线粒体分裂抑制剂1对多发性硬化小鼠神经营养因子、再生抑制信号通路分子的影响

doi:10.12307/2023.474

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (17): 2651-2657.doi: 10.12307/2023.474

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

线粒体分裂抑制剂1对多发性硬化小鼠神经营养因子、再生抑制信号通路分子的影响

张伟1，2，刘子铭2，张年萍2，田思勰2，张思羽2，李艳花2，马存根3

1山西省大同市第五人民医院，大同大学第一临床学院，神经内科，山西省大同市 037009；2山西大同大学，脑科学研究所，山西省大同市 037009；3 山西中医药大学神经生物学研究中心，国家中医药管理局多发性硬化益气活血重点研究室，山西省晋中市 030619

收稿日期:2022-06-14 接受日期:2022-08-15 出版日期:2023-06-18 发布日期:2022-10-21
通讯作者: 李艳花，博士，副教授，山西大同大学，脑科学研究所，山西省大同市 037009 马存根，博士，教授，山西中医药大学神经生物学研究中心，国家中医药管理局多发性硬化益气活血重点研究室，山西省晋中市 030619
作者简介:张伟，男，1977年生，内蒙古自治区卓资县人，汉族，2000年内蒙古包头医学院毕业，硕士，副主任医师，主要从事神经免疫、脑血管病方向的临床及研究工作。刘子铭，女，1998年生，山西省原平市人，汉族，2021年山西医科大学汾阳学院毕业，助理实验师，主要从事生物化学与分子生物学实验课前准备工作以及神经免疫方向的研究。
基金资助:
山西省回国留学人员项目 (HGKY2019089)，项目负责人：李艳花；山西省基础研究面上项目 (20210302123475) ，项目负责人：李艳花

Effects of mitochondrial fission inhibitor-1 on neurotrophic factor and neural inhibitory signaling pathway in a mouse model of multiple sclerosis

Zhang Wei1, 2, Liu Ziming2, Zhang Nianping2, Tian Sixie2, Zhang Siyu2, Li Yanhua2, Ma Cungen3

1Department of Neurology, the Fifth People’s Hospital of Datong, the First Clinical College of Shanxi Datong University, Datong 037009, China; 2Institute of Brain Science, Shanxi Datong University, Datong 037009, China; 3Research Center of Neurobiology, Shanxi University of Chinese Medicine, Key Research Laboratory of Benefiting Qi for Acting Blood Circulation Method to Treat Multiple Sclerosis of National Administration of Traditional Chinese Medicine, Jinzhong 030619, China

Received:2022-06-14 Accepted:2022-08-15 Online:2023-06-18 Published:2022-10-21
Contact: Li Yanhua, MD, Associate professor, Institute of Brain Science, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China Ma Cungen, MD, Professor, Research Center of Neurobiology, Shanxi University of Chinese Medicine, Key Research Laboratory of Benefiting Qi for Acting Blood Circulation Method to Treat Multiple Sclerosis of National Administration of Traditional Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China
About author:Zhang Wei, Master, Associate chief physician, Department of Neurology, the Fifth People’s Hospital of Datong, the First Clinical College of Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China; Institute of Brain Science, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China Liu Ziming, Assistant experimentalist, Institute of Brain Science, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China
Supported by:
Research Project Supported by Shanxi Scholarship Council of China, No. HGKY2019089 (to LYH); Basic Research Program of Shanxi Province, No. 20210302123475 (to LYH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
NogoA信号通路：是近年发现的一个中枢神经轴突生长抑制通路，轴突再生抑制因子与其受体结合，在p75神经营养因子蛋白受体的协同作用下，调节轴突生长抑制信号通路。Rho相关蛋白激酶是抑制性信号的主要效应分子，其过度激活导致肌动蛋白骨架解聚，可诱导生长锥塌陷，抑制轴突延伸和再生。
神经营养因子：神经营养因子家族成员非常广泛，主要有胶质细胞源性神经营养因子、脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、神经生长因子等，已发现神经营养因子表达减少与神经损伤的发生密切相关。

背景：神经营养因子表达减少和再生抑制因子表达增多是神经损伤的主要机制，前期研究显示线粒体分裂抑制剂1(Mdivi-1)能明显降低多发性硬化模型小鼠的临床症状评分和病理学损伤，然而其对神经保护的作用仍需进一步研究。
目的：观察实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型神经元和轴突的状态，评估线粒体分裂抑制剂1的神经保护作用。
方法：C57BL/6小鼠经髓鞘少突胶质细胞糖蛋白第35-55位肽片段(MOG35-55)免疫制备实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型，随机分为模型对照组和线粒体分裂抑制剂1干预组。于免疫后第28天麻醉后处死小鼠，免疫荧光染色分析脊髓组织中神经元胞体和突触的状态、动力相关蛋白1磷酸化水平以及神经营养因子、再生抑制因子及其信号通路分子的表达。
结果与结论：①与模型对照组相比，线粒体分裂抑制剂1干预组小鼠脊髓组织神经元特异性核蛋白标记的神经元数量较多、胞体形态完整，突触素标记的突触明显更长，中分子质量神经丝蛋白缺失率明显较低，动力相关蛋白1磷酸化水平较低；②线粒体分裂抑制剂1干预可明显促进胶质细胞源性神经营养因子、睫状神经营养因子和脑源性神经营养因子的表达；③线粒体分裂抑制剂1干预可明显降低小鼠髓鞘相关糖蛋白、轴突生长抑制因子A、轴突生长抑制因子蛋白受体、p75神经营养因子蛋白受体、Rho相关蛋白激酶Ⅱ的表达量；④提示线粒体分裂抑制剂1能抑制动力相关蛋白1磷酸化水平，提高神经营养因子蛋白的表达水平，降低再生抑制因子及相关信号通路分子蛋白的表达，进而降低脊髓神经元胞体、轴突和囊胞的损伤。

