沙丁胺醇减轻大鼠的高氧性急性肺损伤

doi:10.12307/2022.664

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (23): 3657-3663.doi: 10.12307/2022.664

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沙丁胺醇减轻大鼠的高氧性急性肺损伤

梅鸿，覃松，李康，陈淼

遵义医科大学附属医院重症医学科二病区，贵州省遵义市 563000

收稿日期:2021-04-10 接受日期:2021-05-27 出版日期:2022-08-18 发布日期:2022-02-15
通讯作者: 陈淼，硕士，主任医师，遵义医科大学附属医院重症医学科二病区，贵州省遵义市 563000
作者简介:梅鸿，男，2014年遵义医学院毕业，硕士，副主任医师，主要从事急性肺损伤的保护研究。
基金资助:
遵义医学院附属医院基金[ 院字(2015)32]，项目负责人：梅鸿；国家自然科学基金(81960362)，项目负责人：覃松

Salbutamol attenuates hyperoxia-induced acute lung injury in rats

Mei Hong, Qin Song, Li Kang, Chen Miao

Second Department of Critical Care Medicine, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China

Received:2021-04-10 Accepted:2021-05-27 Online:2022-08-18 Published:2022-02-15
Contact: Chen Miao, Master, Chief physician, Second Department of Critical Care Medicine, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
About author:Mei Hong, Master, Associate chief physician, Second Department of Critical Care Medicine, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
Supported by:
the Foundation of the Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, No. (2015)32 (to MH); the National Natural Science Foundation of China, No. 81960362 (to QS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
核因子E2相关因子2(Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)：是调控细胞氧化应激反应的重要转录因子，同时也是维持细胞内氧化还原稳态的中枢调节者。Nrf2通过诱导调控一系列抗氧化蛋白的组成型和诱导型表达，可以减轻活性氧和亲电体引起的细胞损伤，使细胞处于稳定状态，维持机体氧化还原动态平衡。
细胞间黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)：又叫做CD54，属于黏附分子中免疫球蛋白超家族中的成员，是介导黏附反应的一个重要黏附分子。ICAM-1 在静息的血管内皮细胞上呈低水平表达，通过与血管内皮细胞表面上的特异性受体结合而发挥其生物学活性。

背景：临床上高氧导致的高氧性急性肺损伤越来越受到人们的关注。研究显示，沙丁胺醇能够减轻大鼠的炎性反应，提高多种抗氧化物质的活性，改善微循环，从而减轻肺水肿的程度，对肺组织起到一定的保护作用。
目的：探究沙丁胺醇减轻高氧性急性肺损伤的效果及其作用机制。
方法：将SD大鼠分为对照组、不同时间高氧处理肺损伤模型组和不同剂量沙丁胺醇雾化给药治疗组(0.025，0.05，0.1，0.2，0.4 mg/kg)。通过测定各项生化指标确定最佳的高氧(> 95%)处理时间和沙丁胺醇使用剂量；随后分别用qRT-PCR、Western-blot和苏木精-伊红染色法测定给予最佳沙丁胺醇剂量时肺损伤模型组大鼠肺组织JNK/PI3K/Akt/NF-κB/ICAM-1信号通路中mRNA和蛋白的表达以及肺脏组织的病理变化。
结果与结论：①实验成功构建了高氧性急性肺损伤模型，且60 h时模型效果最佳；②最优的沙丁胺醇使用剂量为0.2 mg/kg；模型组与对照组相比，各项生化指标均出现极显著的升高或降低(P < 0.05)、肺损伤模型组JNK/PI3K/Akt/NF-κB/ICAM-1信号通路相关因子(JNK，PI3K，Akt，核因子E2相关因子2，核因子κB，细胞间黏附分子1，白细胞介素8，肿瘤坏死因子)mRNA和蛋白表达水平均明显上调(P < 0.05)，沙丁胺醇治疗组则明显回归(P < 0.05)；③肺损伤模型组表现出严重的病理损伤和炎性因子浸润，沙丁胺醇可有效缓解肺损伤模型组的变化；④结果说明，沙丁胺醇可通过JNK/PI3K/Akt/NF-κB/ICAM-1信号通路来减轻高氧性急性肺损伤大鼠的肺损伤程度。

https://orcid.org/0000-0001-6214-0656 (梅鸿)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 沙丁胺醇, 改善, 高氧性急性肺损伤, 信号通路, 机制

