瘦素受体在小鼠皮肤中表达及瘦素受体阳性细胞在皮肤发育和创伤愈合中的作用

doi:10.12307/2022.404

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
瘦素受体：是JAK-STAT家族成员之一，接收和传递来自瘦素的信号，通过结合瘦素并激活JAK2激酶从而磷酸化并激活STAT3发挥信号传导功能，其在骨髓、下丘脑等多个组织中表达。
皮肤创伤愈合：是一个动态而复杂的过程，主要分为止血期、炎症期、增殖期和重塑期4个阶段。在创伤愈合进程中，存在于皮肤中的间充质干细胞发挥着关键作用。

背景：最近研究发现瘦素受体可以标记小鼠成体骨髓间充质干细胞，并参与小鼠骨折后骨的再生和修复，但是皮肤中是否存在瘦素受体阳性间质细胞，以及瘦素受体阳性细胞在皮肤发育和损伤修复中是否有重要作用并不清楚。
目的：探究瘦素受体在小鼠皮肤中的表达以及瘦素受体阳性细胞在皮肤发育和创伤愈合中的作用。
方法：该实验经上海交通大学实验动物伦理与使用委员会批准，批准号为1504002。利用经典的Cre-loxP系统构建LepR-Cre; tdTomato小鼠，示踪瘦素受体在小鼠皮肤中的表达。借助流式细胞仪对Tomato阳性瘦素受体谱系细胞进行细胞表面标记物分析。在LepR-Cre; tdTomato小鼠背部构建全层皮肤切除创伤模型，追踪瘦素受体阳性细胞在皮肤创伤愈合过程中的分布。构建在瘦素受体谱系细胞中特异性敲除Tsc1的LepR-Cre; Tsc1fl/fl小鼠，探究Tsc1对小鼠皮肤发育的影响。
结果与结论：①瘦素受体在小鼠皮肤的真皮乳头、间质和真皮白色脂肪层均有表达；②免疫荧光染色发现瘦素受体可以与间质细胞标记物Vimentin和脂肪细胞标记物Perilipin部分共标。细胞表面标记物分析发现瘦素受体谱系细胞为CD11b-CD45-CD31-，同时表达间充质干细胞标记物CD73、Sca-1，即瘦素受体标记皮肤中的一类间充质干细胞；③LepR-Cre; tdTomato小鼠皮肤打孔的研究发现瘦素受体阳性细胞参与皮肤创伤愈合的进程；④在瘦素受体谱系细胞中敲除Tsc1后，小鼠皮肤真皮层和真皮白色脂肪层厚度增加、脂肪细胞数量增多。总的来说，该研究证实了瘦素受体在小鼠皮肤中表达，且在皮肤中瘦素受体谱系细胞参与组织发育及损伤修复。

https://orcid.org/0000-0001-8670-5746 (王傲)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: LepR 谱系示踪, 间充质干细胞, 皮肤, 真皮层, 真皮白色脂肪, 发育, 创伤愈合, Tsc1

Abstract: BACKGROUND: It is believed that leptin receptor (LepR) marks the adult bone marrow mesenchymal stem cells in mice and LepR+ cells contribute to the regeneration of fractured bone. However, the residence of LepR+ stromal cells in skin and the function of the population in skin development and repair are poorly understood.
OBJECTIVE: To investigate the expression of LepR in mouse skin and the role of LepR+ cells in development and tissue repair.
METHODS: The study was approved by the Experimental Animal Ethics and Use Committee of Shanghai Jiao Tong University with the approval No. 1504002. The LepR-Cre; tdTomato mice were generated by using the classic Cre-loxP system for tracing the expression of LepR in mouse skin. Flow cytometry was used to analyze surface markers on Tomato+ cells. A full-thickness skin excision wound model was constructed on the back of LepR-Cre; tdTomato mice to trace the distribution of LepR+ cells in skin wound healing. The LepR-Cre; Tsc1fl/fl mice for specific deletion of Tsc1 in LepR+ cells were constructed to identify the role of Tsc1 in mouse skin development.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) LepR was expressed in dermal papilla, stroma, and dermal white adipose tissue in mice skin. (2) Immunofluorescence staining revealed that LepR+ cells partially co-expressed with stromal marker Vimentin and adipocyte marker Perilipin. Cell surface marker analysis showed that LepR lineage cells were negative for CD11b, CD45, and CD31, and positive for CD73 and Sca-1. LepR labeled a population of mesenchymal stem cells in mouse skin. (3) Punching experiment of LepR-Cre; tdTomato mice uncovered that LepR+ cells were involved in injury repair. (4) The LepR-Cre; Tsc1fl/fl mice presented the phenotype that the thickness of dermis and dermal white adipose tissue increased and the number of adipocytes increased significantly. It is concluded that LepR is expressed in mouse skin and cells of the LepR lineage in the skin are involved in tissue development and damage repair.