https://orcid.org/0000-0002-0962-0746(张伟)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 实验性自身免疫性脑脊髓炎, 线粒体分裂抑制剂1, 神经保护, 神经营养因子, 再生抑制因子

Abstract: BACKGROUND: Decreased expression of neurotrophic factors and increased expression of regenerating inhibitors are the main mechanisms of nerve injury. It has been proven that mitochondrial fission inhibitor-1 can decrease clinical score and relieve pathological injury in a mouse model of multiple sclerosis. However, its neuroprotective effects still need to be further explored.
OBJECTIVE: To observe the state of neurons and axons in a mouse model of experimental autoimmune encephalomyelitis and to evaluate the neuroprotective effect of mitochondrial fission inhibitor-1.
METHODS: A mouse model of experimental autoimmune encephalomyelitis was prepared in C57BL/6 mice by immunizing with myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide fragment 35-55. Animal models were randomly divided into two groups (n=15 per group): model group and mitochondrial fission inhibitor-1 group. Mice were euthanized and lumbar spinal cord consecutive sections were harvested at day 28 post immunization. Immunofluorescence staining was used to analyze the state of neuronal cell body and synapse, the phosphorylation level of dynamin-related protein 1, and the expression of neurotrophic factor, regeneration inhibitor and its signaling pathway molecules in spinal cord tissue.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, treatment with mitochondrial fission inhibitor-1 increased the number of neurons marked by neuron-specific nuclear protein in the spinal cord tissue, improved neuronal body morphology, increased the length of synaptophysin-positive synapse, decreased the loss of Neurofilament M, and inhibited the phosphorylation of dynamin-related protein 1. Mitochondrial fission inhibitor-1 treatment could significantly promote the expression of glial cell-derived neurotrophic factor, ciliary neurotrophic factor, and brain-derived neurotrophic factor. Mitochondrial fission inhibitor-1 intervention could markedly reduce the expression of myelin-associated glycoprotein, axon growth inhibitory factor A, axon growth inhibitory factor protein receptor, p75 neurotrophin protein receptor, and Rho-related protein kinase II in the mouse model. To conclude, mitochondrial fission inhibitor-1 can inhibit the phosphorylation level of dynamin-related protein 1, increase the expression of neurotrophic factor protein, and reduce the expression of regeneration inhibitor and related signaling pathway molecular proteins, thus alleviating damage to spinal cord neuron cell bodies, axons, and cysts.

Key words: experimental autoimmune encephalomyelitis, mitochondrial fission inhibitor-1, neuroprotection, neurotrophic factors, regeneration inhibitor

中图分类号:

张伟, 刘子铭, 张年萍, 田思勰, 张思羽, 李艳花, 马存根. 线粒体分裂抑制剂1对多发性硬化小鼠神经营养因子、再生抑制信号通路分子的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(17): 2651-2657.

Zhang Wei, Liu Ziming, Zhang Nianping, Tian Sixie, Zhang Siyu, Li Yanhua, Ma Cungen. Effects of mitochondrial fission inhibitor-1 on neurotrophic factor and neural inhibitory signaling pathway in a mouse model of multiple sclerosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(17): 2651-2657.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析实验过程中并未出现动物死亡的情况，因此各组均有15只样本进行统计。
2.2 Mdivi-1对EAE的神经保护作用前期研究显示从免疫后第16天开始，Mdivi-1干预可明显降低EAE临床症状评分，通过调节免疫细胞的极化发挥髓鞘保护作用[10-11]。此次研究利用脊髓冰冻切片神经元特异性核蛋白、中分子质量神经丝蛋白、突触素抗体免疫荧光染色技术显示，MOG35-55可导致明显的神经元胞体、轴突丝和突触的损伤；Mdivi-1干预组有更多的神经元特异性核蛋白标记的神经元，胞体形态较完整，中分子质量神经丝蛋白标记的轴突缺失率明显较低，突触素标记的突触明显更长，提示Mdivi-1明显抑制神经元胞体、轴突丝和突触的损伤(图1)。

