2.1   膝关节僵硬动物模型建立方法   



2.1.1   手术方法
关节外损伤固定：通过手术方式固定膝关节是造成关节僵硬的常用方式，采用不危及关节面的股骨-胫骨固定，可以模拟关节外骨折引起的继发性关节僵硬。USUBA等[7]使用不可吸收编织聚酯手术线和手术针进行股胫皮下结扎，将膝关节制动约150°，5周后取得膝关节屈曲挛缩的满意模型。武蒙[8]垂直于股骨和胫骨长轴打孔，使用缝合线在膝关节表面形成一个交叉，使膝关节处于充分伸直位，4周后成功获得伸直型膝关节僵硬模型。TRUDEL等[9]用螺钉和钢板连接大鼠的股骨近端和胫骨远端，钢板的走行不侵犯膝关节，使膝关节固定在屈曲135°的位置，8周后取出螺钉和钢板，造成膝关节僵硬模型。KANEGUCHI等[10-11]用克氏针穿过股骨和胫骨，然后使用钢丝和树脂固定克氏针，不损伤膝关节，使膝关节屈曲固定约140°，3周后实验组成功复制关节僵硬模型。后来也有学者使用钢丝和牙托粉在体外将克氏针固定于理想位置[12]。ZHOU等[13-14]将大鼠膝关节使用跨越股骨近端和胫骨远端的钢板和螺钉以45°屈曲角固定不同时间，以观察不同固定时间及再活动对关节活动范围的影响。
关节囊、韧带、软骨和半月板等关节内结构和关节周围的肌肉、肌腱、皮肤等关节外结构的损伤都可能导致膝关节僵硬的发生和发展。关节外损伤固定造模的方式主要是通过克氏针或钢板将股骨和胫骨连接固定起来，只对动物下肢造成骨损伤，不波及关节囊、关节软骨等关节内结构，减少了手术操作中对膝关节周围软组织的损伤，减少手术操作因素对膝关节僵硬模型结果的影响。在研究膝关节僵硬所涉及的关节软骨、关节囊及韧带等关节内部结构的病理变化过程有较大的优势。此种方法建立的模型优点是与人体股骨、胫骨不波及关节面的骨折引起膝关节僵硬原理相似，此类模型更适用于研究非膝关节关节面骨折或由于骨折制动、固定而引起的膝关节功能障碍。
关节内损伤固定：通过在股骨髁建立皮质窗并损伤关节囊，建立创伤性关节损伤，同时使用内固定的方式建立膝关节僵硬模型。这种创伤性膝关节僵硬模型具有较好的稳定性，是目前常用的模型[15]，FUKUI等[16]认为这种方法造成的关节内骨破坏及关节内积血对关节僵硬起着重要的作用。传统的关节内创伤方法主要是切除膝关节股骨髁部分骨质并固定膝关节。BARLOW等[17]在家兔膝关节建立皮质窗的同时，增加了一个关节囊损伤，并用克氏针内固定8周，建立了兔创伤性膝关节僵硬模型，与对侧对照膝关节活动度相比，统计学差异具有显著性。
BARANOWSKI等[18]对30只大鼠行手术干预，将膝过伸损伤关节囊，手术使股骨髁外缺损，克氏针穿针直到膝关节屈曲达到145°位置固定4周，建立早期创伤性大鼠膝关节屈曲型挛缩模型。王飞等[19]通过在大鼠右侧股骨外髁建立皮质窗，并用克氏针将膝关节固定在伸直位，4周后成功建立膝关节伸直型僵硬的模型。黄哲元等[20]将手术步骤简化，直接在山羊膝关节上下关节面对称各钻4个骨洞，克氏针交叉固定膝关节于伸直位，并用管型长腿石膏加强固定，结果显示固定8周和12周均出现严重的膝关节僵直，在解除固定后发现僵硬度具有持久性。
MONUMENT等[21]在成年新西兰白兔中，采用关节内损伤和关节内固定相结合的方法造成膝关节创伤后僵硬。通过从股骨内外侧髁的非关节软骨部分切除双侧5 mm×5 mm皮质窗，克氏针穿过胫骨和膝关节将膝关节固定于屈曲150°，研究发现该兔膝关节僵硬模型的关节活动度丧失是不可逆的，证明此方法可以有效建立膝关节僵硬模型。有研究结果表明，通过股骨髁开窗与克氏针内固定制动时，伴有后囊损伤会导致更严重和永久的关节挛缩[22-23]。现有的膝关节挛缩的动物模型大多是用克氏针、钢板等固定，这通常需要第二次手术才能取出内固定，HAZLEWOOD等[24]通过一次手术建立了一种中度膝关节挛缩模型，实验直接损伤兔膝关节关节后囊，并从股二头肌远端剥离出肌瓣，向胫骨上段外侧牵拉与腓肠肌外侧头浅层用可吸收缝合线缝合，使膝关节处于约60°的屈曲位，该模型8周后其膝关节挛缩的严重程度与全膝关节置换和前交叉韧带重建后在人类患者中观察到的挛缩相似。