Abstract: BACKGROUND: Hyperoxia-induced acute lung injury has attracted more and more attention in clinical practice. Studies have shown that salbutamol can reduce inflammation in rats and improve the activity of various antioxidants and microcirculation, thereby reducing pulmonary edema, and exerting a protective role in lung tissue.
OBJECTIVE: To investigate the effect of salbutamol on relieving hyperoxia-induced acute lung injury and its mechanism.
METHODS: Sprague-Dawley rats were divided into a control group, a model group in which lung injury model was prepared with high concentration oxygen at different time, and a treatment group given different dosages of salbutamol by gavage (0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 mg/kg). The optimal high concentration oxygen (> 95%) treatment time and dosage of salbutamol were determined by measuring various biochemical indicators. Real-time quantitative PCR, western blot, and hematoxylin-eosin staining were then used to determine the mRNA and protein expressions in JNK/PI3K/Akt/NF-κB/ICAM-1 signaling pathway and the pathological changes of lung tissue in the model rats with lung injury given the optimal dose of salbutamol.
RESULTS AND CONCLUSION: The hyperoxia-induced acute lung injury model was successfully constructed and showed the best quality when treated with high concentration oxygen at 60 hours. The optimal dosage of salbutamol was 0.2 mg/kg. Compared with the control group, the biochemical indicators showed a significant increase or decrease in the model group (P < 0.05). The mRNA and protein expression levels of JNK/PI3K/Akt/NF-κB/ICAM-1 signaling pathway-related factors (JNK, PI3K, Akt, nuclear factor E2 related factor 2, nuclear factor κB, intercellular adhesion molecule 1, interleukin 8, tumor necrosis factor) were significantly up-regulated in the model group compared with the control group (P < 0.05). A significant regression was observed after treatment with salbutamol (P < 0.05). Besides, the model group showed severe pathological damage and inflammatory infiltration, and salbutamol could effectively alleviate these changes in the model group. To conclude, salbutamol can significantly improve the lung injury in rats with hypoxia-induced acute lung injury through JNK/PI3K/Akt/NF-κB/ICAM-1 signaling pathways.

Key words: salbutamol, improvement, hyperoxia-induced acute lung injury, signal pathway, mechanism

中图分类号:

梅鸿, 覃松, 李康, 陈淼. 沙丁胺醇减轻大鼠的高氧性急性肺损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3657-3663.

Mei Hong, Qin Song, Li Kang, Chen Miao. Salbutamol attenuates hyperoxia-induced acute lung injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(23): 3657-3663.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠总计120只，实验过程无缺失，造模成功率为93%，4只因氧中毒死亡。
2.2 构建高氧性急性肺损伤大鼠的模型高氧处理组大鼠36 h后口鼻处逐渐出现血性分泌物，头颤等症状，但未出现大鼠的死亡。不同时间点分别收集常规和高氧处理大鼠的样品进行生化指标测定，高氧处理组除动脉氧分压系数外，其他生化指标均随着时间的推移呈现极显著上升且24 h时开始出现显著差异(P < 0.05)，见图1。

这些结果表明，构建急性高氧性肺损伤模型最佳的高氧处理时间为60 h。
2.3 沙丁胺醇最优使用剂量的筛选不同给药剂量处理大鼠12 h后收集样品进行生化指标检测。与正常对照大鼠相比，药物剂量较低时除颈动脉血氧合指数(动脉氧分压)、谷胱甘肽过氧化物酶值和超氧化物歧化酶值发生极显著的降低(P < 0.001)外，其他生化指标值(肺通透指数：支气管肺泡灌洗液中蛋白/血浆中蛋白)、右肺副叶湿干质量、乳酸脱氢酶、白细胞数量、中性粒细胞数量、乳酸脱氢酶、丙二醛、白细胞介素8、白细胞介素1和肿瘤坏死因子水平均出现极显著的升高(P < 0.001)；沙丁胺醇治疗组随着药物浓度的增加，各生化指标值逐渐向正常大鼠水平接近，见图2。这些结果表明，沙丁胺醇雾化给药处理最佳的使用剂量为0.2 mg/kg。