2.3 Mdivi-1减少EAE小鼠脊髓组织神经元中动力相关蛋白1磷酸化动力相关蛋白1是Mdivi-1的作用靶点，其616位的丝氨酸过度磷酸化，可以刺激线粒体分裂成碎片，诱导氧化应激，引起细胞死亡[12]。前期研究显示Mdivi-1干预明显降低T细胞、巨噬细胞/小胶质细胞、少突胶质细胞中动力相关蛋白磷酸化水平，通过调节免疫细胞的极化和减少少突胶质细胞死亡 [5-6]。此次研究检测了神经元中动力相关蛋白1的磷酸化状况，如箭头所示，动力相关蛋白1磷酸化水平较高的细胞神经元特异性核蛋白染色较浅，使用激光共聚焦显微镜的colocalization功能，通过两者的共定位图，与Mdivi-1干预组相比，可以直接观察到模型对照组EAE小鼠脊髓组织中神经元特异性核蛋白染色荧光值总体较低，而动力相关蛋白1磷酸化水平较高，统计图显示两组间动力相关蛋白1磷酸化水平差异有显著性意义(P < 0.05)；分析神经元特异性核蛋白与磷酸化动力相关蛋白1的皮尔逊相关系数，发现模型对照组小鼠的皮尔逊相关系数平均值为0.510±0.036，Mdivi-1干预组平均值为0.570±0.027，两组间无明显差异，说明两组神经元中均有一定比例的动力相关蛋白1磷酸化现象(图2)。

2.4 Mdivi-1干预明显上调神经营养因子的表达神经营养因子是维持神经元存活与促进神经生长的重要蛋白分子，对神经损伤后修复有重要作用[13]。此次研究采用免疫荧光染色技术，检测了重要的神经营养因子：胶质细胞源性神经营养因子、睫状神经营养因子、脑源性神经营养因子、神经生长因子和神经营养因子3。结果显示，模型对照组胶质细胞源性神经营养因子、睫状神经营养因子、脑源性神经营养因子、神经生长因子和神经营养因子3的表达量均很低；Mdivi-1干预明显上调了胶质细胞源性神经营养因子、睫状神经营养因子、脑源性神经营养因子的表达，然而对神经生长因子和神经营养因子3的表达量没有明显影响(图3)。

2.5 Mdivi-1干预明显抑制再生抑制因子信号通路分子的表达轴突生长抑制因子、轴突生长抑制因子蛋白受体、Rho相关蛋白激酶是轴突再生抑制信号通路的3个重要枢纽分子[14]，研究显示，阻断轴突生长抑制因子信号通路的激活，能促进中枢神经系统损伤后的神经细胞轴突再生和神经功能恢复[15]。因此，检测了Mdivi-1是否能够抑制再生抑制信号分子及通路蛋白的表达。结果显示，模型对照组再生抑制分子髓鞘相关糖蛋白、轴突生长抑制因子A的表达量较高，再生抑制分子的受体轴突生长抑制因子蛋白受体和p75神经营养因子蛋白受体的表达量也较高，下游效应分子Rho相关蛋白激酶Ⅱ的表达量也较高；Mdivi-1干预明显下调了以上分子的表达水平(图4)。