单纯的克氏针固定后形成的膝关节僵硬虽然能够产生稳定的关节挛缩，但不能完全模拟人的创伤性膝关节僵硬的机制，短时间的制动经过再运动其膝关节的活动范围可以恢复到自然状态，无法形成与人膝关节相似的永久的关节僵硬。关节内损伤固定的方式在造模时使膝关节过伸45°损伤关节后囊，并在股骨外髁的非软骨面开一个皮质窗，这种破坏关节内结构的方式造成膝关节内积血，这种创伤模拟了稳定的关节内骨折。有研究表明，这种关节源性的损伤在固定后形成的关节僵硬模型与非创伤性模型相比，更适合用于早期关节源性挛缩的创建[18]。此模型在破坏关节后囊时对交叉韧带的损伤以及可能存在的骨关节炎，会产生与关节僵硬不同的病理生理过程，这个过程在实际上可能更准确地反映临床情况。总的来说，虽然通过创伤加制动的方式所建立的膝关节僵硬模型会造成膝关节广泛的关节组织损伤，制作难度以及创伤较大，但此模型的诱导成功率高，稳定性好，并且符合关节内骨折术后形成的关节僵硬的病理特征，具有更好的临床相关性，是目前膝关节僵硬模型最常用的造模方法。
2.1.2   非手术方法
单纯外固定：通过在动物膝关节外进行固定形成膝关节僵硬。SASABE等[25]将大鼠在麻醉下放置管形石膏，双后肢膝关节充分屈曲下固定1，2，4周，研究表明制动组各时间点伸膝活动度明显减小，并呈时间依赖性明显下降，制动所致关节挛缩随制动时间的延长而发展和进展。SOTOBAYASHI等[26]用夹板和胶带外固定小鼠单侧膝关节，研究缺氧诱导因子1的转录激活与制动动物膝关节的关节活动度的关系，提出在物理治疗干预前对制动引起的关节挛缩进行基因治疗的可能性。张全兵[27]将兔的膝关节伸直，从骨盆到足趾近端通过石膏外固定，6周后建立兔膝关节伸直型僵硬模型。KOJIMA等[28]将大鼠采用石膏托全屈曲位固定单侧膝关节4周，石膏从骨盆带延伸至踝关节，髋关节最大伸展，膝关节最大屈曲，踝关节最大跖屈，4周后膝关节活动度明显受限。YUN等[29]通过将32只大白兔的膝关节维持在完全伸展的石膏托中，分别于石膏固定后2，4，6，8周观察关节活动受限进展和随后的关节囊变化，结果表明关节挛缩的严重程度在前6周进展迅速，然后可能进展较慢。
石膏或夹板外固定需要注意操作中固定的松紧程度，绷带过紧可能会使固定肢体血液循环障碍，导致肢体肿胀，绷带过松会使固定不稳导致石膏或夹板的脱落，同时石膏的质量和夹板的长度可能会影响动物的活动或发生撕咬等情况。同时石膏固定需要定时检查肢体状况，至少两三天更换1次，以防止松动和肢体水肿，如在固定中发现松动和水肿，则需要重复固定。在外固定过程中还需要注意骨性凸起部位的保护，可以在突起部位放置衬垫，防止压伤。使用单纯外固定的造模方式避免了手术操作对膝关节造成的损伤，并且石膏、夹板、绷带等材料获取简单方便，固定的操作过程较手术方法简单，与临床上下肢损伤后石膏固定类似，可以很好地模拟由于制动造成的膝关节僵硬的病理发展。但这种石膏外固定的时间较长，固定关节周围易发生肿胀、肢体远端血液循环障碍等并发症。由于实验动物肢体较短、依从性较差，石膏固定不牢靠、经常发生动物啃咬等情况，易造成固定失败。
暴力损伤后外固定：张理平等[30]为了研究中药敷药对膝关节僵硬的治疗效果，对大白兔的右后肢膝关节进行强力的顺时针和逆时针2个方向的扭转各20次(不使关节脱位为度)，并强力揉按膝关节周围软组织20次，连续操作4 d后将膝关节以石膏绷带固定于伸直位，对其皮温、肿胀度以及血液流变学等进行检测，4周后患肢屈伸功能明显障碍，X射线片、血液流变学部分指标均出现与创伤性膝关节僵硬的表现一致的变化，表明膝关节僵硬模型复制成功。王锋等[31]向家兔右膝关节腔内注射自身血液2 mL，以形成全关节积血，再以管型石膏伸直位固定7周，成功复制伸直型膝关节僵硬动物模型。
暴力损伤、强力按摩等损伤方式目前还没有一个量化的标准，在人为操作的过程中，每次的手法、方向与力量都难以统一，会造成损伤的差异性，影响实验结果的发生发展。自身血液注射可以模拟损伤后关节内血性渗出物积存，血液进淋巴循环受阻，组织增生引起的膝关节僵硬，但由于其血液的吸收在个体的差异较大，此方法的使用较少。暴力损伤造成膝关节周围软组织局部损伤出血，可以较好地模拟膝关节周围软组织损伤制动后形成的膝关节僵硬的病理变化过程，此模型在研究膝关节周围软组织损伤后的关节僵硬的中医中药治疗中具有良好的优势。
目前研究者主要采用手术方法和非手术方法进行造模[32-36]。TRUDEL，HILDEBRAND，HAGIWARA此3位学者建立的动物模型方法的影响最大[32-34]，近年来膝关节僵硬模型的建立多在以往研究的造模基础上进行改良，手术的方式以及固定方式都有不同的进步，更加稳定地建立了膝关节僵硬的发生、发展的模型，为其机制以及治疗的研究实现了新的突破。
作者总结了2006-2018年有关膝关节僵硬动物模型特点文章，见表1。