Key words: LepR lineage tracing, mesenchymal stem cells, skin, dermis, dermal white adipose tissue, development, wound healing, Tsc1

中图分类号:

王傲, 褚宏尚, 吴红光, 李科, 刘慧娟. 瘦素受体在小鼠皮肤中表达及瘦素受体阳性细胞在皮肤发育和创伤愈合中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(25): 3993-3998.

Wang Ao, Chu Hongshang, Wu Hongguang, Li Ke, Liu Huijuan. Expression of leptin receptor in mouse skin and the role of leptin receptor-positive cells in skin development and wound healing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(25): 3993-3998.

图/表（结果） 5

2.1 瘦素受体在小鼠皮肤中的谱系示踪首先将LepR-Cre小鼠与Rosa26a-tdTomato小鼠杂交，构建LepR-Cre; tdTomato小鼠[25-26]。取2月龄LepR-Cre; tdTomato小鼠背部皮肤，进行冰冻切片观察Tomato阳性细胞在皮肤中的分布情况，结果显示Tomato阳性细胞存在于小鼠皮肤的真皮乳头、真皮层和真皮白色脂肪层中，见图1A。由于真皮乳头、真皮层和真皮白色脂肪层都属于皮肤间质，由此表明瘦素受体主要标记小鼠皮肤中的间质。Vimentin是一个常用的间质标记物，Perilipin是白色脂肪中脂肪细胞的常用标记物。Vimentin以及Perilipin免疫荧光染色结果显示Tomato阳性细胞可以与少量Vimentin阳性细胞共标，且在Tomato阳性细胞中Vimentin阳性细胞占比为(27.37±5.39)%，见图1B。Tomato阳性细胞与部分Perilipin阳性细胞共标，且共标比例为(25.26±4.54)%，见图1C。由此推测瘦素受体所标记的细胞类群很有可能是皮肤间充质干细胞中的一个谱系。

2.2 LepR-Cre; tdTomato小鼠皮肤细胞表面标记物流式分析谱系示踪实验和免疫荧光染色显示，瘦素受体可能标记皮肤间充质干细胞中的一个亚群。在研究中鉴别一类细胞是否属于间充质干细胞，常常采用流式细胞表面标记物分析。该研究将2月龄LepR-Cre; tdTomato小鼠背部皮肤消化得到分散的细胞，使用经典的间充质干细胞表面标记物和其他间质标记物进行流式分析，结果显示Tomato阳性细胞CD11b、CD45、CD31呈阴性表达(0.67%, 0.97%, 2.60%)。Tomato阳性细胞表达典型的间充质干细胞标记物CD29、CD73、Sca-1(23.7%，47.1%，50.3%)，且间质标记物PDGFRα、PDGFRβ、CD34、CD51呈阳性表达(24.9%，33.3%，61.3%，86.6%)，见图2。之前的谱系示踪实验发现瘦素受体标记皮肤真皮白色脂肪层，而以往研究发现脂肪组织来源间充质干细胞高度表达CD34，这与流式鉴定的结果相吻合。以上结果表明，瘦素受体谱系细胞符合间充质干细胞的特征，并且还表达一些骨髓间充质干细胞标记物和其他常见的间质标记物，由此说明皮肤中瘦素受体阳性细胞属于一类间充质干细胞。

