高迁移率族蛋白B1对体外氧糖剥夺/复氧复糖后大鼠脊髓反应性星形胶质细胞不同亚型的作用

doi:10.12307/2023.194

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (24): 3831-3837.doi: 10.12307/2023.194

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

高迁移率族蛋白B1对体外氧糖剥夺/复氧复糖后大鼠脊髓反应性星形胶质细胞不同亚型的作用

王丽平1，李季声2，邓黎2，王志强2，刘晋明1，邓晨2，孙麟2

1山西医科大学基础医学院，山西省太原市 030001；2山西医科大学第三医院(山西白求恩医院，山西医学科学院，同济山西医院)骨科，山西省太原市 030032

收稿日期:2022-04-01 接受日期:2022-06-06 出版日期:2023-08-28 发布日期:2023-01-19
通讯作者: 孙麟，博士，主任医师，山西医科大学第三医院(山西白求恩医院，山西医学科学院，同济山西医院)骨科，山西省太原市 030032
作者简介:王丽平，女，1994年生，山西省忻州市人，汉族，山西医科大学在读硕士，主要从事脊柱脊髓损伤与疾病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81870976)，项目负责人：孙麟；山西省医学重点项目(2020XM27)，项目负责人：孙麟

Effects of high-mobility group box 1 on different subtypes of rat spinal reactive astrocytes after oxygen-glucose deprivation/restoration in vitro

Wang Liping1, Li Jisheng2, Deng Li2, Wang Zhiqiang2, Liu Jinming1, Deng Chen2, Sun Lin2

1College of Basic Medicine, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; 2Department of Orthopedics, Third Hospital of Shanxi Medical University (Shanxi Bethune Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Tongji Shanxi Hospital), Taiyuan 030032, Shanxi Province, China

Received:2022-04-01 Accepted:2022-06-06 Online:2023-08-28 Published:2023-01-19
Contact: Sun Lin, MD, Chief physician, Department of Orthopedics, Third Hospital of Shanxi Medical University (Shanxi Bethune Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Tongji Shanxi Hospital), Taiyuan 030032, Shanxi Province, China
About author:Wang Liping, Master candidate, College of Basic Medicine, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 81870976 (to SL); Key Medical Project of Shanxi Province, No. 2020XM27 (to SL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

反应性星形胶质细胞：是中枢神经系统损伤、疾病或感染后发生形态、分子和功能重构的星形胶质细胞。A1型反应性星形胶质细胞可以分泌神经毒素，对神经元、少突胶质细胞有害并导致死亡；A2型反应性星形胶质细胞有益并提高神经元活力和促进神经再生。
高迁移率族蛋白B1：是一种在所有有核细胞中广泛表达的DNA结合蛋白，在生理条件下稳定染色质结构，控制转录和DNA修复。当从坏死细胞被动释放时，它可以作为一种强大的炎症递质。

背景：脊髓损伤后星形胶质细胞可以活化为A1、A2两种不同亚型的反应性星形胶质细胞，其在基因、分子和功能方面完全不同，对脊髓损伤修复的具体作用也不同。已经证明高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1，HMGB1)是脊髓损伤后的重要炎症、免疫因子，可以引起细胞水肿、炎症反应及细胞凋亡等，但其对A1、A2两种反应性星形胶质细胞的影响尚不清楚。
目的：观察大鼠脊髓星形胶质细胞经氧糖剥夺/复氧复糖(oxygen-glucose deprivation/restoration，OGD/R)后激活为反应性星形胶质细胞的情况，探索损伤后产生的HMGB1对反应性星形胶质细胞不同亚型的影响及作用机制。
方法：培养大鼠脊髓星形胶质细胞至第3代，经过OGD/R处理后观察细胞的形态变化，划痕实验检测细胞的迁移能力，Western blot检测反应性星形胶质细胞的激活情况。抑制HMGB1 表达后分为5组：正常组、OGD6 h/R6 h组、HMGB1干扰组、阴性序列组、OGD6 h/R6 h+
12 μmol/L HMGB1抑制剂丙酮酸乙酯组，Western blot和细胞免疫荧光法检测反应性星形胶质细胞不同亚型特征性蛋白C3、S100A10的表达，划痕实验检测细胞的迁移能力。为探究HMGB1对反应性星形胶质细胞影响的可能机制，分为正常组、OGD6 h/R6 h组、OGD6 h/R6 h+5 µmol/L TLR4抑制剂CLI-095组、OGD6 h/R6 h+5 µmol/L NF-κB抑制剂BAY 11-7082组，Western blot检测TLR4、NF-κB、C3和S100A10的表达。