2.4 PI3K/AKt通路中相关mRNA的表达水平分别收集对照组、最佳高氧处理时间和最佳沙丁胺醇给药剂量处理急性肺损伤大鼠肺组织进行qRT-PCR检测。与肺损伤模型组相比，对照组和沙丁胺醇治疗组大鼠肺脏组织JNK、核因子E2相关因子2、核因子κB-p65、PI3K、Akt和细胞间黏附分子1的mRNA表达量均极显著回降(P < 0.001)，见图3。上述结果表明高氧性急性肺损伤大鼠中PI3K/AKT信号通路相关基因的表达水平发生了极显著升高，而沙丁胺醇可以缓解这种现象。

2.5 PI3K/Akt通路中相关蛋白的表达水平分别收集对照、最佳高氧处理时间和最佳沙丁胺醇给药剂量处理高氧性急性肺损伤大鼠肺组织进行Western-blot检测。与肺损伤模型组相比，对照组和沙丁胺醇治疗组大鼠肺脏组织JNK、核因子E2相关因子2、核因子κB-p65、PI3K、Akt和细胞间黏附分子1的蛋白表达量均极显著的降低(P < 0.001)，见图4。值得注意的是沙丁胺醇治疗组大鼠肺脏JNK、PI2K、Akt、核因子κB-p65的磷酸化水平明显降低(P < 0.05)。上述结果表明高氧性急性肺损伤大鼠中PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达水平发生了极显著升高，而沙丁胺醇可以缓解这种现象。

2.6 病理组织的观察苏木精-伊红染色结果显示，对照组大鼠肺泡结构完整清晰，肺泡壁光滑，肺泡腔无渗出液，肺泡间隔均匀一致；肺损伤模型组大鼠毛细血管扩张，肺泡腔内可见少量渗出液，肺泡间隔增厚，出现中性粒细胞炎性渗出；沙丁胺醇治疗组肺泡结构比较清晰，几乎无血管扩张现象，肺泡腔几乎无渗出液，肺泡间隔基本均匀，见图5。上述结果表明高氧性急性肺损伤大鼠中肺组织发生了实质化病变，而沙丁胺醇可以缓解这种现象。