2.3 瘦素受体谱系细胞参与皮肤创伤愈合的进程已知皮肤中的间充质干细胞在创伤愈合中发挥着关键作用，既然瘦素受体可以标记皮肤中的一类间充质干细胞，那么瘦素受体所标记的细胞谱系可能会参与到皮肤损伤修复的进程。因此，为了进一步探究瘦素受体谱系细胞在小鼠皮肤创伤愈合中的作用，该研究利用LepR-Cre; tdTomato小鼠构建小鼠背部直径为5 mm的皮肤全层切除创伤模型(此模型小鼠7 d创伤可以基本愈合)。在对小鼠皮肤打孔后的0 d(未损伤的正常皮肤)以及2，4，6 d分别取伤口部位皮肤，固定包埋进行冰冻切片，结果显示被Tomato红色荧光所标记的瘦素受体阳性细胞在伤口边缘及伤口中央都有分布，瘦素受体阳性细胞在伤口边缘部位增殖并迁移到伤口中央，并且细胞数量随时间逐渐增多，见图3A。通过免疫荧光染色染Vimentin，部分瘦素受体阳性细胞可以与Vimentin共标，即一部分瘦素受体阳性细胞以成纤维细胞的形式参与损伤修复，见图3B。免疫荧光染色显示在创伤愈合进程中瘦素受体谱系细胞表达p-S6，见图3C，在损伤修复过程中瘦素受体谱系细胞的mTOR信号通路被激活。小鼠皮肤损伤后的谱系示踪结果表明，在皮肤创伤愈合后瘦素受体标记的间质细胞被激活，通过增殖和迁移参与真皮层的重建，即瘦素受体谱系细胞参与皮肤损伤后的修复。

2.4 LepR-Tsc1小鼠皮肤真皮层及真皮白色脂肪层厚度增加 mTOR信号通路调节细胞增殖和代谢，已有报道在表皮层中mTOR信号紊乱影响表皮形态发生和表皮屏障的形成[27-28]。为研究Tsc1对皮肤间质细胞的作用，利用LepR-Cre与Tsc1fl/fl小鼠合笼构建了在瘦素受体谱系细胞中敲除Tsc1的LepR-Cre; Tsc1fl/fl小鼠，其皮肤组织学染色及蛋白免疫印迹结果，见图4。

与对照组相比，敲除组小鼠的体型、体质量及生理状态无明显差异且发育正常。取2月龄对照组和敲除组小鼠背部均处于静息期的皮肤，进行组织固定包埋石蜡切片，经苏木精-伊红染色并借助图像软件测量统计，结果显示敲除组小鼠真皮层和真皮白色脂肪层厚度增加，见图4A。Perilipin免疫荧光染色显示敲除组小鼠Perilipin所标记的白色脂肪细胞数量增多，见图4B。免疫荧光染色结果显示敲除组小鼠真皮层中p-S6表达高于对照组小鼠，见图4C。此外，免疫荧光染色结果显示敲除组小鼠p-Erk阳性细胞比例明显高于对照组，见图4D，4E。Western blot检测结果也显示，与对照组相比，敲除组小鼠S6磷酸化水平和Erk磷酸化水平均明显上调，见图4F。以上结果表明，瘦素受体阳性细胞中敲除Tsc1后影响小鼠皮肤的发育，mTOR信号通路和MAPK信号通路激活，真皮层和真皮白色脂肪层结构受到影响。