结果与结论：①氧糖剥夺后细胞体积减小，边缘皱缩，迁移能力增加，复氧复糖后，细胞体积增大，活化为A1、A2型反应性星形胶质细胞，OGD6 h/R6 h时S100A10表达最多，OGD6 h/R12 h时C3表达最多(P < 0.05)；②沉默或抑制HMGB1的表达对反应性星形胶质细胞的影响：与OGD6 h/R6 h组相比，抑制HMGB1使C3表达减少(P < 0.05)，S100A10表达增多(P < 0.05)，细胞的迁移能力增强；③与OGD6 h/R6 h组相比，OGD6 h/R6 h+CLI 095组TLR4表达减少(P < 0.05)，OGD6 h/R6 h+CLI 095组和OGD6 h/R6 h+BAY 11-7082组NF-κB表达减少，C3表达减少，S100A10表达增多(P < 0.05)；④结果表明，星形胶质细胞在OGD/R后可以活化为2种不同亚型的反应性星形胶质细胞，抑制HMGB1表达可以减少A1型反应性星形胶质细胞，增多A2型反应性星形胶质细胞，细胞迁移能力增加，主要是通过TLR4/NF-κB通路产生影响。

https://orcid.org/0000-0002-0305-1108(王丽平)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 脊髓损伤, 星形胶质细胞, 氧糖剥夺, 复氧复糖, 高迁移率族蛋白B1, A1型反应性星形胶质细胞, A2型反应性星形胶质细胞, toll样受体4, 核转录因子κB

Abstract: BACKGROUND: Astrocytes can be activated into A1 and A2 subtypes of reactive astrocytes, which are completely different in gene, molecule and function, and have different specific roles in spinal cord injury repair. High-mobility group box 1 (HMGB1) has been proven to be an important inflammatory and immune factor after spinal cord injury, which can cause cell edema, inflammatory reaction and apoptosis; however, its effect on reactive astrocytes remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the activation of rat spinal cord astrocytes into reactive astrocytes after oxygen-glucose deprivation/restoration (OGD/R) and to explore the effect of HMGB1 on different subtypes of reactive astrocytes and the relevant mechanism.
METHODS: Rat spinal cord astrocytes were cultured to the third generation. Cell morphology was observed after OGD/R treatment, activation of reactive astrocytes was detected by western blot assay, and migration ability of the cells was detected by cell scratch assay. After inhibition of HMGB1, the cells were divided into five groups: normal group, OGD6 h/R6 h group, HMGB1 interference group, negative sequence group, and OGD6 h/R6 h+12 μmol/L ethyl pyruvate group (an HMGB1 inhibitor). Western blot assay and immunofluorescence method were used to detect the expression of C3 and S100A10 in different subtypes of reactive astrocytes, and cell scratch assay was used to detect the migration of reactive astrocytes. To explore the possible mechanism underlying the effect of HMGB1 on reactive astrocytes, the cells were divided into four groups: normal group, OGD6 h/R6 h group, OGD6 h/R6 h+5 µmol/L CLI-095 group (a toll-like receptor 4 inhibitor), and OGD6 h/R6 h+5 µmol/L BAY 11-7082 group (a nuclear factor-κB inhibitor). Western blot assay was used to detect the expression of toll-like receptor 4, nuclear factor-B, C3, and S100A10.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Oxygen-glucose deprived cells were shrunk in size and had an increased migration capacity. After reoxygen-glucose treatment, the cell volume was increased and A1 and A2 reactive astrocytes were activated. S100A10 expression was the highest at OGD6 h/R6 h and C3 expression was peaked at OGD6 h/R12 h (P < 0.05). (2) Effects of silencing or inhibition of HMGB1 expression on reactive astrocytes: Compared with the OGD6 h/R6 h group, inhibition of HMGB1 significantly reduced the expression of C3 (P < 0.05), increased the expression of S100A10 (P < 0.05), and enhanced cell migration ability. (3) Compared with the OGD6 h/R6 h group, the expression of toll-like receptor 4 decreased in the OGD6 h/R6 h+CLI 095 group (P < 0.05), while the expression of nuclear factor-κB and C3 decreased and the expression of S100A10 increased in the OGD6 h/R6 h+CLI 095 group and OGD6 h/R6 h+BAY 11-7082 group (P < 0.05). (4) To conclude, astrocytes can be activated into two different subtypes of reactive astrocytes after OGD/R. Inhibition of HMGB1 can reduce A1 reactive astrocytes, increase A2 reactive astrocytes, and enhance cell migration ability through the toll-like receptor 4/nuclear factor-κB pathway.