2.2   不同固定方式的比较   无论是手术方法还是非手术方法建立膝关节僵硬模型，都需要通过关节固定来模拟人膝关节损伤后的制动，膝关节周围软组织的损伤以及关节的固定都对膝关节僵硬的发生和发展有重要的影响。适当的固定可以促进膝关节周围组织修复，避免二次损伤，但过度的固定会使局部静脉回流受阻，长时间的制动会造成膝关节周围肌肉、韧带以及关节囊粘连、短缩，应力刺激会引起膝关节周围组织产生适应性变化，固定引起关节僵硬的机制，见图3。



在以往文献报道中构建膝关节僵硬模型过程中膝关节的固定方式主要有钢板-螺钉内固定、克氏针内固定和石膏绷带固定等[12，19，32-34，37]，不同的固定方式都有一定的适用范围，在选择时要根据需要选取最佳的固定方式。手术内固定的模型手术要求高、操作复杂，创伤较大，易感染，但稳定性好、造模时间短，在膝关节僵硬的造模中应用最为广泛。石膏绷带、夹板等外固定操作简单方便，但在动物运动过程中易松动、脱滑，或发生啃咬等现象，造模时间较长，固定易失败。克氏针、钢板及石膏等的刚性固定可能产生较大的机械应力，易发生术后骨折。有证据表明单纯关节制动其生物学变化仍可能被逆转，正常动物单纯关节制动后发生的关节僵硬不能模拟人关节周围和关节内损伤后可能发生的永久性僵硬[32，38]。随着技术的发展，固定方式也逐渐改
进[7，24-28， 32-35，39]，不同固定方式的适用范围，见表2。