参考文献

[1] PAN YQ, HOU A. Hyperoxia-induced lung injury increases CDKN1A levels in a newborn rat model of bronchopulmonary dysplasia. Exp Lung Res. 2018;44(8-9):424-432.
[2] CHEN CM, HWANG J, CHOU HC, et al. Tn (N-acetyl-d-galactosamine-O-serine/threonine) immunization protects against hyperoxia-induced lung injury in adult mice through inhibition of the nuclear factor kappa B activity. Int Immunopharmacol. 2018;59:261-268.
[3] HONG CY, ZHANG HD, LIU XY, et al. Attenuation of hyperoxic acute lung injury by Lycium barbarum polysaccharide via inhibiting NLRP3 inflammasome. Arch Pharm Res. 2019;42(10):902-908.
[4] RATHINASABAPATHY A, HOROWITZ A, HORTON K, et al. The Selective Angiotensin II Type 2 receptor agonist, compound 21, attenuates the progression of lung fibrosis and pulmonary hypertension in an experimental model of bleomycin-induced lung injury. Front Physiol. 2018;9:180.
[5] JABBAL S, LIPWORTH BJ. Sensitivity of lung resistance and compliance to beta-blocker induced bronchoconstriction and long acting beta-agonist withdrawal in COPD. Lung. 2018;196(1):15-18.
[6] LEWIS SR, PRITCHARD MW, THOMAS CM, et al. Pharmacological agents for adults with acute respiratory distress syndrome. Cochrane Database Syst Rev. 2019;7(7):CD004477.
[7] WU X, LI S, WANG X, et al. Therapeutic role of terbutaline in a rat whole-lung lavage model.Exp Lung Res. 2011;37(9):542-548.
[8] SALDIAS FJ, LECUONA E, COMELLAS AP, et al. beta-adrenergic stimulation restores rat lung ability to clear edema in ventilator-associated lung injury. Am J Respir Crit Care Med. 2000;162(1):282-287.
[9] BOSMANN M, GRAILER JJ, ZHU K, et al. Antiinflammatory effects of beta2 adrenergic receptor agonists in experimental acute lung injury. FASEB J. 2012;26(5):2137-2144.
[10] WANG Z, LV Y, ZHANG D, et al. In Vivo Effects of Salbutamol Residues on Blood Lipid, Lung Structure, Gene Expression, and Gut Microorganism Composition. ACS Omega. 2019;4(24):20644-20653.
[11] POZZOLI C, BERTINI S, POLI E, et al. Relaxing effects of clenbuterol, ritodrine, salbutamol and fenoterol on the contractions of horse isolated bronchi induced by different stimuli. Res Vet Sci. 2020;128:43-48.
[12] SUN Y, QIN L, LIU C, et al. Exploring the influence of drug content on DPI powder properties and potential prediction of pulmonary drug deposition. Int J Pharm. 2020;575:119000.
[13] ZHANG R, WU J, LIU S, et al. Spatial Distribution of (R)-salbutamol in Rat Brain Following Nasal and Intravenous Administration Using DESI-MS. Pharmaceutics. 2020;12(1):35.
[14] LOURENÇO LO, LOPES ACR, ZAVAN B, et al. Vagotomy influences the lung response to adrenergic agonists and muscarinic antagonists. Respir Physiol Neurobiol. 2020;274:103358.
[15] MORI A, HIGASHI K, WAKAO S, et al. Probucol prevents the attenuation of β 2-adrenoceptor-mediated vasodilation of retinal arterioles in diabetic rats. 2017;390(12):1247-1253.
[16] 石敏. 高氧性急性肺损伤(HALI)的炎症发生机制及内毒素血症对HALI的影响[D]. 北京:中国人民解放军军医进修学院,2007.
[17] PATIL SS, HERNÁNDEZ-CUERVO H, FUKUMOTO J, et al. Alda-1 attenuates hyperoxia-induced mitochondrial dysfunction in lung vascular endothelial cells. Aging (Albany NY). 2019;11(12):3909.
[18] WU Q, CHONG L, SHAO Y, et al. Lipoxin A4 reduces hyperoxia-induced lung injury in neonatal rats through PINK1 signaling pathway. Int Immunopharmacol. 2019;73:414-423.
[19] ZHENG G, REN H, LI H, et al. Lycium barbarum polysaccharide reduces hyperoxic acute lung injury in mice through Nrf2 pathway. Biomed Pharmacother. 2019;111:733-739.
[20] 周学军. 大剂量多种药物中毒致呼吸心跳骤停1例抢救成功体会[J]. 中国中医急症,2010,19(2):335-335.
[21] 陈一农, 张吟, 郑兴中, 等. 中毒剂量与治疗剂量克仑特罗在兔体内的药动学研究[J]. 中国现代应用药学,2005,22(4):272-275.
[22] CHOI S, JEON S, YIM DS, et al. Contribution of Trough Concentration Data in the Evaluation of Multiple-Dose Pharmacokinetics for Drugs with Delayed Distributional Equilibrium and Long Half-Life. Drug Des Devel Ther. 2020;14:811-821.
[23] WANG X, WANG J. Analysis of the advantages and disadvantages in application of oxygen-driven aerosol and aerosol inhalation by air compressor for the pediatric asthma.Pak J Pharm Sci. 2018;31 (6(Special)):2847-2850.
[24] TIZIANO FD, LOMASTRO R, ABIUSI E, et al. Longitudinal evaluation of SMN levels as biomarker for spinal muscular atrophy: results of a phase IIb double-blind study of salbutamol. J Med Genet. 2019;56(5):293-300.
[25] DEMIREL BD, AYÇIÇEK T, GÜN S, et al. Evaluation of the histopathological effects of salbutamol inhaler treatment in an experimentally induced rat model of pulmonary contusion.Turk J Med Sci. 2018;48(6): 1285-1292.
[26] GRAILER JJ, HAGGADONE MD, SARMA JV, et al. Induction of M2 regulatory macrophages through the β2-adrenergic receptor with protection during endotoxemia and acute lung injury. J Innate Immun. 2014;6(5):607-618.
[27] WU X, WANG Z, QIAN M, et al. Adrenaline stimulates the proliferation and migration of mesenchymal stem cells towards the LPS-induced lung injury. J Cell Mol Med. 2014;18(8):1612-1622.
[28] BLENK N, KUNKEL SL. Endogenous norepinephrine regulates tumor necrosis factor-α production from macrophages in vitro. J Immunol. 1994;152(6):3024-3031.
[29] HUANG JL, ZHANG YL, WANG CC, et al. Enhanced phosphorylation of MAPKs by NE promotes TNF-α production by macrophage through α adrenergic receptor.Inflammation. 2012;35(2):527-534.
[30] DONNELLY LE, TUDHOPE SJ, FENWICK PS, et al. Effects of formoterol and salmeterol on cytokine release from monocyte-derived macrophages. Eur Respir J. 2010;36(1):178-186.
[31] SAMANTA J, SINGH S, ARORA S, et al. Cytokine profile in prediction of acute lung injury in patients with acute pancreatitis. Pancreatology. 2018;18(8):878-884.
[32] XU F, LUO M, HE L, et al. Necroptosis contributes to urban particulate matter-induced airway epithelial injury. Cell Physiol Biochem. 2018; 46(2):699-712.
[33] DING Q, LIU G, ZENG Y, et al. Glycogen synthase kinase‑3β inhibitor reduces LPS‑induced acute lung injury in mice. Mol Med Rep. 2017; 16(5):6715-6721.
[34] QIU Y, XIAO Z, WANG Y, et al. Optimization and anti-inflammatory evaluation of methyl gallate derivatives as a myeloid differentiation protein 2 inhibitor. Bioorg Med Chem. 2019;27(20):115049.
[35] IBRAHIM YF, MOUSSA RA, BAYOUMI AMA, et al. Tocilizumab attenuates acute lung and kidney injuries and improves survival in a rat model of sepsis via down-regulation of NF-κB/JNK: a possible role of P-glycoprotein. Inflammopharmacology. 2020;28(1):215-230.
[36] ZHANG Y, HUANG T, JIANG L, et al. MCP-induced protein 1 attenuates sepsis-induced acute lung injury by modulating macrophage polarization via the JNK/c-Myc pathway. Int Immunopharmacol. 2019; 75:105741.
[37] JIN H, YANG X, ZHAO K, et al. Glycogen synthase kinase-3 beta inhibitors protectagainst the acute lung injuries resulting from acute necrotizing pancreatitis.Acta Cir Bras. 2019;34(6):e201900609.
[38] GAUDET A, PORTIER L, PRIN M, et al. Endocan regulates acute lung inflammation through control of leukocyte diapedesis. J Appl Physiol (1985). 2019;127(3):668-678.
[39] ZHANG C Y, LIN W, GAO J, et al. pH-Responsive Nanoparticles Targeted to Lungs for Improved Therapy of Acute Lung Inflammation/Injury. ACS Appl Mater Interfaces. 2019;11(18):16380-16390.
[40] LI G, ZHOU L, ZHANG C, et al. Insulin-like growth factor 1 regulates acute inflammatory lung injury mediated by influenza virus infection. Front Microbiol. 2019;10:2541.
[41] SUI H, LUO M, MIAO Y, et al. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator ameliorates lipopolysaccharide-induced acute lung injury by inhibiting autophagy through PI3K/AKT/mTOR pathway in mice. Respir Physiol Neurobiol. 2020;273:103338.
[42] SHI J, YU J, ZHANG Y, et al. PI3K/Akt pathway-mediated HO-1 induction regulates mitochondrial quality control and attenuates endotoxin-induced acute lung injury. Lab Invest. 2019;99(12):1795-1809.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，两两比较采用t检验。
1.2 时间及地点实验于2017年9月至2019年9月在遵义医学院完成。
1.3 材料
1.3.1 药品及试剂硫酸沙丁胺醇(2 mg/片，石家庄康力药业有限公司)；将药片研磨成粉后溶解于生理盐水中，随后加入雾化装置中用于大鼠雾化给药。Trizol Reagent、HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit、BCA Protein Quantification Kit和高敏型ECL 化学发光检测试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)；白细胞介素6、白细胞介素8、白细胞介素1、肿瘤坏死因子 ELISA试剂盒(英国Abcam公司)；抗大鼠白细胞介素8、白细胞介素1、肿瘤坏死因子、NF-κB-p65、磷酸肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、核因子E2相关因子2、细胞间黏附分子1、β-actin与磷酸化抗体和HRP标记的二抗(美国Proteintech公司)；肺脏灌洗液相关生化指标送遵义医科大学附属医院进行检测。
1.3.2 实验动物清洁型雄性SD大鼠8周龄120只，体质量280-300 g，由遵义医科大学动物中心提供，合格证号：SCXK，黔2019-0011。该研究得到遵义医科大学动物护理和使用委员会伦理委员会的批准(zyykdx20190046)。
1.4 实验方法