Key words: spinal cord injury, astrocyte, oxygen-glucose deprivation, oxygen-glucose restoration, high-mobility group box 1, A1 reactive astrocyte, , A2 reactive astrocyte, , toll-like receptor 4, nuclear factor-κB

中图分类号:

王丽平, 李季声, 邓黎, 王志强, 刘晋明, 邓晨, 孙麟. 高迁移率族蛋白B1对体外氧糖剥夺/复氧复糖后大鼠脊髓反应性星形胶质细胞不同亚型的作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(24): 3831-3837.

Wang Liping, Li Jisheng, Deng Li, Wang Zhiqiang, Liu Jinming, Deng Chen, Sun Lin. Effects of high-mobility group box 1 on different subtypes of rat spinal reactive astrocytes after oxygen-glucose deprivation/restoration in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(24): 3831-3837.

图/表（结果） 7

2.1 星形胶质细胞的形态及其纯度鉴定结果原代星形胶质细胞含有较多死亡细胞和一些其他细胞，随着换液和培养时间的增加，第3代细胞镜下可见生长状态良好，细胞呈不规则状。免疫荧光染色结果显示：S100β染细胞质呈绿色强荧光，DAPI染细胞核呈蓝色，细胞计数显示S100β染色阳性的细胞数> 95%，说明星形胶质细胞可用于实验研究，见图1。

2.2 OGD/R损伤后星形胶质细胞活化为反应性星形胶质细胞光镜下和细胞免疫荧光染色观察显示星形胶质细胞体积增大，划痕实验显示星形胶质细胞向损伤中心迁移，与对照组相比，氧糖剥夺后细胞的迁移能力增强，表明星形胶质细胞在损伤后成为一种更为活跃的状态，细胞的迁移能力增强，见图2。Western blot结果表明，OGD6 h/R6 h开始C3和S100A10表达增多，C3在OGD6 h/R12 h表达最多(P < 0.05)，而S100A10在OGD6 h/R6 h表达最多(P < 0.05)，表明星形胶质细胞在损伤早期活化为A2型反应性星形胶质细胞，在损伤后期活化为A1型反应性星形胶质细胞，见图3。为了使A2型反应性星形胶质细胞在整体的丰度增加，选择A2型反应性星形胶质细胞最多的时间点OGD6 h/R6 h作为后续实验的模型组。

2.3 HMGB1对反应性星形胶质细胞的影响以往研究已经证明OGD6 h/R2 h即可产生HMGB1，随着复氧复糖时间的增加HMGB1逐渐增多[14]。为了研究HMGB1对反应性星形胶质细胞的影响，实验选取慢病毒转染沉默HMGB1表达后进行OGD6 h/R6 h，以及氧糖剥夺6 h后加入丙酮酸乙酯继续复氧复糖6 h抑制HMGB1的表达，Western blot结果显示HMGB1干扰组及丙酮酸乙酯组的C3表达低于OGD6 h/R6 h组(P < 0.05)，S100A10表达高于OGD6 h/R6 h组(P < 0.05)，见图4。C3和S100A10在细胞质表达，DAPI染细胞核呈蓝色。细胞免疫荧光结果显示，与OGD6 h/R6 h组相比，HMGB1干扰组及丙酮酸乙酯组的C3平均荧光强度明显减弱(P < 0.05)，S100A10平均荧光强度明显增强(P < 0.05)，见图5。结果表明抑制HMGB1后A1型反应性星形胶质细胞减少，A2型反应性星形胶质细胞增多。

2.4 HMGB1对细胞迁移的影响细胞划痕实验结果表明，与对照组相比，OGD6 h/R6 h组向损伤中心迁移的细胞增多，与OGD6 h/R6 h组相比，HMGB1干扰组和丙酮酸乙酯组向损伤中心迁移的细胞增多，见图6。结果表明抑制HMGB1后细胞的迁移能力增强。