2.3   不同固定时间对关节僵硬的影响   据报道，在关节固定2周后，关节周围软组织(韧带、关节囊等)中的生化和形态学发生变化，关节僵硬没有增加，当固定时间延长至6周时，膝关节僵硬增加明显[25，40]。并且有研究者发现即使短期的固定也会造成不可逆的关节软骨损伤[41-43]。ZHOU等[13]将大鼠分为6个不同的制动时间：1，2，4，8，16和32周，实验发现固定4周膝关节活动度受限明显，随着制动时间的增加，关节活动度丢失增加不明显，膝关节僵硬度显著增加。引起固定性关节挛缩的结构主要分为肌肉(肌肉、肌腱、筋膜)和关节(骨软骨、韧带)2个因素。
短期(2周内)固定引起的关节挛缩主要是肌源性的，而长期(2-4周以上)固定主要是关节源性的[11]。通过离断膝关节周围肌肉前后所测得的活动度进行比较，不同的固定时间所产生的关节功能的变化，主要是由于肌源性与关节源性因素之间的关系。关节活动度的限制与僵硬度的增加之间的差异是由于短期制动相关的肌肉限制和长期制动期间的关节限制(如关节囊和韧带)[44-45]。因此，短期的制动引起的关节活动度限制是由于肌肉因素，而长期制动会引起关节结构的变化，从而引起受限角度下的僵硬度增加。王锋[46]发现膝关节总挛缩与肌源性挛缩随着固定时间的延长而有所变化，总挛缩在固定第6周后趋于稳定，但肌源性挛缩程度在固定第2周后趋于稳定。关节僵硬程度、肌肉限制与关节限制比例均与固定时间有着密切的关系。
2.4   固定角度的确定   在膝关节角度固定时，文献中建立屈曲型膝关节僵硬描述的角度多为屈曲135°，145°，150°或完全屈
曲[18，32-33]，也有描述为股骨与胫骨之间的角度45°[12]，部分建立伸直型膝关节僵硬的固定角度为完全伸直。在手术固定时，克氏针的进针位置或钢板螺钉的位置根据动物股骨和胫骨的实际情况进行调整，通常情况在操作时根据股骨纵轴线、腓骨头与外踝尖的连线，角度尺中心置于股骨外侧髁，这两条线所形成的夹角来判定膝关节固定的屈曲角度(股骨与胫骨形成的夹角)，由于操作的不确定性以及动物的生理构造，在实际的测量中也会有一定的误差。在选择固定角度时应根据动物类型以及其骨头大小来进行调整，股骨与胫骨之间的夹角越小，由于内固定的应力和剪切力的作用，发生骨折的可能性会增加。
2.5   模型动物种类的选择   动物模型的选择原则为相关性、适当性和实用性。结合动物的特点和疾病的特征、实验目的与具体情况来选择动物模型是实验成功的重要保证，根据目前对膝关节僵硬动物模型的建立情况，小鼠、大鼠、大白兔、山羊和狗是常用的动物[15，20，32-33，47-48]。其中山羊、狗的膝关节解剖结构与人膝关节具有较高的相似度，关节较大可较清晰地观察关节内组织结构以及生物力学变化，同时其自然位置处于伸直位，是理想的伸直型膝关节僵直动物模型，但这些动物花费成本较高，不易进行大规模实验。小鼠的膝关节结构小、组织少、软骨薄，无论是手术方式还是非手术方式，膝关节的固定都有极大的难度，并且针对小鼠膝关节后期的术后护理、干预治疗都有很大的困难，目前使用较少。大鼠、兔的膝关节相对较经济易得，其膝关节同样具有与人膝关节相似的组织结构，可手术、药物干预[49]，在膝关节动物模型研究中应用较广，是观察膝关节结构病理变化、膝关节生物力学、药效评价及其作用机制研究的理想动物，目前应用广泛。
2.6   造模方式及成功周期   膝关节僵硬动物模型的建立通过手术创伤+固定或非手术外固定的方式来造成关节活动度的丧失，以造成或不造成关节结构的破坏来模拟不同损伤引起的膝关节僵硬。造模的方式不同成功所需要的时间有所差异。最理想的膝关节僵硬造模方式为膝过伸+关节内手术创伤+固定，通过膝过伸损伤关节后囊、在股骨髁开窗模拟关节内骨折，采用克氏针内固定的方式进行造模，固定4周，此方法建模时间短、成功率高。非手术方式中石膏固定需要密切关注固定的松紧度以及固定肢体的血液循环，发现动物的撕咬和脱落情况及时更换，此方法形成关节僵硬模型的耗时较长。模拟不同的损伤造成的关节僵硬也有最适用的造模方式，需要根据预期的实验设计类型来选择合适的造模方法。不同造模方式的成功周期，见表3。

