1 ℃为艾灸组。苏木精-伊红染色观察大鼠皮下结缔组织的病理学变化，比色法检测皮下筋膜钙离子变化，太赫兹波探测仪检测外关穴的太赫兹波电压均值变化。
结果与结论：①与空白组比较，模型组大鼠结缔组织病理学改变明显；②与空白组和模型组相比，艾灸组和热敏灸组皮下筋膜钙离子浓度增高(P < 0.01)；与艾灸组相比，热敏灸组皮下筋膜钙离子浓度明显增高(P < 0.01)；③治疗组在治疗第3天时，太赫兹波电压均值高于模型组和空白组(P < 0.01)，第7天时，艾灸组的太赫兹波电压均值仍高于模型组和空白组(P < 0.01)，而热敏灸组的太赫兹波电压均值则接近于空白组；与艾灸组相比，热敏灸组治疗第3天的太赫兹波电压均值明显增高(P < 0.01)，第7天时则明显下降(P < 0.01)；④结果表明，在热敏灸治疗过程中银屑病模型大鼠穴位局部的钙离子出现富集现象，太赫兹波也有改变，热敏灸、钙离子以及太赫兹波之间或存在密切联系，从而治疗或改善银屑病症状。
https://orcid.org/0000-0002-1807-1849(陈楚)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 热敏灸, 银屑病, 结缔组织, 钙离子, 太赫兹波, 模型大鼠

Abstract: BACKGROUND: Heat-sensitive moxibustion is widely used in clinical treatment and basic research, but the biological characteristics of its sensitized acupoints are not completely clear.
OBJECTIVE: To explore the effects of heat-sensitive moxibustion on connective tissue, calcium and terahertz wave in psoriatic rats and the relationship between them.
METHODS: Animal models of psoriasis were induced by 5% imiquimod cream in Sprague-Dawley rats, and the experimental rats were randomly divided into blank group, model group and treatment groups. Except the blank group, the rats in the other groups were modeled with psoriatic lesions on the back and along the Sanjiao meridian of hand-Shaoyang. After successful modeling, the treatment group was treated with moxibustion at Waiguan acupoint at the same time every day, 40 minutes once for 7 days in total. During the treatment period, the tail temperature changed > 1 oC was considered to be the heat-sensitive moxibustion group, and the tail temperature changed ≤ 1 oC was considered to be the moxibustion group. Hematoxylin-eosin staining was used to observe the pathological changes of subcutaneous connective tissue, colorimetric method was used to detect the changes of calcium ions in subcutaneous fascia, and terahertz wave detector was used to detect the changes of mean terahertz wave voltage at Waiguan point.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank group, the pathological changes of connective tissue were obvious in the model group. Compared with the blank group and model group, the calcium ion concentration in subcutaneous fascia was significantly higher in the moxibustion group and heat-sensitive moxibustion group (P < 0.01). The calcium ion concentration in the subcutaneous fascia was significantly higher in the heat-sensitive moxibustion group than the moxibustion group (P < 0.01). On the 3rd day of treatment, the mean terahertz wave voltage values in the treatment groups were higher than those in the model group and the blank group (P < 0.01). On the 7th day, the mean terahertz wave voltage in the moxibustion group was still higher than that in the model group and the blank group (P < 0.01), while the mean terahertz wave voltage in the heat-sensitive moxibustion group was close to that in the blank group. Compared with the moxibustion group, the mean terahertz wave voltage of the heat-sensitive moxibustion group was increased significantly on the 3rd day (P < 0.01) and decreased significantly on the 7th day (P < 0.01). To conclude, during the treatment with heat-sensitive moxibustion, local calcium ions are enriched in the acupoint of psoriatic rats, and terahertz waves are also changed. There may be a close link between heat-sensitive moxibustion, calcium ions and terahertz waves to treat or improve the symptoms of psoriasis.

Key words: heat-sensitive moxibustion, psoriasis, connective tissue, calcium ion, terahertz wave, model rat

中图分类号:

陈楚, 欧阳厚淦, 朱绪映, 齐艳喆, 王姿. 热敏灸银屑病模型大鼠外关穴的生物学变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(32): 5150-5154.

Chen Chu, Ouyang Hougan, Zhu Xuying, Qi Yanzhe, Wang Zi. Biological changes of Waiguan acupoint in a rat model of psoriasis undergoing heat-sensitive moxibustion[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(32): 5150-5154.

