2.1  转化生长因子β3/PLGA微球的形态观察与粒径分布  扫描电镜显示微球呈球形，表面光滑，无粘连，粒径均匀分布，见图1a；微球表面光滑，偶见小孔分布于表面，见图1b；同时使用软件Nanomeasure1.2对127个微球直径进行统计分析，结果表明微球直径大多为2-50 μm，其中以10-30 μm最常见，见图1c。

2.2  转化生长因子β3在PLGA微球中的分布情况  当激发光波长为415 nm时，微球呈现均匀的蓝色，当激发光波长为505 nm时，微球呈现均匀的绿色，见图2a和2b。当激发光为565 nm时，微球呈现球形红色，分布均匀，见图2c；并且通过荧光共聚焦显微镜三维重建，可以看到立体的红色微球，说明药物在微球中均匀分布，见图2d。因此，直观的证实了转化生长因子β3在PLGA微球中均匀分布，并且PLGA微球在不同的激发光波长(如415/505 nm)，可以显示不同荧光。

2.3  转化生长因子β3/PLGA微球的包封率和载药量  通过间接法测量PLGA微球的包封率与载药量，其结果如表2所示。与0.5 μg投料量相比，当投料量为1，5，10 μg时其包封率升高，当投料量为2 μg或20 μg时其包封率无明显变化(P > 0.05)。总的来说，当转化生长因子β3投料量从0.5 μg增加到20 μg时，PLGA微球均显示出较高的包封率与载药量，其包封率均在90%以上。

2.4  转化生长因子β3/PLGA微球的体外释放与降解特性  降解1 d后，微球表面光滑，无粘连，见图3a。降解1个月后，微球表面开始呈现小坑洞，这是由于PLGA微球表面的药物纳米液滴水相立即溶解在PBS溶液中导致的，见图3b。降解3个月后，微球形态更加不规则，开始出现粘连，且微球周边开始出现降解后碎片，见图3c。这种情况在降解3个月后更加明显，微球之间出现明显粘连，微球形态更加不规则，见图3d。在降解6个月后，所有微球都降解为碎片，隐约可见微球轮廓，见图3e。如图3f所示，在前1周内转化生长因子β3/PLGA微球突释累积释放达到  30 ng，随后微球缓释进入缓慢线性释放期，可缓慢释放长达45 d。

2.5  转化生长因子β3/PLGA微球对细胞增殖的影响  培养1，3，5 d后，细胞数量明显增多，见图4。10 μg/L微球组不同时间点的吸光度值与阴性对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，说明10 μg/L转化生长因子β3并无促进脂肪间充质干细胞增殖的作用；空白微球组不同时间点的吸光度值与阴性对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，说明空白PLGA微球无细胞毒性，同时也没有促进脂肪间充质干细胞增殖的作用；同样，10-1 000 g/L的转化生长因子β3/PLGA微球对脂肪间充质干细胞增殖无影响，见图4。

2.6  转化生长因子β3/PLGA微球对细胞迁移的影响  阴性对照组与空白微球组细胞迁移最少，且二者之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；与阴性对照组相比，10 μg/L转化生长因子β3可促进脂肪间充质干细胞的迁移(P < 0.05)；与阴性对照组相比，10，100，1 000 g/L转化生长因子β3/ PLGA微球可促进脂肪间充质干细胞的迁移(P < 0.05)，但是这3组之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。因此，适量浓度的转化生长因子β3具有促进脂肪间充质干细胞迁移的作用，转化生长因子β3/PLGA微球通过缓释转化生长因子β3因子来促进脂肪间充质干细胞的迁移。

关节软骨损伤是一种常见的运动损伤，随着体育活动参与度的增加和年龄的增长，关节软骨损伤的发病率逐渐上升^[1]。由于关节软骨缺少血管和神经，一旦损伤难以自行修复^[2-3]。如果缺乏有效及时的处理措施，关节软骨的损伤会导致严重的关节退行性疾病(如骨关节炎)，严重影响患者的生活质量。组织工程技术的发展为关节软骨损伤再生修复带来了新的希望^[4]。组织工程的关键要素包括支架、种子细胞和细胞因子^[5-6]，因此选择合适的细胞因子用于关节软骨损伤的再生修复是很有必要的。