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引言

瘦素是一种由脂肪组织释放的激素，调节摄食、代谢和免疫等生理进程。瘦素受体(leptin receptor，LepR)是瘦素参与信号转导的受体[1-2]。瘦素受体通过结合瘦素激活JAK2激酶，从而磷酸化并且激活STAT3发挥信号传导的功能[3]。
间充质干细胞是最早在骨髓中分离出来的高度异质且丰富的细胞，可以分化成骨骼、脂肪、软骨、肌肉等多种类型的细胞。间充质干细胞参与维持组织的稳态和损伤修复[4]，此外间充质干细胞也被认为参与构成干细胞的微环境[5]。
研究表明，瘦素受体在骨髓、下丘脑等组织中表达[6-7]。研究者借助谱系示踪证实瘦素受体可以标记小鼠成体骨髓中一类位于血窦和小动脉周围的间充质干细胞[8]。研究发现，瘦素受体阳性间充质干细胞分泌干细胞因子和CXCL12，调控造血干细胞的功能[9-10]。瘦素受体阳性骨髓间充质干细胞处于静息状态，在骨折后作为新生成骨细胞和脂肪细胞的来源参与骨的修复。最新研究发现，在原发性骨髓纤维化的发生过程中瘦素受体阳性骨髓间充质干细胞是肌成纤维细胞的来源[11]，瘦素受体阳性间质细胞对于小鼠拔牙后牙槽骨的再生也十分重要[12]。
皮肤是哺乳动物面积最大的器官，承担着保护、温度调节、感觉等功能[13-15]。皮肤主要分为3层：表皮层、真皮层和真皮白色脂肪层[16-17]。研究表明，在皮肤中也存在间充质干细胞，其在皮肤创伤愈合中发挥关键作用[18]。皮肤中的内源性间充质干细胞包括位于毛囊基部的真皮乳头细胞、真皮鞘细胞、毛囊间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞以及血管周细胞。皮肤创伤愈合是一个动态而复杂的过程[19-20]，可能会激活脂肪组织来源间充质干细胞，有研究也证实在皮肤损伤后骨髓来源间充质干细胞被招募到伤口部位并参与真皮层的重建。
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)属于PI3K相关激酶家族，通过感受外界环境中的营养因子和生长因子，调控真核细胞的生长、增殖和代谢[21]。mTOR参与形成mTORC1和mTORC2两个复合物，mTORC1通过磷酸化S6K、4EBP1、lipin1、ULK1调节蛋白质合成、脂质合成及细胞自噬。mTORC2通过下游的PKC、AKT和SGK调节细胞骨架重塑、细胞生长和增殖、离子转运和细胞存活。mTOR 信号失调与许多疾病的发生有关，包括糖尿病、神经退行性疾病和癌症等[22]。Tsc1是mTORC1的上游基因[23]，结节性硬化症(tuberous sclerosis，TSC)患者的Tsc1或Tsc2基因发生突变，导致mTOR通路异常活跃，患者会出现皮肤损害的症状如色素脱失、鲨革斑和面部血管纤维瘤等[24]。Tsc1与皮肤的稳态、疾病有关。mTOR通路参与代谢调节，与皮肤稳态维持和炎症疾病的发生也相关。
丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是细胞内的一类高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。MAPK信号通路是真核细胞介导胞外信号向细胞内反应的重要信号转导系统，包含Erk、JNK、p38和Erk5信号通路，其中Erk信号通路参与多种生长因子、细胞因子、丝裂原及激素受体活化后的信号转导，调控细胞的生长、增殖和分化，JNK和p38信号通路在炎症、细胞凋亡和应激反应中发挥重要作用。
以往关于瘦素受体阳性间质细胞谱系的研究聚焦于骨髓，对其在皮肤中的表达和作用关注较少，该研究通过构建LepR-Cre; tdTomato小鼠，以探究瘦素受体在小鼠皮肤中的表达和功能。mTOR信号通路在皮肤发育中的作用，尤其是间质细胞中mTOR信号通路激活对皮肤发育的影响研究较少，因此该研究在LepR-Cre; Tsc1fl/fl小鼠瘦素受体阳性细胞中敲除Tsc1，以探究敲除Tsc1基因对小鼠皮肤发育的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计小鼠皮肤未损伤和创伤后的谱系示踪实验以及分组对照小鼠体内实验，运用t检验进行数据分析。
1.2 时间及地点实验于2019年10月至2020年10月在上海交通大学Bio-X研究院骨骼干细胞信号转导实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物实验中所用LepR-Cre、Rosa26a-tdTomato和Tsc1fl/fl小鼠均购买于美国杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)。
实验小鼠饲养在SPF级别的鼠房中，温度湿度保持适宜且恒定，小鼠自由摄取水和食物。实验构建LepR-Cre; tdTomato小鼠3只，LepR-Cre; Tsc1fl/fl小鼠及Tsc1fl/fl小鼠各3只，均为2月龄雄鼠，体质量约为25 g。