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关节僵硬是指主要指关节的活动范围受到限制，并伴有变形、失用及疼痛等，关节囊或/和关节周围软组织纤维化和短缩，延展性受限或者刚度增加，主动及被动关节活动度(range of joint motion，ROM)受限[1]。对于膝关节僵硬的定义，国内外学者仍有较大争议，国外学者普遍认为膝关节伸膝迟滞> 15°，并(或)屈曲< 75°可判定为膝关节僵硬[2]。膝关节僵硬分为纤维性僵硬及骨性僵硬，其中纤维性僵硬又主要有屈曲型僵硬、伸直型僵硬和混合型僵硬[3]。既往文献指出，膝关节僵硬的发生率在膝关节置换术后为5.3%，韧带重建术后为0%-4%，胫骨平台及膝关节周围骨折术后可高达21.1%[4-6]。
膝关节功能障碍会严重影响患者的生活质量，近年来，膝关节僵硬的病理变化以及治疗的研究得到了学者的广泛关注，但对于其基础研究较少，目前不同的造模方法对关节僵硬的发生以及发展的影响还不明确，缺乏对膝关节僵硬动物模型的研究，所以膝关节僵硬动物模型需要不断完善和改进。该综述根据膝关节疾病的发生发展进行归类总结，以选择更理想的造模方法，为快速准确地选择动物模型提供参考。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

1.1   资料来源   
1.1.1   检索人及检索时间   所有作者在2021年3月进行检索。
1.1.2   检索文献时限   检索时间为2000-01-01/2020-12-31。
1.1.3   检索数据库   中国知网、万方、PubMed和Embase数据库。
1.1.4   检索词   中文检索词：“膝关节僵硬、膝关节挛缩、动物模型、动物实验”；英文检索词：“knee stiffness，stiff knee，contracture of knee joint，stiff knee and animal model”。
1.1.5   检索文献类型   研究原著、综述和病例报告。
1.1.6   检索策略   检索中英文数据库的相关的文献。文献检索策略见图1。

1.1.7   检索文献量   共检索出中文文献2 429篇，英文文献共1 100篇。
1.2   入组标准
1.2.1   纳入标准   ①膝关节僵硬动物实验相关的期刊论文、会议论文及学位论文；②文章涉及膝关节屈曲挛缩或伸直僵硬的造模方法及造模评价的研究。
1.2.2   排除标准   ①发表时间过于陈旧的文献；②数据重复的文献；③与研究内容相关性较差的文献。
1.3   文献质量评估   通过阅读文献的题目和摘要进行初步筛选，通过阅读全文进行二次筛选，最后纳入49篇符合标准的文献进行分析，其中包括中文文献10篇，英文文献39篇。文献质量评估方法依据CAMARADES清单标准，提取文献中动物模型建立的方法。文献筛选流程图，见图2。

