2.1  音猬因子-聚多巴胺-纤维蛋白支架的缓释性能  在观察的16 d内，在早期5 d里音猬因子释放缓慢，在第1天支架并未表现出音猬因子突释现象，随后的7 d内呈现快速释放，在最后的4 d里释放完全，在最后1 d支架崩解并表现出释放速度加快，见图1。

2.2  各组大鼠后肢运动功能评分  各组大鼠后肢运动功能BBB评分结果见图2。60只大鼠从术前至术后没有死亡，术前1 d大鼠运动评分都是满分，无缺陷大鼠，术后第1天大鼠都是胸以下截瘫，下肢运动不存在，排尿反射消失，靠双上肢爬行，运动评分为0分。从术后2周开始大鼠下肢运动功能开始恢复，并且C、D组评分高于A组(P < 0.05)；D组术后5-12周的评分高于其他3组(P < 0.05)，B组术后5-12周的评分高于A组(P < 0.05)，C组术后8-12周的评分高于B组(P < 0.05)。

2.3  各组大鼠脊髓损伤处组织学观察结果  苏木精-伊红染色显示，A组断端处有大空洞及纤维瘢痕组织，周边坏死区域大，脊髓明显萎缩变细；B组有较多空泡，其他较A组稍好；C、D组可见新生的神经纤维组织，但C组新生神经纤维组织的量与密度明显低于D组，见图3。免疫组化染色显示，D组髓磷脂碱性蛋白、生长相关蛋白和神经丝蛋白的阳性率高于其他3组，在D组横断处可以观察到大量线性排列的新生神经纤维，胶质瘢痕较其他3组少，见图3。

2.4  各组大鼠脊髓损伤处Western Blot检测结果  D组髓磷脂碱性蛋白、生长相关蛋白和神经丝蛋白表达高于其他3组(P < 0.05)，胶质纤维酸性蛋白表达低于其他3组(P < 0.05)；B、C组4种蛋白表达与A组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，并且B、C组4种蛋白表达比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

脊髓损伤造成的感觉及行动能力丧失造成了患者生活质量的严重下降，目前迫切需要有效的治疗方式。从病理学角度看，脊髓损伤由原发性损伤及其引起的继发性损伤导致。原发性损伤是急性损伤，主要是挤压、错位等机械力造成的急性损伤，包括损伤部位神经元、胶质细胞及血管破裂^[1-2]；而由原发性损伤引起的一系列生化事件导致了继发性损伤的发生，包括损伤部位缺血、水肿、炎症反应、氧化自由基生产、凋亡反应等^[3-4]，造成局部正常神经病变，加重损害^[5]，脊髓损伤处的微环境不利于神经元分化^[6]。这一系列事件最终造成损伤部位神经元轴突退化、髓鞘丢失、炎症细胞迁入，形成空穴，星形胶质细胞激活并围绕损伤部位形成胶质瘢痕。原发性损伤造成的神经断裂及继发性损伤导致的胶质瘢痕形成，使得原有神经功能丧失及损伤修复被抑制，最终导致原有的感觉及自主活动能力丧失^[7]。