图/表（结果） 5

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引言

银屑病是一种发病率较高的慢性炎症性皮肤病，因其病程缠绵且病情易反复，是当今皮肤科研究的重中之重。中医对于银屑病的研究最早见于《诸病源候论》，并且在治疗上具有独特优势。近年来，临床采用针灸治疗银屑病取得了一定进展[1-2]。灸疗学是针灸学的重要组成部分，艾灸实际上是一种温热刺激，通过作用于皮肤感受器来调节机体状态。临床研究表明艾灸也能够产生针刺样得气表现，即为热敏灸。那么热敏灸治疗银屑病的机制何在呢？通过查阅文献以及前期研究发现筋膜结缔组织可能与灸信号传导有一定关系[3]，同时研究发现经穴会对结缔组织中的生物感受器产生影响[4]，带来较强的生物学信息变化；由此作者推测热敏灸通过作用于结缔组织浅筋膜，在艾热这种物理刺激下导致穴区结缔组织等发生形变，进而对人体产生调节作用。研究发现在热敏灸治疗过程中会形成以热敏灸腧穴为圆点的一定范围高红外辐射区域，热敏腧穴具有较高的红外辐射强度特征[5]。太赫兹(Tera Hertz，THz)辐射是一种频率在微波与红外光波之间的电磁波，它的频率范围较小。它对于分子之间的信息应答以及分子的精确调控方面异常敏感[6-7]，并且太赫兹电磁辐射能够通过调节细胞膜内钙离子(Ca2+)浓度促进受损伤生物组织中细胞的分裂和新生细胞的生成，实现太赫兹波辐射的生命医药价值[8]。钙离子是机体内一种重要的无机离子，许多生理病理活动都与钙离子浓度密切相关，并且钙离子是细胞中信号传导的第二信使，它可启动许多细胞的生理活动[9-10]，研究发现艾灸能使背俞穴的相应脏器出现钙离子富集[11]。基于以上内容，该实验探讨热敏灸、太赫兹以及钙离子在银屑病模型大鼠疾病发展、转归中的关系，为其在中医药领域的应用提供理论支持。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照分组动物实验，多组间数据比较采用方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较用 LSD 法。
1.2 时间及地点实验于2020年12月至2021年1月在江西中医药大学中医学院科研平台完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 8-10周龄SPF级雌性SD大鼠60只，体质量180-220 g，由江西中医药大学动物实验中心提供，动物合格证编号为SCXK(赣)2018-0003，在温度、湿度合适的动物房内饲养1周，每3 d 更换垫料，每日喂养新鲜饮用水及饲料。实验方案经江西中医药大学动物实验伦理委员会批准，伦理批准号：JZLLSC20210073。
1.3.2 实验试剂艾条(南阳市宛北艾绒厂)；5%咪喹莫特乳膏(四川明欣药业有限责任公司)；白凡士林(山东利尔康医疗科技股份有限公司)；苏木精-伊红染液(南昌雨露实验器材有限公司)；比色试剂盒(江苏酶免)。
1.3.3 实验仪器 SPECORD s600紫外分光光度计(德国耶拿分析仪器股份公司)；DM2500型正置荧光显微镜(德国Leica公司)；人体太赫兹波探测器(上海理工大学太赫兹创新研究院)。
1.4 实验方法将大鼠随机分为模型组15只、空白组15只和治疗组30只，根据高扬等[12]所述方法对大鼠进行造模，将背部中央区域约2 cm×2 cm 面积和手少阳三焦经循行路线区域毛发脱去，并按照0.05 g/cm2 涂抹药膏，其中空白组大鼠在备皮区涂抹白凡士林乳膏，模型组、治疗组大鼠涂抹5%咪喹莫特乳膏，1次/d，共涂抹7 d。最后1只大鼠涂抹2 h后，对治疗组外关穴进行艾灸治疗，采用《实验针灸学》中实验动物腧穴作为主要定穴参考，“外关”穴定位于大鼠腕关节上约3 mm处，尺、桡骨缝间。在进行治疗时，固定大鼠，在距大鼠皮肤约3 cm处进行温和悬灸，每次40 min，1次/d，共7 d，治疗组在第3天和第7天完成相应治疗后，立刻将大鼠受试穴位贴合检测窗口进行太赫兹检测，空白组和模型组则在第7天进行检测，为保证实验准确性，每鼠重复检测3次。在治疗期间尾温波动> 1 ℃为热敏灸组，尾温波动≤1 ℃为艾灸组[13]，在7 d治疗过程中，有15只大鼠实现热敏化，归为热敏灸组，其余15只未达到敏化状态则归为艾灸组。若在造模期间大鼠脱毛区长出毛发，则重复除毛。在艾灸治疗的第8天，麻醉后脱颈椎处死各组大鼠，采集大鼠外关穴和背部结缔组织做后续检测。