2.5 HMGB1对反应性星形胶质细胞影响的机制为探究HMGB1对反应性星形胶质细胞影响的机制，氧糖剥夺6 h后加入CLI-095(TLR4抑制剂)和BAY 11-7082(NF-κB抑制剂)再复氧复糖6 h，Western blot结果显示与OGD6 h/R6 h组相比，CLI-095组TLR4表达减少(P < 0.05)，CLI-095组和BAY 11-7082组NF-κB表达减少(P < 0.05)，CLI-095组和BAY 11-7082组C3表达减少(P < 0.05)，S100A10表达增多(P < 0.05)，见图7。结果说明CLI-095可以有效抑制TLR4的表达，BAY 11-7082可以有效抑制NF-κB的表达，抑制TLR4可以降低NF-κB的表达，抑制TLR4和NF-κB可以使C3表达减少，S100A10表达增多。结果表明HMGB1可以与TLR4受体结合进一步激活NF-κB减少A1型反应性星形胶质细胞，增多A2型反应性星形胶质细胞。

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引言

脊髓损伤是指暴力的外部物理冲击脊髓所引起的损伤，常导致患者终身残疾，给患者、家庭、社会带来巨大的经济负担和严重的精神压力[1-4]。脊髓损伤后星形胶质细胞会处于一种激活的状态，变为反应性星形胶质细胞[5]。反应性星形胶质细胞是中枢神经系统损伤、疾病或感染后发生形态、分子和功能重构的星形胶质细胞[6]。A1型反应性星形胶质细胞的特征性蛋白是C3[7]，C3阳性的A1型反应性星形胶质细胞可以分泌神经毒素因子，介导神经元和少突胶质细胞的死亡[8-9]；A2型反应性星形胶质细胞的标志性蛋白是S100A10，S100A10阳性的A2型反应性星形胶质细胞体积肥大，树突很少，参与细胞增殖、迁移、膜修复和抑制凋亡[10-11]，提高神经元活力和促进神经再生[12]。反应性星形胶质细胞两种亚型之间可以相互转化，对疾病的整体影响是有益还是有害，取决于功能丧失和功能获得的平衡和性质，以及不同星形胶质细胞亚型的相对丰度[13-14]。因此探索影响反应性星形胶质细胞不同亚型的因素是非常重要的。
高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1，HMGB1)作为一种关键的炎症、免疫递质，既可以从脊髓损伤后的坏死细胞中被动释放，也可以由反应性星形胶质细胞主动分
泌[15-16]，HMGB1通过调节巨噬细胞/小胶质细胞的极化可以使脊髓损伤的恢复向有利的方向发展[17]，但是HMGB1对反应性星形胶质细胞不同亚型的作用仍然未知。HMGB1 能够与细胞表面 toll 样受体4(toll-like receptor4，TLR4) 结合，进一步激活核转录因子κB(nuclear factor-kappa κB，NF-κB)，从而刺激细胞因子[18]、炎症因子的产生并改变目标细胞相应效应蛋白的表达和功能[19]。许多信号通路都参与反应性星形胶质细胞的活化与不同亚型之间的转化，NF-κB是其中最重要的通路之一[20]。但HMGB1能否通过NF-κB通路影响反应性星形胶质细胞的不同亚型尚不清楚。
尽管抑制HMGB1可以减轻脊髓损伤后的水肿和炎症，但是其对反应性星形胶质细胞的影响鲜见报道，该研究旨在探索星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧复糖(oxygen-glucose deprivation/restoration，OGD/R)损伤后活化为反应性星形胶质细胞的情况，以及HMGB1能否影响反应性星形胶质细胞的不同亚型，为脊髓损伤的治疗提供了新的基础研究支持。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞分子生物学体外实验，两组之间比较通过t检验、多组间比较通过单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于 2020 年 10 月至 2021 年9 月在山西医科大学转化医学研究中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物新生一两天的SD大鼠20只，雌性15只，雄性5只，体质量5-10 g，由山西医科大学动物中心提供，许可证号：SCXK(晋)2019-0004。所有实验程序均经山西医学科学院实验动物福利伦理委员会批准，批准号为：SBQDL-2021-002。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 实验试剂 NF-κB抑制剂Bay 11-7082(Sigma，美国)；HMGB1抑制剂丙酮酸乙酯(Sigma，美国)；TLR4抑制剂CLI-095(Invivogen，美国)；FITC标记的山羊抗兔二抗(博士德，中国)；DMEM高糖培养基、DMEM无糖培养基、胎牛血清(Gibco公司，美国)；胰酶(博士德，中国)；山羊抗兔、山羊抗鼠二抗(ImmunoWay，美国)；兔抗大鼠C3多克隆抗体(Abcam，英国)；兔抗大鼠GAPDH单克隆抗体(Bioworld，美国)；兔抗大鼠NF-κB抗体(Cell Signaling Technology，美国)；兔抗大鼠S100A10单克隆抗体(Sigma，美国)；小鼠抗大鼠Histone抗体(碧云天，中国)；小鼠抗大鼠S100β抗体(博士德，中国)；小鼠抗大鼠TLR4单克隆抗体(Novus，美国)；携带HMGB1 shRNA慢病毒载体、携带阴性shRNA慢病毒载体(上海汉恒生物，中国)。
1.3.3 实验器材光学显微镜(凤凰，中国)；显影仪(上海勤翔，中国)；荧光显微镜(Biotek，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组 ①观察OGD/R损伤对反应性星形胶质细胞的影响，分为Normal组(正常组)、OGD6 h/R6 h组、OGD6 h/R12 h组、OGD6 h/R24 h组。②选择A2型反应性星形胶质细胞最多的时间点，观察抑制HMGB1对反应性星形胶质细胞的影响，分为正常组、OGD6 h/R6 h组、HMGB1干扰组、阴性序列转染组、OGD6 h/R6 h+12 µmol/L丙酮酸乙酯组(简称丙酮酸乙酯组)。③探究HMGB1对反应性星形胶质细胞影响的可能机制，分为正常组、OGD6 h/R6 h组、OGD6 h/R6 h+5 µmol/L CLI-095组(简称CLI-095组)、OGD6 h/R6 h+5 µmol/LBAY 11-7082组(简称BAY 11-7082组)。