目前治疗脊髓损伤的方法在于应用多种技术手段，如病毒转染神经干细胞移植、神经营养药物、康复锻炼等，但效果有限且负作用大^[8]。近年组织工程学通过种子细胞联合支架材料及各种因子制备成的支架来修复脊髓损伤，通常选用如神经干细胞这样可以向神经细胞分化的干细胞；支架的材料选择则多样化，通常包括合成可降解及不可降解生物材料、天然复合物等^[9-11]。纤维蛋白是人肝细胞合成的蛋白质，具有凝血作用，纤维蛋白与凝血酶通过级联反应形成纤维蛋白胶，纤维蛋白胶可包裹药物，作为载体在体内缓释，已被用于治疗脊髓损伤^[12-13]。目前常用的方法是将包裹药物的纤维蛋白胶填充在损伤处，但其缺乏机械强度，并且再生的轴突无法突破凝胶，具有局限性，无法使恢复效益最大化。近来应用纤维蛋白胶直接填充损伤处的研究表明，脊髓会因胶量过大产生挤压变形，因而对如何使用纤维蛋白胶及控制纤维蛋白胶浓度存在争议^[14-15]。音猬因子由腹背侧神经管产生，能促进神经管和神经间突触的形成，有对神经系统发育分化的具有调控作用^[16-17]。在自然界里贻贝类生物通过分泌足丝蛋白将其自身牢牢固定在岩石及船只上，而多巴胺是足丝蛋白的关键作用成分，其对黏附的对象几乎无选择性，并且多巴胺作为连接层可以再次发生反应，将有功能的分子固定在材料表面^[18]。多巴胺还是中枢神经系统的一种主要神经递质，在脊髓发生损伤后其内行途径受损，进而导致骨质疏松、排尿反射延迟建立等不良后果^[19]。已有研究表明，多巴胺可以减轻脊髓损伤的严重程度，并改善脊髓损伤后的神经功能恢复，在发生急性脊髓损伤后常使用多巴胺升压来控制神经源性休克^[20-21]，而慢性神经痛常见于脊髓损伤后，其发生的机制与多巴胺能神经活性降低相关^[22]。多巴胺涂层的本质是多巴胺在pH=8.5的氨丁三醇溶液中发生自聚合，形成有强黏附的聚多巴胺^[23]，聚多巴胺作为涂层材料已被广泛应用于组织工程及工艺制造，聚多巴胺涂层后的材料呈现缓慢释放特性，可作为药物输送材料^[24-25]。因此，进一步了解组织工程支架联合因子对脊髓损伤的修复作用值得研究。实验将多巴胺涂层后缓释的音猬因子纤维蛋白支架植入大鼠脊髓横断模型中，通过后期运动功能及损伤处组织学观察来评估脊髓损伤修复效果，为临床治疗提供思路。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  动物对比观察实验。

1.2  时间及地点  实验于2019年3至9月在江苏大学完成。

1.3  材料  纤维蛋白原和凝血酶购于沈阳拜英生物公司；盐酸多巴胺(异体)购于国药集团；鼠源音猬因子购于武汉艾美捷科；兔抗GAP43、小鼠抗GFAP、MBP、NF200、tublin购于武汉博士德；音猬因子ELISA试剂盒购于ABcam。

实验动物：8周龄雌性SD大鼠60只，体质量200 g左右，购于江苏大学实验动物中心，许可证号：SYXK(苏)2018- 0053。动物实验经江苏大学动物实验伦理委员会批准。

1.4  方法

1.4.1  制备脊髓损伤修复支架

纤维蛋白支架：使用真空冷冻干燥机制作纤维蛋白支架^[26]。选取大小合适的硅胶管，剪成长度大约3 cm后使用封口膜封闭一端口，高压后取出。将配好的纤维蛋白原及凝血酶注入硅胶管，随后置入-80 ℃冰箱内过夜，次日取出，置入冷冻干燥机内真空冷冻干燥24 h。

聚多巴胺-纤维蛋白支架：取纤维蛋白支架，选取合适部位截取5 mm长度，将其浸泡在PBS配置好的质量浓度为2 g/mL的盐酸多巴胺(pH=8.5)溶液中24 h，待模具表面完全变黑即完成多巴胺涂层，取出即为纤维蛋白-聚多巴胺支架。

音猬因子-聚多巴胺-纤维蛋白支架：将纤维蛋白-聚多巴胺支架置入质量浓度为200 mg/L的音猬因子溶液中，交联吸附24 h后取出，即为音猬因子-聚多巴胺-纤维蛋白支架。

1.4.2  音猬因子-聚多巴胺-纤维蛋白支架的药物释放  在无菌大皿中加入消毒乙醇，将制作好的支架放入大皿中，并将大皿置于紫外线下照射6 h，重复3次后支架即可使用。将支架放入加有4 mL PBS的离心管内并放置于摇床上，设置摇床摇速80 r/min，16 d内每天取上清液，每个时间点均将离心管内的PBS取完并新添加4 mL PBS，使用ELISA试剂盒测定音猬因子浓度，计算出累计药物释放率^[27]。

