HDAC6蛋白：在运动后0 h的HDAC6蛋白表达较安静对照组显著升高了31.17%(P ≤ 0.05)，接着逐步升高，运动后6 h达到峰值，比安静对照组升高了95.83%(P ≤ 0.01)；运动后12 h相比6 h有所下降(P ≤ 0.05)，但仍比安静对照组高64.33%，比损伤后0 h高25.28%(P ≤ 0.01)；运动后24 h降低到运动后0 h水平，48 h继续降低，低于运动后0 h(P ≤ 0.05)，运动后72 h恢复到安静水平。

LC3Ⅱ/Ⅰ比值：运动后0 h与安静对照组LC3Ⅱ/Ⅰ比值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，运动后3 h较运动后0 h显著升高34.89%(P ≤ 0.01)，运动后6 h比运动后3 h高45.13%(P ≤ 0.01)，运动12 h LC3Ⅱ/Ⅰ比值达到峰值，比运动后6 h高12.64%(P > 0.05)。运动后24 h LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著下降到运动后3 h时的水平，相比运动后24 h，运动后48 h再次降低(P ≤ 0.01)，72 h恢复到安静对照组水平，见表1。

运动诱导骨骼肌损伤往往伴随着延迟性肌肉酸痛和肌力的下降^[1-2]，一般情况下即使不经任何治疗或干预也可自行恢复。但对于运动员来说，这会直接影响运动训练和比赛成绩，还可能加剧损伤，导致形成迁延难愈的慢性症状^[3-4]。骨骼肌蛋白质的降解是发生运动诱导骨骼肌损伤和延迟性肌肉酸痛的主要原因之一^[5-8]。在某一次超出平常习惯负荷的运动后，骨骼肌内质网应激^[9]，作为蛋白质折叠和修饰的场所，内质网应激会导致骨骼肌未折叠和错误折叠蛋白增 加^[10]。错误折叠的蛋白质暴露疏水残基的结构表面，相互吸引形成难溶、难降解、具有细胞毒性的蛋白聚集物^[11-13]。机体内存在3种蛋白质质量控制系统，对错误折叠和未折叠蛋白重新折叠或者降解，分别是分子伴侣系统、泛素蛋白酶体系统和蛋白聚集体自噬^[14-15]。前期研究表明，运动诱导骨骼肌损伤后热休克蛋白表达上调，参与蛋白质的重新折叠^[16]；泛素蛋白酶体途径激活，通过一系列级联反应降解错误折叠的蛋白质，使损伤后紊乱的肌纤维恢复正常^[17]。而未见关于聚集体自噬在运动诱导骨骼肌损伤中作用的研究。

聚集体自噬是一种选择性自噬，是清除蛋白聚集体物的唯一途径，一旦分子伴侣途径和泛素蛋白酶体途径功能受限或是异常折叠蛋白质的清除效率低于生成速率，就会形成蛋白聚集物，需要启动聚集体自噬途径对其降解^[14]。同其他类型的自噬一样，聚集体自噬的特征蛋白为微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)，能够表示自噬体含量的多少。另外组蛋白去乙酰化酶6 (histone deacetylase 6，HDAC6)是聚集体自噬途径中的一个关键蛋白，它是α-tubulin 脱乙酰酶，主要作用是运输蛋白聚集物到微管组织中心形成蛋白聚集体，一方面隔离毒性蛋白聚集物，另一方面在微管组织中心准备招募LC3进行自噬降解^[18-19]。目前运动中骨骼肌聚集体自噬的研究较为罕见，有报道称外周动脉疾病和一次47 min大负荷运动后的骨骼肌中发现了蛋白聚集现象^[20-21]，但并未深入探讨聚集体自噬在此过程中的作用。实验探讨一次大负荷离心运动诱导骨骼肌损伤恢复过程中聚集体自噬的激活程度，分析聚集体自噬在运动诱导骨骼肌损伤中的作用，目的是完善运动诱导骨骼肌损伤的蛋白降解途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年4月至11月在北京体育大学动物房和运动人体科学学院骨骼肌实验室完成。