1.3.2 实验仪器及设备冰冻切片机和石蜡切片机(LEICA)；磁力搅拌器(Thermo Scientific)；恒温水浴锅(上海精宏)；正置全扫显微镜(Olympus)；荧光显微镜(Nikon)；CytoFLEX流式细胞仪(贝克曼)。
1.3.3 实验主要试剂 p-S6、p-Erk、S6、Erk抗体(Cell Signaling Technology公司)；Vimentin、Perilipin抗体(Abcam公司)；山羊血清(博士德生物)；免疫染色一抗稀释液(碧云天)；DAPI(Thermo Scientific)；荧光封固剂(中杉金桥)；无水乙醇、二甲苯、一水合柠檬酸(国药集团化学试剂有限公司)；二水合柠檬酸三钠(生工生物)。
1.4 实验方法
1.4.1 小鼠谱系示踪为了可视化小鼠体内表达瘦素受体的细胞，借助Cre-loxp系统，将LepR-Cre小鼠与Rosa26a-tdTomato小鼠杂交构建LepR-Cre; tdTomato小鼠。取2月龄LepR-Cre; tdTomato小鼠背部皮肤，进行组织固定包埋冰冻切片，切片厚度为10 μm，在显微镜下观察Tomato红色荧光的标记情况。
1.4.2 流式细胞表面标记物分析取2月龄LepR-Cre; tdTomato小鼠背部皮肤，剪成较小的碎片，在0.1 g/L弹性蛋白酶中37 ℃消化20 min，4 g/L胶原酶Ⅳ消化1.5 h得到分散的细胞，70 μm细胞筛过滤后得到细胞悬液(细胞浓度约为1×1010 L-1)在FACS buffer中与抗体(1∶100)混合，包括CD11b、CD45、CD31、CD29、CD73、Sca-1、PDGFRα、PDGFRβ、CD34、CD51抗体，室温孵育30 min，PBS洗涤后用流式细胞仪进行分析。
1.4.3 小鼠皮肤打孔成年LepR-Cre; tdTomato小鼠麻醉后，剃去背部毛发，用直径5 mm的环形打孔器放置在小鼠背部并穿透至皮肤最底部的肉膜，构建皮肤全层切除创伤模型。
1.4.4 组织固定包埋及切片皮肤组织置于40 g/L多聚甲醛中固定过夜，次日放入体积分数为70%乙醇过夜，浓度梯度乙醇依次脱水，二甲苯透明、浸蜡后包埋。冰冻包埋时，组织于40 g/L多聚甲醛固定过夜后，依次置于20%蔗糖、30%蔗糖过夜，使用OCT包埋，包埋后组织块冻存于-20 ℃，进行石蜡或冰冻切片。
1.4.5 苏木精-伊红染色将Tsc1fl/fl小鼠和LepR-Cre; Tsc1fl/fl小鼠皮肤石蜡切片置于二甲苯脱蜡30 min，浓度梯度乙醇复水，苏木精染色10 min，蒸馏水洗1 min，置于1%盐酸乙醇分化1 s，蒸馏水洗1 min后1%氨水中返蓝30 s，蒸馏水洗1 min，梯度乙醇脱水，伊红染色15 s，体积分数为95%乙醇洗1 min，体积分数为100%乙醇放置3 min，二甲苯透明20 min后用中性树胶封固。
1.4.6 免疫荧光染色将Tsc1fl/fl小鼠和LepR-Cre; Tsc1fl/fl小鼠皮肤石蜡切片65 ℃烘箱烤片1 h，二甲苯脱蜡40 min，梯度乙醇复水，用柠檬酸盐缓冲液99 ℃抗原修复30 min，待冷却至室温后PBS洗2次，体积分数为10%山羊血清封闭30 min，加稀释的Vimentin、Perilipin、p-S6、p-Erk一抗(1∶100)，置于暗盒4 ℃过夜，复温后PBS洗2次，滴加二抗(1∶100)37 ℃孵育1 h，DAPI染色10 min后封固。LepR-Cre; tdTomato小鼠皮肤冰冻切片从-20 ℃拿出复温后蒸馏水洗2次，体积分数为10%山羊血清封闭30 min，之后步骤同石蜡切片免疫荧光染色。
1.4.7 蛋白质免疫印迹提取Tsc1fl/fl小鼠和LepR-Cre; Tsc1fl/fl小鼠皮肤蛋白后，将蛋白加热变性，制备聚丙烯酰胺凝胶，准备电泳缓冲液，上样进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，准备转移缓冲液，取PVDF膜在甲醇中活化，以300 mA恒流转膜120 min，PVDF膜在5%牛奶中封闭1 h，TBST洗3次后分别加入一抗β-actin(1∶5 000)、p-S6(1∶1 000)、S6(1∶1 000)、p-Erk(1∶1 000)、Erk(1∶1 000) 4 ℃孵育过夜，次日洗涤后加入二抗室温孵育1 h显影。
1.5 主要观察指标 ①小鼠皮肤中Tomato红色荧光的表达位置；②Tomato红色荧光与Vimentin、Perilipin标记物的共标情况；③流式分析Tomato阳性细胞常见间质标记物的表达；④小鼠皮肤的组织形态以及真皮层和真皮白色脂肪层的厚度。
1.6 统计学分析所有数据均以x±s表示，数据分析使用Graphpad Prism 8软件处理。组间差异比较采用单因素方差分析，t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