1.4.3  建立大鼠脊髓损伤模型及分组  将60只SD大鼠随机分A、B、C、D组，每组15只。A组仅行脊髓横断，B组脊髓横断处植入纤维蛋白支架，C组脊髓横断处植入聚多巴胺-纤维蛋白支架，D组脊髓横断处植入音猬因子-聚多巴胺-纤维蛋白支架。

术前一晚大鼠禁食，手术日禁水。7%水合氯醛腹腔麻醉后备皮消毒，操作台消毒后置于超净台中操作，定位T₁₂椎体(位于大鼠棘突最高点)后行腰背部正中切口，逐层切开，分离肌肉和椎骨，并用咬骨钳咬去椎板和棘突，除去硬脊膜，暴露脊髓，使用刀片横断T₁₀-T₁₁节段脊髓，造成完全的脊髓横断，将上述的3种支架植入断端，逐层缝合肌肉、筋膜、皮肤。手术结束后腿部肌肉注射青霉素预防感染，早晚各1次，持续10 d左右。大鼠分组分笼照顾，每隔8 h膀胱按摩一次，以辅助大鼠排空膀胱，直至其恢复自主排尿。

1.4.4  大鼠下肢运动功能评价  术后12周内，每周对大鼠后肢进行运动功能BBB评分，观察大鼠臀、膝、踝及躯干运动和协调情况，满分为21分，评分取均值，每次评分   10 min以上，观察后肢运动功能恢复情况^[28]。得分越高功能恢复越好。

1.4.5  组织学观察  术后12周，每组随机取20只大鼠行心脏灌注。10%水合氯醛麻醉，剖腹后找到大鼠肝叶，用组织剪剪开肝叶，随后沿大鼠胸腔分离出心脏，暴露心尖部后，将穿刺针头插入大鼠心脏后顺入主动脉弓，50 mL针筒快速抽取生理盐水打入心脏，观察到血液从肝叶流出即可，生理盐水注入量以肝叶处无红色液体流出为止。50 mL针筒抽取40 g/L多聚甲醛进行心脏灌注，观察大鼠四肢强直僵硬，直至大鼠尾巴僵硬为止。用组织剥离器械剥离出横断脊髓上下1 cm左右的脊髓组织，送病理室切片处理。

苏木精-伊红染色：取脊髓组织块，固定后石蜡包埋，5 µm切片，随后用二基苯脱蜡，各级乙醇水洗，苏木精染色，自来水冲洗，盐酸乙醇分化半分钟，50 ℃温水浸泡   5 min，放置于伊红液中2 min，常规脱水、透明、封固，显微镜下观察切片。

免疫组化染色：取脊髓组织块，固定后石蜡包埋，5 µm切片，随后用过氧化氢封闭10 min，蒸馏水冲洗2次，每次5 min；随后使用抗原修复液修复抗原，将切片置于摇床上，使用PBS洗2次，每次5 min；取出切片，置于37 ℃温箱中加二抗封闭15 min，随后加一抗(兔抗GAP43、小鼠抗GFAP、MBP、NF200)，于4 ℃冰箱过夜，次日使用PBS冲洗2次，每次5 min；加入生物素化的二抗，孵育40 min，PBS冲洗2次；滴加SAB复合物，孵育40 min，随后PBS冲洗2次；DAB显色，自来水冲洗，随后使用苏木精复染30 s，自来水冲洗约15 min，使用乙醇脱水，二甲苯透明，封固，显微镜下观察髓磷脂碱性蛋白、生长相关蛋白和神经丝蛋白表达。