1.3  材料

实验动物：8周龄SPF级雄性健康SD大鼠64只，体质量(219.62±9.23)g，购于北京维通利华实验技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001。动物饲养和训练于北京体育大学科研实验中心实验动物房，自由进食和饮水，室内温度26 ℃，相对湿度40%-70%，12 h光照周期。适应性喂养3 d后，将大鼠随机分成安静对照组(n=8)和运动组(n=56)，运动组又按运动后时相分为0，3，6，12，24，48，72 h组，每组8只。实验获得北京体育大学运动科学实验伦理委员会批准(2016030A)。

实验用主要试剂和仪器：RIPA裂解液(P0013B)、SDS强裂解液(P0013G)、PMSF(ST506)均购于碧云天；BCA蛋白定量试剂盒(23225，Thermo Fisher)；Anti-HDAC6抗体(ab7254)、Anti-LC3抗体(ab48394)均购自Abcam；Anti-GADPH抗体(TA08，中杉金桥)；酶标仪(xMark)、电泳仪(PowerPac 1645050)、转印槽(MiniTrans 1703930)、凝胶成像系统(GelDoc XR+)都购于美国BIO-RAD公司。

1.4  实验方法

1.4.1  运动方案  采用经典造模运动诱导骨骼肌损伤的离心运动模型^[22]，所有运动组的大鼠进行一次离心运动，运动方案为：速度16 m/min、坡度-16°、时间90 min。正式运动前进行2 d的适应性运动(速度16 m/min，运动时间为：第1天5 min、第2天10 min)和1 d休息。安静对照组大鼠正常活动和饮食，不运动。

1.4.2  样本收集  在运动后相对应的时间点，以3.5 mL/kg的剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠。腹主动脉取血后迅速分离比目鱼肌，剪去筋膜和肌腱后取1 mm×1 mm×1 mm大小的肌腹肉，放入2.5%戊二醛固定液中(4 ℃)，用于电镜检测。用锡纸包裹剩余的肌肉并将其置于液氮中迅速降温，之后转至-80 ℃冰箱中保存，待测蛋白含量。

1.4.3  难溶性的蛋白的提取  参照CAI、JOHNSTON等^{[23- 24]}的方法分离可溶性蛋白和难溶性蛋白。首先将RIPA裂解液与蛋白酶抑制剂PMSF混合，使PMSF浓度为1 mmol/L备用。将肌肉复温，在冰上剪下100 mg，加入1 mL裂解液混合物，剪碎组织，匀浆3次，冰上静置30 min，每10 min涡旋一次。之后使用低温离心机4 ℃ 12 000×g离心15 min，上清液为可溶性蛋白，取走上清液，使用10 mmol/L Tris-HCl和1%SDS沉淀重悬，冰上静置30 min，每10 min涡旋振动一次，在4 ℃ 12 000×g离心15 min，取上清液待测难溶蛋白。

1.5  主要观察指标

透射电镜观察骨骼肌损伤情况：取出戊二醛中固定好的比目鱼肌，用0.1 mol/L的磷酸缓冲液冲洗干净，再用1%锇酸固定，再次冲洗干净后开始乙醇脱水(浓度梯度：50%，70%，90%，100%)，接着用环氧树脂包埋，制成超薄切片，使用透射电镜观察和拍片。每张切片先在500倍下观察，随机拍摄5张照片，之后在2 000倍视野下拍摄超微结构，保存以备分析。

Western Blot技术检测难溶性蛋白中自噬相关蛋白表达：用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，后将所有样本的蛋白浓度调至统一，煮5 min，蛋白样品保存在-20 ℃冰箱待测。蛋白样本进行SDS-PAGE凝胶电泳，之后将胶上分开的蛋白转印至PVDF膜上。丽春红染色观察转印效果，使用TBS洗去颜色之后，以5% BSA-TBST封闭PVDF膜上非特异性结合位点2 h，之后4 ℃过夜孵育一抗：HDAC6(1∶2 000)、LC3(1∶2 000)。次日TBST洗掉多余的一抗，室温孵育二抗90 min(1∶2 000)。ECL法曝光蛋白，保存图片以待分析。使用Image Lab软件分析条带灰度值，以GAPDH为内参，结果用“目的蛋白/内参”与对照组的比值表示。