1.4.1 大鼠的分组及处理将大鼠随机分为对照组、高氧性急性肺损伤模型组(肺损伤模型组)和沙丁胺醇治疗组，每组设置10只。相关动物样品的收集按照石敏[16]的方法进行。其中高氧性急性肺损伤动物模型的构建参考文献[16]中的方法进行，其中部分细节进行了改动。具体如下：将肺损伤模型组和沙丁胺醇治疗组大鼠饲养于自制高氧箱中(45 cm×30 cm×35 cm的有机玻璃容器，顶端开孔接氧气接头，侧面有等大出气孔，可接氧气检测仪)；玻璃培养箱顶端为进气口连接氧气，侧面为氧气含量测定口连接氧浓度检测仪，调节氧流量使箱内氧浓度持续≥90%；箱内放置石灰吸收大鼠呼出的CO2，保持箱内CO2浓度< 0.5%。培养箱内温度控制为22-25 ℃，湿度为50%-70%，每天持续给氧23.5 h以上，上午定时开舱，0.5 h内完成添加食物、水以及更换垫料等。将大鼠暴露于高氧环境不同时间(12，24，36，48，60，72 h)后，分别收集样品进行相关参数的测定，筛选建立肺损伤模型的最佳高氧处理时间。造模过程中动物死亡4只，造模成功率为93%。后续重新按照最佳条件造模50只大鼠，给予雾化给药不同剂量(0.025，0.05，0.1，0.2，0.4 mg/kg)沙丁胺醇治疗，通过雾化装置，将一定剂量的药物雾化后，与氧气供应管道连通后，供应给大鼠，进行药物使用剂量效果评价。