1.4.6  Western Blot检测脊髓组织蛋白表达  术后第12周，每组随机取5只大鼠，提取脊髓损伤处组织蛋白，PBS冲洗3次，置于滤纸上控干后称质量，将蛋白置于大皿中置于冰面上进行操作，在大皿中加入1 mol/L的蛋白酶抑制剂，再根据脊髓质量加入细胞组织快速裂解液，比例为    1 000 mL/80 g；用组织匀浆器研磨组织，放置在冰面裂解45 min，接着用超声机粉碎组织，加入2×loading buff摇匀后用开水煮10 min，12 000 r/min高速离心；取出上清液，置于-80 ℃冰箱冻存备用。常规配胶(10%)、电泳、转模、封闭、一抗(兔抗GAP43、小鼠抗GFAP、MBP、NF200、tublin)，4 ℃过夜，抗体浓度1∶300(抗体稀释液)。次日TBST洗去一抗，洗3次，每次15 min，并更换TBST，二抗孵育，抗体浓度选用1∶5 000(抗体稀释液)，随后置于20-30 ℃孵育2 h，TBST清洗，洗涤后采用化学发光成像仪进行成像分析。用Image J测条带灰度值，计算出目的蛋白髓磷脂碱性蛋白、生长相关蛋白和神经丝蛋白的灰度比。

1.5  主要观察指标  各组大鼠下肢运动功能BBB评分及脊髓损伤处组织学观察与Weston blot检测结果。

1.6  统计学分析  利用SPSS 22.0软件对数据开展统计学处理。以x(_)±s分析数据，免疫印迹组间比较和下肢运动功能评分组间分析比较都用单因素方差的方法。以P < 0.05 为差异有显著性意义。

与单纯纤维蛋白支架相比较，采用多巴胺交联的纤维蛋白支架具有更好的缓释性能与机械强度。单纯纤维蛋白支架在体内的降解时间大约7 d，因子缓释时间较短^[29]，且未使用冻干机处理过的纤维蛋白胶呈果冻样，水分含量较高，注入大鼠脊髓断端凝固后本身不利于脊髓再生轴突的通过，且由于其机械强度较低，在进行大鼠肌肉缝合时很容易受压而破碎，破碎的胶体对脊髓可能造成二次损伤和压迫，不利于脊髓的修复。使用冻干机处理后的纤维蛋白支架不仅保留了其原有的三维孔道^[26]，并且控制其大小与脊髓粗细相一致。已有研究通过在聚苯乙烯微球表面进行多巴胺涂层修饰获得了载药微囊，后续通过在聚苯乙烯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物材料表面使用多巴胺涂层固定神经生长因子，从而提高神经干细胞的增殖、分化^[30-31]。因此将冻干后的纤维蛋白支架给予多巴胺涂层修饰，多巴胺本身的胶水作用提高了支架吸附因子的能力，增加了对因子的黏附性，从而增加了载药量，且多巴胺在纤维蛋白表面发生二次反应形成聚多巴胺，进一步增加了支架的机械强度。多巴胺涂层后的支架与机体有良好的相容性，其无毒性已得到广泛认可，具有良好的生物性能^[24]。在术后辅助大鼠排尿时发现，用多巴胺涂层后支架的两组自主恢复排尿时间较另外两组提前，侧面印证了多巴胺调节膀胱反射，恢复大鼠排尿反射^[19]，其作用机制与信号通路值得进一步研究。涂层后的支架将因子吸附在支架表面，并且纤维蛋白胶本身的多孔道内也吸附了大量因子，这有效延长了因子的作用时间，加强了脊髓修复效果。

目前针对脊髓损伤患者的治疗方案众多，其中干细胞与营养因子移植一直是研究的热门，但由于其移植后低存活率与作用时间短，效果有限^[32]。近来动物实验通过将组织工程材料与干细胞或因子复合来改善损伤处的微环境，增加作用时长，显著提高了恢复效果与预后^[33]。