参考文献

[1] MAKHANI N, TREMLETT H. The multiple sclerosis prodrome. Nat Rev Neurol. 2021;17(8):515-521.
[2] GLATIGNY S, BETTELLI E. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) as Animal Models of Multiple Sclerosis (MS). Cold Spring Harb Perspect Med. 2018;8(11):a028977.
[3] MCGINLEY MP, COHEN JA. Sphingosine 1-phosphate receptor modulators in multiple sclerosis and other conditions. Lancet. 2021; 398(10306):1184-1194.
[4] SUTIWISESAK R, BURNS TC, RODRIGUEZ M, et al. Remyelination therapies for multiple sclerosis: optimizing translation from animal models into clinical trials. Expert Opin Investig Drugs. 2021;30(8): 857-876.
[5] 黎新悦,罗富成.髓鞘可塑性与认知功能的研究进展[J].中国细胞生物学学报,2022,44(6):1202-1210.
[6] 林柳余,杭海伦,张纪红,等.中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病相关抗体及其致病机制的研究进展[J].临床神经病学杂志,2022,35(3): 216-220.
[7] 左玉超. MARK2 通过调节微管相关蛋白介导 Nogo-66 抑制轴突生长[D]. 武汉:华中科技大学,2016.
[8] 王小梅,景会锋.有氧运动和谷氨酰胺对二型糖尿病大鼠氧化应激及相关因子表达的影响[J]. 中国应用生理学杂志,2019,35(2):150-154.
[9] NHU NT, LI Q, LIU Y, et al. Effects of Mdivi-1 on Neural Mitochondrial Dysfunction and Mitochondria-Mediated Apoptosis in Ischemia-Reperfusion Injury After Stroke: A Systematic Review of Preclinical Studies. Front Mol Neurosci. 2021;14:778569.
[10] LI YH, XU F, THOME R, et al. Mdivi-1, a mitochondrial fission inhibitor, modulates T helper cells and suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 2019;16(1):149.
[11] LIU X, ZHANG X, NIU X, et al. Mdivi-1 Modulates Macrophage/Microglial Polarization in Mice with EAE via the Inhibition of the TLR2/4-GSK3β-NF-κB Inflammatory Signaling Axis. Mol Neurobiol. 2022;59(1):1-16.
[12] BORDT EA, CLERC P, ROELOFS BA, et al. The Putative Drp1 Inhibitor mdivi-1 Is a Reversible Mitochondrial Complex I Inhibitor that Modulates Reactive Oxygen Species. Dev Cell. 2017;40(6):583-594.
[13] 项捷. 神经营养因子在神经发育及神经退行性疾病中作用机制研究[D].西安:中国人民解放军空军军医大学,2019.
[14] 何蓉. RhoA/ROCK信号通路在惊厥性脑损伤轴突再生中的作用研究[D].重庆:重庆医科大学,2016.
[15] 黄丹霞,黄赛娥.Nogo-A抑制信号通路在脑缺血后神经再生中的作用及研究进展[J].按摩与康复医学,2015,6(20):12-15.
[16] 宋岩.大鼠脑外伤后抑制Drp1在脑保护和行为学改善中的作用机制研究[D].济南:山东大学,2019.
[17] 李艳花,刘晓琴,牛春红,等.Mdivi-1对cuprizone诱导的脱髓鞘性病变小鼠少突胶质细胞的保护作用[J].中国病理生理杂志,2020, 36(6):1115-1121.
[18] LUO F, HERRUP K, QI X, et al Inhibition of Drp1 hyper-activation is protective in animal models of experimental multiple sclerosis. Exp Neurol. 2017;292:21-34.
[19] ANDERSON MB, DAS S, MILLER KE. Subcellular localization of neuronal nuclei (NeuN) antigen in size and calcitonin gene-related peptide (CGRP) populations of dorsal root ganglion (DRG) neurons during acute peripheral inflammation. Neurosci Lett. 2021;760:135974.
[20] LEE Y, LEE BH, YIP W, et al. Neurofilament Proteins as Prognostic Biomarkers in Neurological Disorders. Curr Pharm Des. 2020;25(43): 4560-4569.
[21] THIEL G. Synapsin I, synapsin II, and synaptophysin: marker proteins of synaptic vesicles. Brain Pathol. 1993;3(1):87-95.
[22] BIDO S, SORIA FN, FAN RZ, et al. Mitochondrial division inhibitor-1 is neuroprotective in the A53T-α-synuclein rat model of Parkinson’s disease. Sci Rep. 2017;7(1):7495.
[23] ZHANG Y, RUI T, LUO C, et al. Mdivi-1 alleviates brain damage and synaptic dysfunction after intracerebral hemorrhage in mice. Exp Brain Res. 2021;239(5):1581-1593.
[24] 师一民,李明,王蕾.神经营养因子在多发性硬化神经再生修复中的作用研究进展[J].医学综述,2016,22(24):4785-4788.
[25] 季晓飞,董惠洁.脑源性神经营养因子基因多态性与散发性多发性硬化的关联研究[J].大连医科大学学报,2012,34(5):481-483.
[26] GAETANI L, SALVADORI N, CHIPI E, et al. Cognitive impairment in multiple sclerosis: lessons from cerebrospinal fluid biomarkers. Neural Regen Res. 2021;16(1):36-42.
[27] NASRNEZHAD R, HALALKHOR S, SADEGHI F, et al. Piperine Improves Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in Lewis Rats Through its Neuroprotective, Anti-inflammatory, and Antioxidant Effects. Mol Neurobiol. 2021;58(11):5473-5493.
[28] BRAUN D, MADRIGAL JL, FEINSTEIN DL. Noradrenergic regulation of glial activation: molecular mechanisms and therapeutic implications. Curr Neuropharmacol. 2014;12(4):342-352.
[29] LEE JY, KIM MJ, THOMAS S, et al. Limiting Neuronal Nogo Receptor 1 Signaling during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Preserves Axonal Transport and Abrogates Inflammatory Demyelination. J Neurosci. 2019;39(28):5562-5580.