膝关节僵硬是膝关节周围骨折或软组织损伤后由于制动引起的常见的功能障碍，严重影响患者的生活质量。在骨科领域中，膝关节创伤后产生的关节僵硬是一个迫切需要解决的难题。近年来，膝关节僵硬的基础研究集中于关节囊、关节软骨以及周围的软组织(主要包括肌肉、韧带和肌腱)的病理变化，挛缩组织中细胞因子及酶的表达，以及其治疗的机制等方面，稳定、理想的膝关节僵硬动物模型的建立是研究的基础和关键。大多数使用非创伤性模型导致的关节僵硬，当固定去除后虽然总的关节活动减少，但这种挛缩是可逆的[28]，这种单纯制动后挛缩的可逆性不能模拟关节周围和关节内损伤后人体关节可能发生的永久性挛缩。目前最常见的造模方式是手术创伤+内固定，即膝过伸造成关节后囊损伤，股骨髁的非软骨面进行开窗，克氏针穿过股骨和胫骨进行内固定的方式造成膝关节僵硬。此种方法的应用最为广泛，造成的僵硬模型解除固定后无法恢复正常，具有较好的稳定性[18]。不同造模方式造成的僵硬模型具有不同的病理发展特点，所累及组织的改变也有所不同，所以在不同的研究中会发现僵硬关节的肌源与关节源成分存在矛盾，缺乏不同损伤形式造成的膝关节僵硬之间差异的研究。
对于膝关节僵硬动物模型的选择，应根据临床的损伤类型选择最佳的造模方式。膝关节周围骨折所引起的膝关节僵硬在临床中较常见，对于不波及膝关节面的下肢骨折引起的膝关节僵硬可以选择关节外损伤手术固定的方式进行造模，对于研究膝关节关节面损伤引起的膝关节僵硬可以选择关节内损伤固定的方式造模，手术固定方法的优点是造模时间短、效率高、稳定性好，但无菌条件要求较高，有术后骨折及感染等并发症的风险，目前在膝关节僵硬的结构变化和药效观察、矫形支具干预方面应用广泛。石膏、夹板等单纯外固定的模型操作简便、避免了手术创伤，在模拟膝关节僵硬的疾病发展方面具有相对的优势，可以观察不同时期关节僵硬的病理变化，缺点是在动物活动过程中外固定易松动、脱滑，或发生啃咬，造模时间较长，固定易失败。暴力损伤后固定可模拟关节周围软组织损伤后制动而引起的膝关节僵硬，适用于保守治疗的疗效和筛选方面的研究。
目前膝关节僵硬模型的建立仍然需要进一步探索，非手术方法固定效果有限，手术方法创伤较大，内固定通常需要二次手术取出，这显著增加了手术感染的风险，需要在术后管理中加入抗生素治疗，近年来有学者提出，在损伤膝关节后囊的同时使用可吸收缝合线对膝关节后侧屈肌缝合，使膝关节处于屈曲位置，此方法造成膝关节僵硬只需要进行一次手术，侵入性较小，降低了手术中感染等并发症的风险，这种非刚性固定减少了骨折的可能，但也使得固定后膝关节的活动度变化较大，其膝关节僵硬的稳定性还缺乏研究，这种思路也确实为膝关节僵硬动物模型的研究提供了新思路，可以从不同角度来完善膝关节僵硬模型的建立方法。
综上所述，膝关节僵硬动物模型在骨科疾病中的研究有重要的意义，需要根据不同的研究目的选择理想的动物模型。造模方式的选择应最大限度地模拟人膝关节僵硬的发生和发展，以不同的损伤类型来确定膝关节固定的方式。但是，目前对于各种模型之间存在的差异还有待进一步探索，可为关节僵硬的分子生物学机制及其治疗方案提供更理想的动物模型平台。 
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

文题释义：
膝关节僵硬：是膝关节周围骨折或软组织损伤后由于制动引起的常见的功能障碍，主要有屈曲型僵硬和伸直型僵硬，表现为膝关节活动度减小，膝关节屈曲或伸直受限，其中以屈曲功能受限最常见，严重影响患者的日常生活和工作。
膝关节僵硬动物模型：目前对膝关节僵硬的发病机制研究较少，对膝关节损伤后最佳制动时间与膝关节僵硬缺乏明确的定论，因此，借助膝关节僵硬动物模型进一步探讨该疾病的发病机制及治疗方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

膝关节僵硬是因创伤、炎症及退行性变等原因所引起的关节组织挛缩、粘连及纤维化，从而导致患者膝关节活动受限的一种常见创伤后功能障碍，严重影响患者的生活质量。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

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