一次大负荷离心运动会诱导骨骼肌损伤^[4，22]，表现为骨骼肌超微结构紊乱，Z线呈水波样或是彻底崩塌^[25]。Ⅱb型肌纤维在离心运动中Z线损伤程度显著地高于Ⅱa型和Ⅰ型肌纤维^[26]，说明Ⅱb型肌纤维更易造成损伤模型，因此此次实验选择了比目鱼肌典型的慢肌为研究对象。此次实验发现一次大负荷离心运动后，比目鱼肌超微结构在运动后即刻有小部分面积的紊乱，随着时间的延长，紊乱变得严重、紊乱的肌纤维面积逐渐增大，在运动后12 h达到峰值，在72 h完全恢复。该结果与FRIDEN等^[27]对离心运动后骨骼肌超微结构损伤发展的时相略有不同。FRIDEN发现在一次离心运动后1 h出现较少部位的Z线损伤，在第3天Z线损伤程度增加，第6天恢复。原因可能是FRIDEN以人作为实验对象，而此次实验对象为大鼠，种属不同导致的恢复时间有所差异，另外此次实验采用的是下坡跑运动方式，而FRIDEN使用功率自行车的运动方式，2种方式对肌肉的刺激也有所不同。虽然离心运动后损伤发展的时间点有所差异，但根据透视电镜下的组织学结果，显示此次实验一次大负荷离心运动造成运动诱导骨骼肌损伤模型造模成功。

一次离心运动后骨骼肌Z线呈水波状和结构的崩塌，可能因为受损纤维中释放的溶酶体酶引发肌原纤维材料的降解^[26]，有研究证实热休克蛋白和泛素蛋白酶体途径参与损伤蛋白质的降解过程^[16-17]。骨骼肌收缩势必会产生代谢废物，例如活性氧簇的产生，损伤的细胞器聚集或是错误折叠蛋白的积累等^[28]，这些代谢废物可通过细胞自噬转运至溶酶体进行消化降解，实现细胞质量控制^[29]。一次性运动后骨骼肌内质网应激^[9]，未折叠和错误折叠蛋白蓄积，使细胞内极易形成难溶、难降解的蛋白聚集物。MCKENZIE等^[21]在一次大负荷运动后的赛马骨骼肌切片中发现了蛋白聚集物，从而进一步证实了该假设。聚集体自噬是蛋白聚集体的唯一降解途径^[30]，对运动诱导骨骼肌损伤的修复具有重要意义。

LC3是反应自噬的重要指标，自噬激活后LC3的前体首先被Atg4切割，暴露出其羧基末端的甘氨酸残基形成可溶性的LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ蛋白通过处理和脂质共辄修饰成膜结合形式的LC3-Ⅱ，随后LC3-Ⅱ转定位，由弥散分布转至自噬体膜的内外表面。因此，LC3-Ⅱ被认为是自噬体的直接相关标记物，通常用LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ的比值来反映自噬体含量多少^[31]。此次实验结果显示，在一次离心运动后骨骼肌难溶性蛋白中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值一过性的增高，在运动后3 h开始显著升高，12 h达到峰值，之后显著降低，72 h恢复到安静水平。与以往研究有所不同的是，运动后即刻LC3-Ⅱ/Ⅰ比值并未显著升高，这可能与聚集体自噬的特殊过程有关，聚集体自噬识别和包裹的底物是HDAC6运输至微管组织中心形成的蛋白聚集体，此过程需要一定的时间。由HDAC6的结果也可看出，HDAC6蛋白表达和LC3蛋白表达具有时序性，运动后HDAC6和LC3表达一过性增高，HDAC6在运动后6 h达到峰值前，而LC3在运动后12 h达到峰值，这说明HDAC6发生在LC3之前。有前期研究认为，在聚集体自噬发生的过程中HDAC6先将被泛素标记的错误折叠蛋白聚集物(aggregate)转运至微管组织中心，被波形蛋白和角蛋白构成的笼状结构包裹形成蛋白聚集体才能够招募LC3蛋白，随后被双层膜包裹形成自噬体进行降解^[32]。此次实验有力地支持了这一关于运动诱导骨骼肌损伤修复机制的推论。