1.4.2 测动脉血氧分压不同处理时间点，用3%戊巴比妥麻醉大鼠(20 mg/kg)。仰卧位固定，分离暴露出颈总动脉后，取1 mL动脉血液测氧分压。
1.4.3 测支气管肺泡灌洗液中细胞和蛋白水平在不同处理时间点收集肺脏灌洗液(支气管肺泡灌洗液)，取一部分测定乳酸脱氢酶、白细胞、中性粒细胞和总蛋白的含量，剩余液体3 000 r/min 离心10 min，收集上清液体放置于-80 ℃保存备用。
1.4.4 ELISA检测炎性因子分泌水平收集肺脏灌洗液，用商品化的炎性因子(白细胞介素8，肿瘤坏死因子α、白细胞介素1)ELISA检测试剂盒，按照试剂盒中操作指南分别测定灌洗液中炎性因子的分泌水平。
1.4.5 苏木精-伊红染色检测肺病理变化在不同处理时间点观察大鼠完整肺脏的病理变化特征，按照石敏[16]的方法制备苏木精-伊红染色片并采用显微镜进行观察。
1.4.6 qRT-PCR检测肺组织PI3K/Akt信号通路相关mRNA Trizol裂解法抽提肺组织样品总RNA，测定RNA的纯度和浓度后，以上述RNA为模板，利用HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit进行real-time PCR，荧光值的检测采用LightCycler96检测系统进行。检测结果用2-ΔΔCT法进行分析。各待检基因的表达水平以β-actin mRNA为内参基因进行相对定量。研究中所用qRT-PCR引物信息见表1。