1.4.2 星形胶质细胞的分离、原代培养及传代取新生一两天内SD大鼠碘伏消毒3次后体积分数为75%乙醇浸泡再次消毒，麻醉后迅速断头处死，剪开背部皮肤，沿两侧剪下脊柱，用显微剪剪开椎管取出脊髓。仔细剥离脊膜和血管后剪成微小组织块，1 200 r/min离心5 min，用0.125%胰酶消化30 min，加入中和血清后混匀，1 200 r/min离心5 min，弃去上清，加入含体积分数为12%胎牛血清的DMEM吹打混匀，使用200目筛网过滤，调整细胞浓度为5×108 L-1，接种于T25培养瓶中，置于细胞培养箱内培养，每3 d进行1次换液，细胞融合至90%可以进行传代，选取第3代星形胶质细胞进行下一步实验。

1.4.3 细胞免疫荧光染色将第3代星形胶质细胞以1×105接种于无菌盖玻片上，待细胞融合度达到80%时，PBS洗涤3次，5 min/次；用40 g/L多聚甲醛室温固定20 min，PBS洗涤3次，5 min/次；0.5%Triton X-100室温通透20 min，PBS洗涤3次，5 min/次；体积分数为5%山羊血清37 ℃孵育45 min，吸干净封闭液，滴加稀释好的一抗S100β(1∶200)、C3(1∶100)、S100A10(1∶100)于4 ℃放置过夜；PBS洗涤3次，5 min/次，在避光处滴加含FITC的二抗，37 ℃孵育1.5 h，后续操作均需避光处理；PBS洗涤3次，5 min/次，DAPI染细胞核5 min，PBS洗涤3次，5 min/次，吸干净玻片上液体后用抗荧光衰减封片剂封固，荧光显微镜下观察并拍照。
1.4.4 OGD/R模型模拟体外大鼠脊髓损伤后的缺血再灌注过程选取第3代星形胶质细胞，弃去培养瓶中培养基，PBS洗涤3次，加入无糖、无血清DMEM培养基，置于37 ℃、体积分数为1%O2、5%CO2、94%N2的三气培养箱中培养6 h，PBS洗涤3次，加入含体积分数为12%胎牛血清的高糖DMEM培养基，置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中继续培养。
1.4.5 Western blot检测第3代星形胶质细胞按实验分组进行相应干预，收集各组细胞，用试剂盒分别提取总蛋白和核蛋白，BCA法检测蛋白浓度，根据蛋白分子质量选择合适的SDS-PAGE凝胶进行电泳，250 mA湿转1.5 h，5%脱脂奶粉封闭2 h，加一抗C3(1∶1 000)、S100A10(1∶500)、TLR4(1∶800)、NF-κB(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)、Histone(1∶1 000)于4 ℃过夜，TBST洗涤3次，8 min/次，加二抗(1∶5 000)孵育2 h，TBST洗涤3次，8 min/次，曝光显影，保存结果，总蛋白表达水平归一化为GAPDH，核蛋白表达水平归一化为Histone。正常组的灰度值平均值设为1，其他组用正常组的平均值归一化，实验结果至少重复3次。
1.4.6 shRNA介导的HMGB1敲低 HMGB1 shRNA慢病毒载体的序列如下：5’-GGC AAA GGC TGA CAA GGC TCG TTA TTT CAA GAG AAT AAC GAG CCT TGT CAG CCT TTG CCT TTT TT-3’。非靶向shRNA作为实验的阴性对照。通过前期研究已经确定了HMGB1 shRNA慢病毒载体的转染复数为60，使用含体积分数为12%胎牛血清的DMEM培养基将HMGB1 shRNA或非靶向shRNA慢病毒载体导入。将脊髓星形胶质细胞与病毒载体孵育12 h，PBS漂洗3次，换为含体积分数为12%胎牛血清的DMEM培养基继续培养72 h后进行OGD/R处理。
1.4.7 划痕实验用marker笔在24孔板背后均匀地划横线，至少超过24孔的边缘，每孔至少有3条横线。在孔中加入1×105个第3代各组干预后的星形胶质细胞，加入1 mL培养基培养至细胞融合度90%左右；直尺垂直于横线，用200 µL枪头沿着直尺进行划痕；加入1 mL PBS洗涤掉落的细胞，洗涤3次，在24孔中加入无血清DMEM培养基，做后续处理；放入细胞培养箱中培养，按照0，24，48 h时间点取样拍照。根据细胞迁移能力强弱，相应缩短或延长观察时间间隔。
1.5 主要观察指标 ①星形胶质细胞形态及其纯度；②反应性星形胶质细胞的形态、分子生物学、迁移能力的变化；③HMGB1对A1、A2型反应性星形胶质细胞的影响；④HMGB1是否通过TLR4/NF-κB信号通路影响A1、A2型反应性星形胶质细胞。
1.6 统计学分析所有实验结果至少重复3次。采用GraphPad Prism 7.0.4统计软件进行数据分析，实验结果均以x±s表示，两组间比较通过配对t检验、多组间比较通过单因素方差分析进行比较，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过山西医科大学统计学专家审核。