关于间充质干细胞在体内一些组织如骨髓、脂肪中的功能研究十分热门，近年来小鼠体内间充质干细胞标记物的研究也十分广泛，研究报道发现了Prrx1、LepR、Gli1、Grem1等不同组织中的标记物[29-31]。然而，关于皮肤中间充质干细胞标记物的研究还比较少。此前研究者根据Hic1可以标记骨骼肌和心肌中的间充质祖细胞，继而发现Hic1可以标记皮肤中的一类真皮干细胞[32]。鉴于前人发现瘦素受体标记骨髓中一类位于血管周的间充质干细胞[33]，且在体外培养或体内移植瘦素受体阳性细胞后可以分化为骨、软骨和脂肪细胞，因而作者猜测在皮肤中瘦素受体也有表达。通过构建LepR-Cre; tdTomato小鼠进行谱系示踪[34]，发现瘦素受体在皮肤的真皮乳头、间质和真皮白色脂肪层都有表达。这与他人研究发现瘦素受体在骨髓等组织主要标记间质细胞相一致。以往研究显示皮肤内源间充质干细胞位于真皮乳头、真皮鞘、毛囊间真皮、真皮白色脂肪层等，这也与作者的发现大致符合。
在初步发现瘦素受体主要标记皮肤间质细胞后，进一步借助免疫荧光染色证实皮肤中瘦素受体阳性细胞可以与间质标记物Vimentin和脂肪细胞标记物Perilipin部分共标。通过流式分析LepR-Cre; tdTomato小鼠的Tomato阳性细胞表面标记物，发现Tomato阳性细胞CD11b、CD45、CD31为阴性表达，但表达典型的间充质干细胞标记物CD73、Sca-1[35]，此外还表达骨髓间充质干细胞的标记物PDGFRα、CD51[36]。作者还也发现瘦素受体阳性细胞可以与PDGFRβ、CD34、CD51等间质标记物所共标，这与前人研究发现瘦素受体阳性细胞可以表达PDGFRα与CD51相一致[37]。细胞表面标记物分析结果证明，瘦素受体阳性细胞表达典型的间充质干细胞特征的标记物，免疫荧光染色和流式鉴定结果说明在小鼠皮肤中瘦素受体阳性细胞是一类间充质干细胞。
干细胞在组织的稳态维持和组织修复中发挥关键作用[38-40]。研究报道，在器官损伤后位于血管周的间充质干细胞被激活并参与组织的修复和再生。间充质干细胞在损伤修复中以旁分泌的形式促进伤口闭合、血管新生和协调细胞外基质的重塑。用LepR-Cre; tdTomato小鼠构建皮肤损伤模型，谱系追踪后发现瘦素受体阳性细胞在创伤边缘及中央都有分布，并且在损伤后瘦素受体阳性细胞的数量逐渐增加，细胞从创伤边缘逐渐扩展到中央参与创伤修复。免疫荧光染色证实损伤部位瘦素受体阳性细胞与Vimentin、p-S6分别共标，说明在损伤的响应下瘦素受体阳性细胞中mTOR信号通路被激活，可能由此促进细胞增殖参与皮肤结构的重建。以往研究报道，内源间充质干细胞在皮肤打孔损伤后会迁移至创伤中央新形成的真皮层部位分化为成纤维细胞，从而参与损伤修复，这与该研究的结果大致符合。