1.4.7 Western-blot检测肺组织PI3K/Akt信号通路中相关蛋白采用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解肺组织分离总蛋白。BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后加入到10%SDS-PAGE胶孔中进行蛋白电泳。将分离的蛋白转印到PVDF膜，经5%脱脂乳封闭后依次加入特异性的一抗溶液(1∶500)和HRP结合的二抗(1∶5 000)。特异性抗体包括：抗核因子κB-p65，磷酸化核因子κB-p65，Akt，磷酸化Akt，PI3K，磷酸化PI3K，JNK，磷酸化JNK，核因子E2相关因子2，细胞间黏附分子1和β-actin。用Amersham Imager 600多功能成像仪进行图像的采集，Image J软件对蛋白浓度进行相对定量分析。
1.5 主要观察指标 ①急性高氧性肺损伤模型最佳的高氧处理时间；②沙丁胺醇最优使用剂量的筛选；③PI3K/AKt通路中相关mRNA和蛋白的表达；④大鼠病理组织的观察。
1.6 统计学分析所有数据均来自至少3次独立重复试验，数据用x±s表示，利用GraphPad Prism 6.0软件分析，对照组与模型组之间比较采用t检验。

讨论

氧气在临床治疗中发挥了重要的作用，然而高体积分数氧气可引发明显的肺毛细血管屏障损伤，破坏肺泡毛细血管壁，诱导细胞间黏附分子表达量的增加和中性粒细胞的大量聚集并向肺泡内渗出，导致肺损伤[17-19]，因此寻求可有效改善高氧性肺损伤的药物非常重要。而构建有效的动物模型是开展科学研究首要且极其重要的一步。该研究成功复制了高氧性急性肺损伤的动物模型，通过不同时间的生化指标值变化趋势发现高氧饲养60 h是构建大鼠高氧性急性肺损伤模型的最佳时间。
筛选合适的给药剂量对治疗效果至关重要[20-22]。之前虽然有大量关于沙丁胺醇的研究[23-25]，但是未发现其进行过系统的用药剂量对比研究，给读者造成了较大的困扰。因此，为了筛选有效的沙丁胺醇使用剂量，该研究采用不同剂量浓度的沙丁胺醇进行雾化后对SD大鼠给药，根据多项高氧性急性肺损伤相关生化指标结合肺组织病理切片进行系统的比较分析后发现，低剂量的沙丁胺醇(0.025 mg/kg)具有一定的调节肺损伤能力，但是效果较差；高剂量的沙丁胺醇(0.4 mg/kg)可以有效调节肺损伤，但是表现出了轻微的毒性反应，因此，最适的大鼠沙丁胺醇雾化使用的剂量为0.2 mg/ kg。有研究显示，肾上腺素能受体可通过促进骨髓间质干细胞的增殖，并向受急性损伤的肺组织迁移，调节肺损伤部位炎性因子的分泌水平，从而治疗和预防进一步的肺损伤[26-27]。β-肾上腺素受体激动剂已被证实可以有效减少体外炎症细胞因子的产生，调节炎症的发展[28-30]。尤其是在急性肺损伤中，β2-肾上腺素能受体明显降低了支气管肺泡灌洗液中炎性细胞因子的剂量[9]。因此，作为β2-肾上腺素能受体激动剂的沙丁胺醇，可通过明显降低高氧性急性肺损伤大鼠肺泡中炎性因子的分泌水平来缓解肺损伤。
大量研究表明，高氧刺激可通过核因子κB 途径启动肿瘤坏死因子α、白细胞介素8 和白细胞介素6 等细胞因子的转录，这些因子再反过来激活核因子κB，使其参与更多细胞因子的转录、调控，如此形成一个以核因子κB-p65 与细胞因子之间的正反馈，从而加重炎性反应[31-33]。此外，有研究结果显示，JNK信号通路相关蛋白在急性肺损伤中表达上调，降低该信号通路的表达水平可以减轻肺的损伤程
度[34-36]。还有结果显示细胞间黏附分子1参与调控细胞内炎性因子的表达水平，从而影响急性肺损伤程[37-39]。同样有研究显示PI3K/AKT信号通路也参与了急性肺损伤相关蛋白的调控[40-42]。为了探究高氧性急性肺损伤中上述信号通路相关蛋白是否参与了动物机体的调控，该研究对JNK/PI3K/Akt/核因子κB-p65/细胞间黏附分子1信号通路的mRNA和蛋白表达结合肺脏组织病理变化水平进行了比较分析。发现沙丁胺醇可以显著改善高养性急性肺损伤大鼠的生理和病理变化，且该药物是通过JNK/PI3K/Akt/核因子κB-p65/细胞间黏附分子1信号通路来发挥其主要功能的。
综上所述，沙丁胺醇对治疗高氧性急性肺损伤具有潜在的应用价值，其治疗机制是通过JNK/PI3K/Akt/核因子κB-p65/细胞间黏附分子1信号通路来实现的。该结果可为临床上沙丁胺醇的进一步使用和作用机制提供参考信息。
结论：实验成功复制了高氧性急性肺损伤大鼠模型，随后对沙丁胺醇治疗高氧性急性肺损伤大鼠的效果进行了评价。发现沙丁胺醇可通过降低高氧性急性肺损伤大鼠JNK/PI3K/Akt/核因子kB-p65/细胞间黏附分子1信号通路相关蛋白的表达水平来有效缓解高氧性急性肺损伤症状，见图6。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