讨论

该研究发现星形胶质细胞在ODG/R后会转化为一种更为活跃的状态，称为反应性星形胶质细胞，在损伤早期活化为A2型反应性星形胶质细胞，损伤后期A1型反应性星形胶质细胞增多，抑制HMGB1可以通过TLR4/NF-κB通路使A1型反应性星形胶质细胞减少，A2型反应性星形胶质细胞增多，细胞迁移能力增加。
脊髓损伤后损伤部位的内环境发生剧烈变化，可以引起星形胶质细胞活化为反应性星形胶质细胞，损伤部位及邻近节段的反应性星形胶质细胞对损伤后自发运动恢复至关重要[21-22]。有研究表明HMGB1是脊髓损伤后发生炎症的关键递质，可以由中枢神经系统中的反应性星形胶质细胞和小胶质细胞主动分泌，也可以由损伤后的坏死细胞被动释放，HMGB1可以介导细胞的水肿、增殖、凋亡，也可以调节小胶质细胞/巨噬细胞极化为不同的亚型[18，23-24]，但是HMGB1对反应性星形胶质细胞不同亚型的影响却知之甚少。因此，该研究探索HMGB1对反应性星形胶质细胞的影响及其机制，并且对反应性星形胶质细胞的迁移进行了初步研究。
通过细胞在低氧无糖的环境中模拟体内缺氧、缺血过程，而复氧复糖培养是模拟体内缺血再灌注的状态，OGD/R模型是目前脊髓损伤的体外细胞实验模型[18]。有研究表明，物理创伤脊髓后血管破裂和血脊髓屏障破裂导致脊髓出血和缺血，这可能导致早期病理过程中A2型反应性星形胶质细胞特异性转录水平上调，随后A1型反应性星形胶质细胞特异性转录水平逐渐上调，并在7 d达到峰值，开始引起大部分继发性损伤[25]。该研究也同样发现氧糖剥夺后细胞形态发生改变，迁移能力增强，在复氧复糖早期主要活化为A2型反应性星形胶质细胞，随着复氧时间的延长，A2型反应性星形胶质细胞减少，A1型星形胶质细胞开始增多。
已经发现HMGB1参与了中枢神经系统的许多相关疾病，包括脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、癫痫和多发性硬化症[26]。研究表明，HMGB1在所有有核动物细胞中表达，在生理条件下可以稳定染色质结构，当从坏死细胞被动释放时，它可以作为一种强大的炎症递质[23，27-28]。作者之前的研究表明星形胶质细胞未损伤时不表达和分泌HMGB1，OGD/R后HMGB1的表达和分泌增加，随着复氧时间的延长HMGB1表达和分泌逐渐增多[18]。该研究表明抑制HMGB1可以减少A1型反应性星形胶质细胞，增多A2型反应性星形胶质细胞，这说明HMGB1可以调节反应性星形胶质细胞的不同亚型。有研究证明紫草素、甘草甜素、右托米啶等通过抑制HMGB1和炎症因子减轻大鼠脊髓损伤，丙酮酸乙酯通过抑制脊髓HMGB1的释放，减轻脊髓损伤[29-32]。有研究表明，在严重的中枢神经系统损伤期间，反应性星形胶质细胞增殖并迁移到损伤区域，与其他细胞和细胞外基质成分结合形成胶质瘢痕，限制损伤的进一步扩大[33-34]。