1.5 主要观察指标

1.5.1 人体太赫兹波探测仪检测银屑病模型大鼠太赫兹信号变化测试环境气温为25 ℃，空气湿度50%-65%，空气无明显流动，周围环境无强噪声和电磁源，在设备连接 PC 端并打开上位机后，将设备天线口X对准大鼠外关穴，天线口与大鼠距离L为1.0-2.0 cm，点击上位机慢速采集，所有大鼠均采集同侧外关穴，各采集3 s，每秒设置采集1 000个数据，取平均值，具体见图1。

1.5.2 大鼠皮下结缔组织的病理学变化取出大鼠背部结缔组织，在40 g/L多聚甲醛溶液中固定48 h后，对筋膜进行常规脱水等操作，制备6 μm切片行苏木精-伊红染色，中性树胶封固保存，显微镜下仔细观察结缔组织变化。

1.5.3 比色法检测皮下筋膜钙离子浓度变化将筋膜组织从液氮罐里拿出，置于冰上，迅速用研磨棒将组织碾成粉末状，然后转移到全新的1.5 mL EP管中，加入500 μL裂解液，振荡30 s，充分混匀，置于冰上孵育30 min，期间每10 min强力涡旋1次，13 000 r/min，4 ℃离心5 min，取上清；按试剂盒说明书稀释比例准备标准品，提前20 min打开分光光度计，设置波长为570 nm，并调零；吸取800 μL缓冲液到全新的1 mL比色皿，再加入100 μL反应液；加入100 μL标准品或待测样品到上述比色皿中，混匀；室温下孵育5 min，放进分光光度计检测，获取吸光度值；绘制标准曲线计算出样品浓度。
1.6 统计学分析采用SPSS 23.0软件分析数据，作图采用origin 2019、prism 9.4软件。数据以x±s表示，多组间数据比较采用方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较用LSD法；方差不齐者用Tamhane’s T2检验，P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经通过江西中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