沙丁胺醇减轻大鼠的高氧性急性肺损伤

Salbutamol attenuates hyperoxia-induced acute lung injury in rats

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[1]	王宝娟, 郑曙光, 张琪, 李田洋. 苗药熏蒸治疗膝骨关节炎模型兔可延缓细胞外基质的破坏[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1180-1186.
[2]	朱婵, 韩栩珂, 姚承佼, 张强, 刘静, 邵明. 针刺治疗帕金森病：动物实验显示的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1272-1277.
[3]	唐文静, 伍思源, 杨晨, 陶希. 炎症反应与卒中后抑郁[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1278-1285.
[4]	张玉杰, 杨建东, 蔡俊, 朱守雷, 田原. 大蒜素抑制大鼠血管内皮细胞增殖并诱导其凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1080-1084.
[5]	轩娟娟, 白鸿太, 张继翔, 王耀权, 陈国勇, 魏思东. 调节性T细胞亚群在肝移植中的作用及临床应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1143-1148.
[6]	高俞锦, 彭双麟, 马治超, 陆诗, 曹花月, 王浪, 肖金刚. 糖尿病骨质疏松症模型小鼠脂肪干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 999-1004.
[7]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[8]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[9]	何俊君, 黄泽灵, 洪振强. 阳和汤对早期膝骨关节炎模型兔滑膜炎症的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 694-699.
[10]	刘进, 李振, 郝慧琴, 王泽, 赵彩虹, 芦文静. 二妙散水提物调控胶原诱导性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞增殖、迁移和炎性因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 688-693.
[11]	李嘉骏, 夏天, 刘佳敏, 陈锋, 陈豪特, 卓映宏, 吴炜锋. 淫羊藿苷调控成骨信号相关通路治疗激素性股骨头缺血性坏死的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 780-785.
[12]	梁浩然, 周新, 杨彦飞, 牛文杰, 宋文杰, 任智远, 王薛丁, 刘洋, 段王平. 青壮年股骨颈骨折内固定后股骨头坏死的发病机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(3): 456-460.
[13]	谭旭, 梁羽, 梁燕, 廖健. 缺氧处理牙髓干细胞外泌体诱导M2巨噬细胞极化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(25): 3961-3967.
[14]	陈嘉文, 孙天语, 刘鹏 , 吴补领, 吴靖漪. 蛋白聚糖对牙发育再生及干细胞稳态的调控[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(25): 4064-4069.
[15]	陈巧玲, 白亦光, 刘康, 林涛, 罗栩伟. 条件性敲除骨髓间充质干细胞中3-磷酸肌醇依赖蛋白激酶1基因后的成骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3785-3789.