该研究证明了抑制HMGB1可以增强反应性星形胶质细胞的迁移能力，可以快速向损伤部位迁移。2017年，HARA等[13]在小鼠挫伤性脊髓损伤模型中分离出3种星形胶质细胞类型，包括原始星形胶质细胞、反应性星形胶质细胞和瘢痕形成性星形胶质细胞，将带有标记的原始星形胶质细胞移入正常脊髓和损伤脊髓中，在他们的研究中发现正常脊髓的原始星形胶质细胞没有改变，然而，损伤脊髓的原始星形胶质细胞活化为反应性星形胶质细胞，这些发现表明星形胶质细胞以环境依赖的方式改变其表型[35]。该研究证明了HMGB1是引起星形胶质细胞表型改变的重要因子。
研究显示在中枢神经系统损伤中，NF-κB被迅速激活，NF-κB是神经炎症中的关键转录因子，可以控制细胞因子的增殖和基因转录[36-37]。有相关研究表明，当NF-κB通路和Notch通路被抑制时，A1型反应性星形胶质细胞的活化被阻断，A2型反应性星形胶质细胞的活化被促进；而JAK2-STAT3通路被抑制时，A1型反应性星形胶质细胞和A2型反应性星形胶质细胞的活化都受到阻碍[38]；然而，当PI3K-Akt通路被抑制时，A2型反应性星形胶质细胞的活化被阻断，A1型星形胶质细胞的活化被促进[39]。现在发现用CLI-095和BAY 11-7082抑制TLR4和NF-κB后，A1型反应性星形胶质细胞的活化被阻断，A2型反应性星形胶质细胞的活化被促进。据报道，在白细胞介素10处理的星形胶质细胞中诱导STAT3过度磷酸化，并伴有A1型反应性星形胶质细胞的增加[40]。在脊髓损伤模型中，也发现了Notch-STAT3轴的激活诱导了星形胶质细胞表型向A1型转变和神经毒性转化[41]。然而，也有研究表明，STAT3可能诱导A2型反应性星形胶质细胞，从而促进脊髓损伤模型的轴突再生[42]。该实验研究表明HMGB1可以通过TLR4/NF-κB信号通路调节反应性星形胶质细胞的不同亚型，后续还可以进一步探究HMGB1能否通过其他信号通路影响反应性星形胶质细胞。另外，该研究还应该选取氧糖剥夺的多个时间点进行进一步验证。
总之，HMGB1可以调节反应性星形胶质细胞，通过TLR4/NF-κB信号通路使A1型反应性星形胶质细胞减少，A2型反应性星形胶质细胞增多，为脊髓损伤后的治疗提供了基础研究支持。

高迁移率族蛋白B1对体外氧糖剥夺/复氧复糖后大鼠脊髓反应性星形胶质细胞不同亚型的作用

Effects of high-mobility group box 1 on different subtypes of rat spinal reactive astrocytes after oxygen-glucose deprivation/restoration in vitro

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