根据现代热敏灸理论，人体腧穴存在“静息”与“敏化”两种状态；敏化态的腧穴会对外界相关刺激表现出“小刺激大反应”[14]。在人体处于正常生理状态时，人体腧穴的变化反应不明显，称为“常态”；当人体受到外邪侵袭时，腧穴对外部物理刺激时如针刺、艾灸等，腧穴的敏感性会增强，称为“敏态”[15]。敏态腧穴是动态部位，因病情的发展会产生某种程度上的变化，这种位置的变化同样是腧穴敏化性的表现之一。热敏腧穴作为动态部位，又如何确定呢？其发生规律以及特点又是什么呢？早期研究发现艾灸辐射谱具有远红外和近红外辐射[16]，进一步研究发现在整个灸治过程中会产生艾的燃烧物效应[17]、热刺激效应[18]、红外光谱共振效应[19]、艾灸与穴位红外共振辐射的联合效应[20]，艾灸效应作用的发挥最终要通过循经传至病所，在这些循经感传效应中的物质含有太赫兹波[21]，腧穴同样具有太赫兹辐射[22]。
太赫兹波是近年来的新兴技术之一，被广泛运用于各种领域，它对生物分子和水含量的高灵敏度以及生物样品的低电离性使其在生物医学研究和诊断中具有巨大的潜力[23]。研究表明太赫兹电磁辐射可以为疾病治疗提供理论依据[24]，能调节生物活动及神经功能，促进受损伤生物组织如皮肤组织的康复。TITOVA等[25]将人造皮肤组织暴露于强烈的皮秒级太赫兹脉冲，发现太赫兹脉冲能够激活细胞DNA修复机制，并且可以下调银屑病相关基因的表达。QI等[26]用频率为0.14 THz的太赫兹源对小鼠头部进行照射，发现太赫兹波可能会增加小鼠的抗焦虑、抗抑郁和社交互动能力。王美君等[27]发现太赫兹波在增加小鼠红细胞、血红蛋白的含量上有特异性。此外，太赫兹波技术在现代医学检测方面具有巨大优越性，目前在检测病变组织[28-29]、血液[30]、皮肤烧伤等方面均有研究报道[31]。该实验所用的人体太赫兹波探测器是基于人体太赫兹辐射信号检测的人体穴位探测装置。通过精确测量人体皮肤部位的太赫兹波辐射差异，明确人体穴位位置及其活动状态。太赫兹波探测器首先置于低温环境中，以提高太赫兹波探测器的信噪比，同时为了保证探测器在低温下产生的冷凝水短路，探测器置于近似真空的环境中，探测器通电后持续采集工作，采集卡读取探测器输出数据，显示在PC端。
钙离子是机体内一种重要的无机离子，参与并调控机体内的多种生理和生化过程[9]，以及细胞内与细胞间的信号转导。钙离子可以调控骨修复阶段细胞的增殖分化，促进生长因子释放，其浓度的变化能够实现机体内血小板的生物学功能[32]，机体内钙离子稳态失调可能会导致癌症细胞的增殖转移[33]、加速糖尿病诱发心房颤动[34]。研究表明钙离子在表皮呈梯度分布，其浓度在颗粒层最高，在基底细胞层则最低，对于皮肤屏障的稳态以及表皮的分化具有重要作用[35]，功能失调的皮肤屏障可能是许多炎症性皮肤病如银屑病等发生的主要原因或加重因素[36]，同时钙离子减少会导致银屑病角质形成细胞大量涌入，加速角质形成细胞增殖和分化异常[37]。研究表明角质形成细胞在银屑病中具有屏障功能，当其内在生物学信息发生改变时，可能会导致银屑病皮肤发生炎症反应[38]。细胞内外钙离子的浓度差对于细胞功能的发挥具有重要作用，当浓度差变小时，细胞会受到功能性损伤[39]。在正常生理状态下，经络及腧穴处钙离子浓度显著高于非经穴处[40]。陈知水等[41]提出经络可通过细胞内离子的活动传递生物信息，因此针灸等物理刺激可通过促进离子流动来提高治疗效果。在该实验中，艾灸外关穴后，热敏灸组和艾灸组皮下筋膜钙离子浓度增高(P < 0.01)，其中热敏灸组增加更显著，这提示当穴位受到热敏灸刺激时，穴位处的钙离子出现富集，可能参与了灸信号增强活动。
该研究是以银屑病为研究对象，在前期研究中已探讨灸疗对银屑病模型的疗效等相关研究[42-43]，在此基础上，拟进一步探讨热敏灸、钙离子以及太赫兹波如何发挥治疗银屑病的作用。外部太赫兹辐射可以加速钙离子通过离子通道的传输[44]，针刺可以调节钙离子浓度，钙离子又是针刺信号放大传导的关键因素[45]，在该实验中治疗组的太赫兹电压均值总体呈现出先上升后下降的趋势，其中热敏灸组在治疗末期的太赫兹电压均值接近于正常空白组，而艾灸组的太赫兹波电压均值仍高于模型组和空白组(P < 0.01)，由此推测在银屑病模型大鼠治疗过程中灸信号的增强可能影响太赫兹波的变化，进而影响筋膜结缔组织发生形变以及相关生物学信息变化；同时循经的钙离子在艾热作用下出现明显富集可能进一步增强了太赫兹波，干预关键细胞的传导与修复，维持皮肤屏障及胞内稳态，最终抑制表皮过度增生，发挥对银屑病模型大鼠的治疗作用。
实验的局限性：①选取研究的穴位较少；②人为施灸热敏灸的灸量可能存在差异性；③目前仍处于实验动物阶段，银屑病模型大鼠虽尽量接近人体银屑病症状但仍有差异，研究结论可能与临床存在差异，需进一步深入研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

热敏灸银屑病模型大鼠外关穴的生物学变化

Biological changes of Waiguan acupoint in a rat model of psoriasis undergoing heat-sensitive moxibustion

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