[30] THEOTOKIS P, GRIGORIADIS N. p75NTR and TROY: Uncharted Roles of Nogo Receptor Complex in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Mol Neurobiol. 2018;55(8):6329-6336.
[31] KAN QC, ZHANG HJ, ZHANG Y, et al. Matrine Treatment Blocks NogoA-Induced Neural Inhibitory Signaling Pathway in Ongoing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Mol Neurobiol. 2017;54(10):8404-8418.
[32] MAVADDATIYAN L, KHEZRI S, ABTAHI FROUSHANI SM. Molecular effects of curcumin on the experimental autoimmune encephalomyelitis. Vet Res Forum. 2021;12(1):47-52.
[33] CHANG HM, WU HC, SUN ZG, et al. Neurotrophins and glial cell line-derived neurotrophic factor in the ovary: physiological and pathophysiological implications. Hum Reprod Update. 2019;25(2): 224-242.
[34] LI-NA Z, DENG C, DA X, et al. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor and its role in nervous system disease. Neurol Sci. 2017;38(10):1741-1746.
[35] ROSICH K, HANNA BF, IBRAHIM RK, et al. The Effects of Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor after Spinal Cord Injury. J Neurotrauma. 2017;34(24):3311-3325.
[36] LIU H, TANG X, GONG L. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor and cerebral dopamine neurotrophic factor: New endoplasmic reticulum stress response proteins. Eur J Pharmacol. 2015;750:118-122.
[37] CASTRÉN E, RANTAMÄKI T. Role of brain-derived neurotrophic factor in the aetiology of depression: implications for pharmacological treatment. CNS Drugs. 2010;24(1):1-7.
[38] EREMIN DV, ILCHIBAEVA TV, TSYBKO AS. Cerebral Dopamine Neurotrophic Factor (CDNF): Structure, Functions, and Therapeutic Potential. Biochemistry (Mosc). 2021;86(7):852-866.
[39] THOENEN H, ZAFRA F, HENGERER B, et al. The synthesis of nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor in hippocampal and cortical neurons is regulated by specific transmitter systems. Ann N Y Acad Sci. 1991;640:86-90.
[40] ALBERT K, AIRAVAARA M. Neuroprotective and reparative effects of endoplasmic reticulum luminal proteins - mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor and cerebral dopamine neurotrophic factor. Croat Med J. 2019;60(2):99-108.

引言

多发性硬化是一种中枢神经系统损伤性疾病，伴有髓鞘丢失、轴突断裂、神经残疾等病理学变化[1]。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是使用最广泛的多发性硬化动物模型，与多发性硬化有相似的病理过程[2]。多数科学家围绕其免疫失调和髓鞘丢失的病理学特征开展研究，发现了较多的具有免疫调节和髓鞘保护作用的化合物[3-4]。髓鞘作为神经元轴突的包裹物，对神经元起营养支持和帮助完成快速电传导的功能[5]。髓鞘的丢失引发神经元轴突的脱落和神经元的死亡，最终导致神经残疾[6]。科学家发现在成年哺乳动物中，由于病损区缺乏促进神经再生的营养因子和再生抑制因子的抑制作用导致中枢神经系统损伤后恢复困难，改善中枢神经系统微环境可以增加中枢神经系统神经潜在的可塑性[7-8]。线粒体分裂抑制剂1
(mitochondrial fission inhibitor-1，Mdivi-1)是一种喹唑酮衍生物，分子质量小，能透过血脑屏障进入中枢神经系统发挥作用[9]。前期研究显示Mdivi-1能明显降低EAE临床症状评分，减少髓鞘丢失，对T细胞和巨噬细胞/小胶质细胞具有明显的免疫调节作用，增加其抗炎性，抑制其炎性，从而减轻病症[10-11]。但Mdivi-1是否对神经再生的蛋白分子有作用，报道较少。此次研究继续以小鼠EAE模型作为研究多发性硬化的动物模型，通过观察神经元和轴突的状态，评估Mdivi-1的神经保护作用，分析神经元动力相关蛋白1磷酸化水平、神经营养因子和轴突再生抑制因子及其信号通路分子的表达，评估Mdivi-1神经保护作用的机制，旨在为探索神经损伤的临床治疗方案提供依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1   设计   随机对照动物实验，组间数据比较使用韦尔奇校正的非配对t检验。
1.2   时间及地点   实验于2020-2021年在山西大同大学脑科学研究中心完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   从北京维通利华动物有限公司购买健康雌性C57BL/6小鼠30只，8周龄，体质量18-22 g，使用许可证号：SYXK(晋)2018-0002，生产许可证号：SCXK(京)2019-0008。实验动物的饲养和处理均符合山西大同大学关于最少动物使用量、最少痛苦、善待动物的伦理道德原则，并获伦理委员会批准，使用后动物的遗体统一交付山西大同大学动物实验中心处理。
1.3.2   主要试剂   髓鞘少突胶质细胞糖蛋白第35-55位肽片段(myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide fragment 35-55，MOG35-55，Genscript，美国)，弗氏完全佐剂(Sigma，美国)，百日咳毒素(Enzo Life Sciences，美国)，包埋剂(樱花，日本)，抗中分子质量神经丝蛋白抗体(Gene Tex，美国)，抗轴突生长抑制因子A抗体、抗p75神经营养因子蛋白受体抗体(Cell Signaling，美国)，抗神经元特异性核蛋白抗体、抗突触素抗体、抗脑源性神经营养因子抗体、抗胶质细胞源性神经营养因子抗体、抗神经生长因子抗体、抗睫状神经营养因子抗体、抗神经营养因子3抗体、抗髓鞘相关糖蛋白抗体、抗轴突生长抑制因子蛋白受体抗体、抗Rho相关蛋白激酶Ⅱ抗体、磷酸化动力相关蛋白1抗体(Abcam，美国)，荧光素(Alexa Fluor® 488和Alexa Fluor® 594)标记的二抗(Jackson ImmunoResearch，美国)，DAPI(Solarbio，中国)。
1.4   方法
1.4.1   模型制备及动物分组   所有小鼠后颈部皮下注射0.2 mL MOG35-55乳剂(含MOG35-55 300 μg、弗氏完全佐剂100 μL、灭活的结核分枝杆菌400 μg、生理盐水100 μL)。小鼠按随机数字表法被完全随机分为2组，每组15只。免疫后第3天起持续进行如下处理：①模型对照组：腹腔给予0.1%二甲基亚砜水溶液；②Mdivi-1干预组：腹腔给予Mdivi-1(25 mg/kg，溶解于0.1%二甲基亚砜水溶液)。每天给药1次，至第28天麻醉处死。