生长相关蛋白是一种轴突膜蛋白，参与突触发育形成和神经细胞再生，可通过免疫组织化学观察生长相关蛋白的阳性率来观察断端是否有新生突触^[34]。实验将涂层多巴胺的纤维蛋白支架植入大鼠脊髓损伤处，既能改善损伤局部微环境、减少二次损伤，又能有效延长因子释放时间。术后第12周，音猬因子-聚多巴胺-纤维蛋白支架组生长相关蛋白、神经丝蛋白、髓磷脂碱性蛋白阳性细胞较多，而胶质纤维酸性蛋白阳性细胞少，损伤周围少有纤维空洞，可见连接成丝状的新生神经纤维；而单纯脊髓损伤组断端有较大空洞，萎缩明显，神经丝细胞、髓磷脂碱性蛋白、轴突膜蛋白阳性率低，胶质纤维酸性蛋白表达高，形成胶质瘢痕；纤维蛋白支架组断端处空泡较多，聚多巴胺-纤维蛋白支架组较纤维蛋白支架组与单纯脊髓损伤组纤维瘢痕与空洞减少，可见新生的神经纤维连接，但新生量少于音猬因子-聚多巴胺-纤维蛋白支架组。免疫组化结果与Western Blot检测结果一致。音猬因子对神经纤维溃变起保护作用，可催化神经轴突生成与防止神经元凋亡，刺激星形胶质细胞生长分化^[35]，并趋化神经元的分化与成    熟^[36-37]，保护脊髓。音猬因子-聚多巴胺-纤维蛋白支架组术后大鼠下肢运功功能评分高于其他组。音猬因子-聚多巴胺-纤维蛋白支架的优点在于涂层后的支架有良好的生物相容性，提高了局部药物浓度，增加了缓释时间。

实验有部分需要深入研究的内容：①选取合适的干细胞接种在三维支架内，以提高脊髓损伤的修复效果；②如何进一步提高支架的强度及延长支架的降解时间来更长久的促进损伤修复，仍是组织工程学的一大难题；③只采用了单一因子，应考虑采用多种因子联合作用来提高修复效果，如加入神经营养因子、硫酸软骨素、db-cAMP等已经证实能促进脊髓损伤修复的因子^[38-40]，但其作用是否协同还有待考证；④多巴胺是作为黏附在纤维蛋白胶外的一层胶水，能否考虑使用水凝胶、纤粘蛋白等进一步加强支架的强度，以增加载药量与缓释时间；⑤随着纳米材料的发展与应用，不妨考虑应将纳米材料与因子混合，或者利用组织工程技术改进支架的几何特点，从而更大限度地发挥作用，如何能把组织工程学与纳米材料结合运用到临床上是个很大的挑战；⑥仅采用了音猬因子这一因子的产物，应考虑将转病毒后音猬因子转染到干细胞中，并使干细胞在三维支架中爬行生长，在植入横断脊髓后能源源不断的产生促进脊髓组织修复所需的因子，甚至创造出良好的局部环境以助损伤修复。

综上，音猬因子-聚多巴胺-纤维蛋白支架支架植入大鼠脊髓断端明显促进了损伤的修复，也为如何运用组织工程来进一步提高临床脊髓损伤的治疗与预后提供了思路。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

音猬因子：由腹背侧神经管产生，主要作用是调控神经分化、促进轴突形成。已有研究白表明其通过影响髓磷脂碱性蛋白、生长相关蛋白和神经丝蛋白的高表达量来促进脊髓损伤的修复，是近年来脊髓损伤研究的热门因子。

聚多巴胺：是中枢神经的一种递质，由多巴胺在弱碱性条件下发生的氧化自聚合，广泛参与机体各类调节，具有超强的黏附性能，现已被广泛应用于各类材料的涂层中。将其应用于组织工程材料表面可增加材料的强度与黏附性能，是组织工程研究的热门材料。

实验通过采用冷冻干燥机制作出支架模具，并使用聚多巴胺交联的方法，使模具机械强度与载药量较以往纤维蛋白支架有明显提升，且与因子交联后的支架缓释性能良好，无因子突释现象，在最终支架崩解时有因子加速释放，其缓释的时间较单纯的纤维蛋白胶已延长1周左右，且聚多巴胺的存在本身对脊髓损伤产生的排尿反射重新建立，骨质疏松的缓解都有促进作用，选用聚多巴胺纤维蛋白支架生物相容性好，无细胞毒性，不存在因子浓度过高及材料大小不符等因素对脊髓造成二次损伤。