此次实验中，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值在运动后12 h出现的峰值，与电镜观察到的损伤出现最严重的时间点一致。说明聚集体自噬与骨骼肌损伤之间存在紧密联系，内在的机制很可能是一次大负荷离心运动后蛋白损伤加剧，聚集物蓄积，机体启动聚集体自噬途径，清除毒性的蛋白聚集物，帮助细胞恢复到安静状态。损伤最严重的时刻也是自噬体形成最多的时刻，这是机体应对刺激的正常生理反应，对维持细胞的正常生理功能具有重要意义。

HDAC6蛋白是聚集体自噬过程的关键调节因子^[18]，它通过泛素连接结构域特异性地连接在泛素化的蛋白聚集物上，另一端连接微管的Dynein蛋白，并通过乙酰化α-tubulin运输蛋白聚集物到微管组织中心形成蛋白聚集体^[33]。HDAC6基因的缺失会导致自噬体无法形成，聚集物堆积，是很多由蛋白聚集导致的神经退行性病变的原因^[32]。Parkin蛋白被证实是HDAC6的上游蛋白^[34]，可正向调节HDAC6的蛋白表达。尚画雨等^[35]的研究中发现，一次离心运动后骨骼肌线粒体parkin一过性增高，运动后即刻parkin出现峰值，48 h降低至安静水平，但目前还缺乏运动对HDAC6影响的相关研究。此次实验首次检测了一次离心运动后骨骼肌中参与聚集体自噬的HDAC6蛋白表达，发现在运动后即刻HDAC6显著增高，运动后6 h达到峰值，之后逐渐降低，72 h恢复到安静水平。说明发生运动诱导骨骼肌损伤后，机体通过上调HDAC6蛋白表达来缓解蛋白聚集体异常增多的状况，维持骨骼肌细胞的正常生理功能，是自我保护机制。

实验从聚集体自噬对蛋白质损伤恢复的角度探讨了运动诱导骨骼肌损伤的发生可能的机制，为今后预防和缓解运动诱导骨骼肌损伤，治疗延迟性肌肉酸痛提供了新的方向。在诱导聚集体自噬来对错误折叠蛋白进行清除时，对不同目标蛋白的靶向干预需要考虑时间进程的因素。从此次实验不难发现，HDAC6蛋白表达峰值约出现在发生运动诱导骨骼肌损伤后6 h，而LC3则在12 h左右达到峰值。

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文题释义：
蛋白质质量控制：机体通过分子伴侣系统、泛素-蛋白酶体系统和蛋白聚集体自噬重新折叠或降解未折叠和错误折叠的蛋白质，防止蛋白质聚集产生毒性，避免损害细胞的正常功能。
聚集体自噬：细胞内蛋白聚集体的特异性清除途径是选择性自噬的一种，承担了大部分降解蛋白聚集体的任务，在异常蛋白质量控制系统中起了决定性作用。
组蛋白去乙酰化酶6：是聚集体自噬过程的关键调节因子，它通过泛素连接结构域特异性地连接在泛素化的蛋白聚集物上，另一端连接微管的Dynein蛋白，并通过乙酰化α-tubulin运输蛋白聚集物到微管组织中心，形成蛋白聚集体。

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以往聚集体自噬的研究仅限神经系统疾病和结蛋白肌病中，此次研究通过一次大负荷离心运动诱导骨骼肌损伤恢复过程中聚集体自噬的激活程度，分析聚集体自噬在运动诱导骨骼肌损伤中的作用，首次从聚集体自噬对蛋白质损伤恢复的角度探讨了运动性骨骼肌损伤的发生可能的机制，首次证实了在一次大负荷运动后蛋白损伤，聚集体自噬发生，聚集体自噬途径启动，对其进行降解，为今后预防和缓解运动性骨骼肌损伤，治疗延迟性肌肉酸痛提供了新的方向。

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