1.4.2   标本采集   于免疫后第28天，腹腔注射80 mg/kg氯胺酮+5 mg/kg甲苯噻嗪麻醉后，断颈处死。经心脏依次灌注生理盐水40 mL和40 g/L的多聚甲醛40 mL，取脊柱，去除椎骨，获得完整的脊髓组织，经20 g/L多聚甲醛室温固定4 h，于蔗糖溶液中梯度脱水各4 h，OCT充分浸润包埋，使用液氮快速冷冻。冷冻切片机切片，厚度为10 μm，将两组的所有样本切片依次粘贴于同一张载玻片上，干燥后，-80 ℃冰箱保存备用。
1.4.3   免疫荧光染色    冰冻切片经室温晾干后，PBS浸洗，用含1%BSA的PBS封闭，加入抗神经元特异性核蛋白抗体、抗磷酸化动力相关蛋白1(ser616)抗体、抗突触素抗体、抗中分子质量神经丝蛋白抗体，抗脑源性神经营养因子抗体、抗胶质细胞源性神经营养因子抗体、抗神经生长因子抗体、抗睫状神经营养因子抗体、抗神经营养因子3抗体、抗髓鞘相关糖蛋白抗体、抗轴突生长抑制因子A抗体、抗轴突生长抑制因子蛋白受体抗体、抗p75神经营养因子蛋白受体抗体、抗Rho相关蛋白激酶Ⅱ抗体(用含有0.3% Triton X-100和1%BSA的PBS稀释)(比例1∶1 000)，冰箱冷藏室孵育过夜。次日PBS洗3次，加入荧光素(Alexa Fluor® 488和Alexa Fluor® 594)标记的二抗(比例1∶1 000)，室温孵育1.5 h，加入1 μg/mL DAPI染细胞核，PBS浸洗3次，50%甘油封固，激光共聚焦显微镜采集荧光图片，Image-Pro Plus 6.0软件的Area(polygon)工具测定荧光抗体标记面积和Measure distance工具测量轴突长度，使用FV1200软件的colocalization分析神经元内动力相关蛋白1的磷酸化水平。
1.5   主要观察指标   免疫后28 d，安乐死所有小鼠，脊髓组织切片经免疫荧光法染色，检测神经元相关蛋白标志物、动力相关蛋白1磷酸化水平、神经营养因子和再生抑制因子的表达。
1.6   统计学分析   使用Graphpad Prism 5软件对数据进行分析，两组数据均采用x±s表示，组间数据比较使用韦尔奇校正的非配对t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经山西大同大学统计学专家审核。