mTOR信号通路在机体的营养、生长、衰老和疾病中处于中心地位，调节细胞代谢、生长和增殖[41]。Tsc1作为mTORC1的上游基因，与皮肤疾病的发生也有所相关，结节性硬化症患者出现皮肤损害的症状[42]。该研究在瘦素受体谱系细胞中敲除Tsc1，发现敲除组小鼠皮肤真皮层和真皮白色脂肪层厚度显著增加且脂肪细胞数目增多。
免疫荧光染色及western blot检测显示敲除组小鼠S6和Erk磷酸化水平均有明显上调，说明mTOR 信号通路和MAPK信号通路被激活，可能通过调控细胞增殖影响了敲除组小鼠皮肤的结构。以往研究发现 mTOR信号通路对间充质干细胞分化有一定作用，在白色脂肪组织中可以促进脂肪的发生[43-44]，作者猜测可能在敲除Tsc1后mTOR信号通路被激活，促进了真皮层间质细胞和脂肪细胞的增殖增加，导致真皮层变厚、脂肪细胞数量显著增多。
MAPK信号通路参与调节细胞周期，因此作者推测有可能在敲除Tsc1后MAPK信号通路被激活[45]，导致细胞周期调控紊乱，可能因此也促进了皮肤间质细胞和脂肪细胞的增殖，但具体的作用机制还有待进一步研究。
由于间充质干细胞具有易于分离和培养、旁分泌、定向迁移、调节免疫系统和较强分化潜能等特点[46]，在组织工程和再生医学领域逐渐成为关注的热点。在临床实践中，间充质干细胞已被应用于皮肤创伤的治疗，基于间充质干细胞的治疗逐渐成为促进创伤愈合减少瘢痕形成的具有广阔前景的技术[47]。在临床中，间充质干细胞已被用来治疗骨关节炎、心血管疾病、炎症性肠病、慢性创面、神经退行性疾病等[48-49]。临床试验证实间充质干细胞注射对脑卒中、肝硬化、急性心肌缺血、肾移植排斥等具有疗效，相关的临床试验日益增多。间充质干细胞治疗已经从基础研究、动物实验迈向临床转化的新阶段[50]。该研究发现瘦素受体阳性间充质干细胞参与皮肤损伤后的修复，这也为利用间充质干细胞治疗皮肤创伤提供借鉴。
综上所述，瘦素受体在皮肤的真皮乳头、间质和真皮白色脂肪层等表达，在皮肤中瘦素受体阳性细胞是一类间充质干细胞并参与皮肤损伤修复。在瘦素受体阳性细胞中敲除Tsc1导致小鼠真皮层和真皮白色脂肪层厚度增加、脂肪细胞增多，可能是由于mTOR信号通路和MAPK通路的激活导致的。
以上研究发现了皮肤中一类间充质干细胞新的标记物瘦素受体，并研究了瘦素受体在皮肤中的表达和功能，也为Tsc1在皮肤发育中的作用提供了思考，也可能为未来临床实践中利用皮肤间充质干细胞治疗皮肤创伤提供指引。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程