讨论

大脑是一个高耗能器官，因此需要较多的线粒体来为大脑供能，Mdivi-1是一种线粒体分裂抑制剂，动力相关蛋白1是其作用靶点，Mdivi-1通过抑制动力相关蛋白1第616位丝氨酸的过度磷酸化，从而抑制线粒体过度分裂导致的线粒体碎片化，保证线粒体功能的完整性[16]，保证大脑供能。作者所在课题组前期研究发现，在EAE模型中，T细胞和巨噬细胞/小胶质细胞中有明显的动力相关蛋白1过度磷酸化[10-11]；
在Cuprizone脱髓鞘模型中，少突胶质细胞中有明显的动力相关蛋白1过度磷酸化[17]，Mdivi-1处理明显抑制以上细胞的动力相关蛋白1磷酸化，发挥调节免疫细胞极化和抑制少突胶质细胞死亡的作用[10-11，17]。2017年LUO等[18]首次开展了EAE和Cuprizone模型中动力相关蛋白1磷酸化的研究，作者发现在2种模型中动力相关蛋白1的磷酸化水平明显高于正常对照组，在EAE模型中动力相关蛋白1磷酸化出现在少突胶质细胞、神经元和小胶质细胞，使用动力相关蛋白1抑制剂P110处理EAE小鼠，能明显降低EAE临床症状评分，减少动力相关蛋白易位至少突胶质细胞的线粒体，减少髓鞘丢失，减少小胶质细胞和星形胶质细胞的数量，作者报道了P110的良好治疗效果，但是没有展示P110治疗EAE小鼠动力相关蛋白1的磷酸化水平。此次研究发现EAE小鼠脊髓灰质中仅残留较少的神经元，有较明显的动力相关蛋白1的磷酸化现象，这与LUO等[18]的研究结果一致。此次研究还发现在Mdivi-1处理组中神经元数量较多，但也有部分神经元有动力相关蛋白1的磷酸化，但动力相关蛋白1磷酸化水平明显低于二甲基亚砜模型对照组。另外，研究结果也显示Mdivi-1能明显增加EAE小鼠脊髓组织中神经元特异性核蛋白、中分子质量神经丝蛋白、突触素蛋白含量[19-21]。BIDO等[22]发现Mdivi-1能明显阻止帕金森模型大鼠黑质多巴胺能神经元和纹状体多巴胺能纤维密度的减少。ZHANG等[23]研究显示，Mdivi-1能阻止缺血再灌注引起的突触相关蛋白突触素Ⅰ、突触后致密蛋白95的表达量减少。此次研究和他人的研究均提示Mdivi-1通过抑制动力相关蛋白1过度磷酸化发挥神经保护作用。
自20世纪50年代以来，相继发现了分别属于多种蛋白家族的营养因子，它们支持神经元的存活和生长，并且在神经受损后神经元再生、维持突触结构及可塑性中发挥重要作用。目前发现的神经营养因子主要包括脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子、睫状神经营养因子、神经生长因子、神经营养因子3和神经营养因子4。越来越多的证据表明，这些营养因子的降低与神经损伤相关。在临床多发性硬化患者研究中，发现多发性硬化患者的扩展残疾状况量表评分与其神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子3表达水平下降呈正相关[24-26]。相应地，提升神经营养因子的表达可以减轻神经损伤。胡椒碱是一类生物碱，是黑胡椒的主要活性物质，NASRNEZHAD等[27]2021年发现，胡椒碱能增加脑源性神经营养因子的表达，抑制细胞凋亡，对EAE有明显的治疗作用。在体内，去甲肾上腺素通过星形胶质细胞的α1-、α2-和β-肾上腺素受体，促进星形胶质细胞分泌脑源性神经营养因子、神经生长因子、神经营养因子3、胶质细胞源性神经营养因子、睫状神经营养因子、神经营养因子、成纤维细胞生长因子2和神经营养因子4/5，发挥明显的神经保护作用，相关信号通路抑制剂可通过阻断营养因子的表达，阻断神经保护作用，该通路在多种疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病和代谢综合征的发生发展中均发挥作用[28]。
此文也发现Mdivi-1可以明显促进胶质细胞源性神经营养因子、脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子的表达，然而对神经生长因子和神经营养因子3的表达没有影响，从免疫荧光图分析胶质细胞源性神经营养因子和睫状神经营养因子表达的细胞类型，可以看出这两种营养因子可能表达在胶质细胞中，推断Mdivi-1可能有激活胶质细胞营养神经的作用；而脑源性神经营养因子所标记的细胞形态接近圆形，分布在脊髓灰质部位，脊髓灰质部位是神经元胞体分布的区域，推断脑源性神经营养因子可能表达在神经元中，脑源性神经营养因子可能在Mdivi-1发挥神经保护作用中起直接作用；以上推论仍需通过免疫荧光双染技术进一步证明。目前仍缺乏Mdivi-1对神经营养因子表达影响的研究，至于为什么Mdivi-1不影响神经生长因子和神经营养因子3的表达还有待进一步研究。
20年前，科学家们发现了神经轴突生长抑制分子及其信号通路，轴突生长抑制因子A、髓鞘相关糖蛋白、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白是主要的轴突生长抑制分子，轴突生长抑制因子蛋白受体、p75神经营养因子蛋白受体、富含亮氨酸重复和免疫球蛋白样结构域的蛋白质1等在细胞膜上组装成轴突生长抑制因子受体复合物，轴突生长抑制分子与膜表面轴突生长抑制因子蛋白受体结合，将抑制信号下行至Rho GTP，激活Rho相关蛋白激酶通路，Rho相关蛋白激酶的激活可以调控微丝的解聚、增加肌球蛋白收缩，促进微管解聚，诱导轴突生长锥塌陷，抑制轴突再生[14]。有研究显示抗轴突生长抑制因子A抗体、Rho相关蛋白激酶抑制剂、抗轴突生长抑制因子蛋白受体抗体或使用它们的siRNAs均可解除轴突抑制信号的抑制作用，提高神经元可塑性，改善神经功能障碍[29]。轴突生长抑制因子A抗体(ozanezumab)首先被用来治疗肌萎缩侧索硬化，但最近已被叫停，富含亮氨酸重复和免疫球蛋白样结构域的蛋白质1抗体已用于多发性硬化临床试验[30]。另外，有一些化合物也能通过抑制该信号通发挥神经保护作用，如苦参素能明显抑制小鼠脑组织中轴突生长抑制因子A、轴突生长抑制因子蛋白受体、p75神经营养因子蛋白受体、富含亮氨酸重复和免疫球蛋白样结构域的蛋白质1、
RhoA/Rho相关蛋白激酶的表达，减轻EAE的髓鞘丢失[31]。姜黄素也能减少轴突生长抑制因子A的表达，减少髓鞘丢失[32]。
环磷腺苷效应元件结合蛋白磷酸化减少能促进Rho/Rho相关蛋白激酶信号通路激活，从而引起轴突损伤，有研究显示Mdivi-1能增加环磷腺苷效应元件结合蛋白磷酸化，进而抑制Rho/Rho相关蛋白激酶信号通路的激活，促进突触生长。作者也发现Mdivi-1处理明显抑制了Rho相关蛋白激酶Ⅱ的表达，这些与前人的研究结果相似。髓鞘相关糖蛋白、轴突生长抑制因子、轴突生长抑制因子蛋白受体、p75神经营养因子蛋白受体、Rho相关蛋白激酶是轴突再生抑制信号通路的重要分子，此次研究发现Mdivi-1能明显抑制以上分子的表达，这些结果一致说明Mdivi-1发挥神经保护作用与抑制轴突再生抑制信号通路相关。
既往研究认为增加神经营养因子表达和抑制轴突再生抑制因子的表达与神经损伤修复密切相关，因此，对神经营养因子和轴突再生因子表达有调节作用的干预方式对防治代谢综合征有积极意义[33-40]。此文发现Mdivi-1干预具有明显的神经保护作用，能明显降低动力相关蛋白1磷酸化水平，明显促进胶质细胞源性神经营养因子、脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子的表达，能明显抑制髓鞘相关糖蛋白、轴突生长抑制因子、轴突生长抑制因子蛋白受体、p75神经营养因子蛋白受体、Rho相关蛋白激酶Ⅱ的表达，说明Mdivi-1有可能成为靶向神经保护作用的药物，但Mdivi-1预处理通过何种分子机制调节神经营养因子和轴突再生抑制因子水平的变化、通过调节动力相关蛋白1磷酸化水平对EAE小鼠氧化应激的影响还有待进一步研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

线粒体分裂抑制剂1对多发性硬化小鼠神经营养因子、再生抑制信号通路分子的影响

Effects of mitochondrial fission inhibitor-1 on neurotrophic factor and neural inhibitory signaling pathway in a mouse model of multiple sclerosis

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[1]	税晓平, 李春莹, 李明娟, 李顺昌, 孙君志, 苏全生. 有氧和抗阻运动干预2型糖尿病模型大鼠海马抗氧化应激指标和脑源性神经营养因子表达的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 264-269.
[2]	彭子富, 郭项英, 房洪波, 何亦敏, 姜宁. 运动干预调控胰岛素样生长因子1改善海马认知功能的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(17): 2729-2737.
[3]	张春丽, 刘景晨, 周文杰, 俞永珍, 汤翠翠, 邹秀兰, 邹玉平. 干细胞对视网膜神经节细胞再生的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(10): 1593-1602.
[4]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[5]	税晓平, 李春莹, 李顺昌, 孙君志, 苏全生. 有氧和抗阻运动干预2型糖尿病大鼠骨骼肌脑源性神经营养因子、核因子κB及炎症指标的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 669-675.
[6]	唐纪平, 张业廷. 运动调节阿尔茨海默症成年海马神经发生的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 798-803.
[7]	黄传俊, 邹煜, 周晓婷, 朱扬清, 钱伟, 张卫, 刘星. 携带脐带间充质干细胞的RADA16-BDNF水凝胶支架定向移植促进脑出血大鼠神经功能恢复[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 510-515.
[8]	杨椅, 王坤, 刘恒旭, 张庭然, 卢文云, 陈佩杰, 罗炯. 有氧运动对老年轻度认知障碍患者认知功能的改善[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(29): 4716-4722.
[9]	曾春蓉, 刘梦兰, 谢阳, 李作孝. 柚皮苷调控小胶质细胞极化防治实验性自身免疫性脑脊髓炎[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(26): 4127-4135.
[10]	阳金鑫, 王坤, 赵静, 陈佩杰, 张庭然, 卢文云, 罗炯. 有氧运动干预对阿尔茨海默患者突触可塑性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(26): 4216-4223.
[11]	许雯珊, 江萍利, 刘雨露, 丁妍怡, 余燕, 杨敏光, 柳维林, 陈立典. 丹酚酸A对缺血性脑卒中模型大鼠海马区蛋白影响的串联质谱标签蛋白组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3714-3720.
[12]	姚奇鹏, 廖敏. 电针干预对缺血再灌注模型大鼠的神经保护与神经调节蛋白1/表皮生长因子受体4信号通路的关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3664-3669.
[13]	魏文悦, 王玉银, 郭敏芳, 张婧, 谷青芳, 宋丽娟, 柴智, 尉杰忠, 马存根. 法舒地尔抑制APP/PS1小鼠神经元凋亡的线粒体动力学作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 232-238.
[14]	龚超, 智晓东, 张玉强, 王晨亮, 王康, 王伟. 睫状神经营养因子复合毛喉素及3-异丁基-1-甲基黄嘌呤通过环磷酸腺苷信号通路诱导肌源性干细胞分化为许旺细胞表型[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(19): 2970-2977.
[15]	李传鸿, 俞兴, 杨永栋, 赵赫. 脊髓损伤中的小胶质细胞：M1/M2表型极化发挥神经毒性/神经保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(14): 2265-2272.