转化生长因子β3是软骨组织形成的关键调节因子，可以促进间充质干细胞迁移并诱导其向软骨组织分化与成熟，促进软骨缺损的愈合^[7-9]。由于转化生长因子β3在体内半衰期短，很容易被蛋白酶降解，而且对于较大的软骨缺损无法在有效的时间内发挥生物活性，从而影响了其体内修复效果。故研究可局部释放并长期保持其生物学作用的缓释载体具有重要的理论和应用价值。聚乳酸-羟基乙酸(polylactic acid-glycolic acid，PLGA)属于FDA批准的可生物降解聚合物，安全无毒，具有可控的降解性和良好的生物相容性，被广泛应用于医药领域。而微球载体是解决体内药物半衰期短且易被代谢的方法之一，PLGA微球被广泛应用于小分子药物、蛋白质和其他大分子药物的可控持续释放。因此，应用可降解高分子材料PLGA负载转化生长因子β3制备出缓释微球，为其长效利用提供可行性^[10-11]。PLGA微球在体内缓慢降解过程中将包裹的转化生长因子β3逐渐释放到周围软骨组织中，在一定时间内保持有效的作用浓度，促进组织的修复^[1，12]。然而，转化生长因子β3促进组织修复的机制复杂，目前大多数学者侧重于其对间充质干细胞的分化研究，鲜有文献报道其对间充质干细胞的增殖性及迁移的影响。

因此，实验通过优化PLGA微球制备工艺，并对微球的形态、粒径大小、药物空间分布、包封率、载药量、降解性和缓释性能进行系统性表征，同时在体外着重探究其药物释放动力学与转化生长因子β3对兔脂肪间充质干细胞增殖和迁移调控之间的联系，为临床治疗软骨损伤提供精准性研究与理论依据。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  体外观察性实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年11月至2019年10月在解放军总医院骨科研究所完成。

1.3  材料

实验动物：1月龄新西兰大白兔4只，雌雄不拘，体质量约1 kg，均购自中国人民解放军总医院实验动物中心，许可证号：SCXK(京)2019-0015。实验方案经中国人民解放军总医院动物实验伦理委员会批准。

实验用主要试剂和仪器：PLGA(75∶25；相对分子量60 000，济南岱罡生物科技有限公司)介绍见表1；聚乙烯醇(相对分子质量67 000，阿拉丁公司，美国)；转化生长因子β3(近岸蛋白质科技有限公司，中国)；山羊抗小鼠IgG/alexa fluo594二抗(中杉金桥，中国)；Transwell小室(corning公司，美国)；牛血清白蛋白(sigma公司，美国)；胎牛血清(Corning公司，美国)；酶联免疫吸附试剂盒(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA，R&D system公司，美国)；DMEM/F12(Corning公司，美国)；CCK-8试剂盒(同仁公司，日本)； 结晶紫(Sigma-Aldrich公司，USA)；超声波破碎仪(Qsonica，美国)；冷冻干燥机(北京博医康技术有限公司)；扫描电子显微镜(Hitachi S-4800型，日本)；荧光倒置显微镜(Olympus公司，日本)；CO₂培养箱(Heraeus公司，德国)；EPOCH TAKE 3酶标仪(Bio Tek公司，美国)。

1.4  实验方法

1.4.1  转化生长因子β3/PLGA微球的制备  采用乳化-溶剂挥发法制备转化生长因子β3/PLGA的生长因子缓释微  球^[13-16]。具体过程如下：取适量的转化生长因子β3溶于   100 μL去离子水中，作为内水相。将PLGA溶于二氯甲烷中，制备质量浓度60 g/L的PLGA溶液，作为油相。将聚乙烯醇溶于去离子水中，制备质量浓度10 g/L的聚乙烯醇水溶液，作为外水相；将100 μL内水相加入到2 mL油相中，冰浴中用美国Qsonica Q125型超声波破碎仪探头以60%振幅(超声功率为75 W)震荡30 s形成初级乳液；再将初级乳液加入20 mL外水相中，室温(20-25 ℃)下500 r/min磁力搅拌24 h，挥发除去二氯甲烷，得到微球溶液；再将微球溶液在离心半径为16 cm的离心机中2 000 r/min离心3 min，弃上清得到初始微球，用去离子水反复清洗3次，之后在-20 ℃冷冻干燥24 h，即得到生长因子缓释微球，于-20 ℃保存备用。

1.4.2  转化生长因子β3/PLGA微球形态观察与粒径分布  取适量转化生长因子β3/PLGA微球置于导电胶上，并经表面喷金处理，采用扫描电子显微镜观察微球的形态特征。采用软件nano measure1.2对微球粒径分布进行统计(n=127)。

1.4.3  模拟转化生长因子β3在PLGA微球中分布情况  使用山羊抗小鼠IgG/alexa fluo594二抗模拟转化生长因子β3，探究药物在PLGA微球中的分布情况。具体步骤是将1.4.1中转化生长因子β3换为7.5 μg山羊抗小鼠IgG/alexa fluo594二抗，避光制备出荧光微球，并在荧光倒置显微镜及共聚焦显微镜下以415，505，565 nm 的波长观察荧光微球中药物分布情况。

1.4.4  转化生长因子β3/PLGA微球的包封率和载药量  取微球溶液离心后的上清，使用ELISA测定上清液的吸光度值，根据标准曲线方程分别计算上清液中转化生长因子β3的浓度及质量，再使用下列公式计算生长因子缓释微球中转化生长因子β3的包封量及包封率。共测定3次，结果取平均值。包封率=微球中转化生长因子β3的质量/转化生长因子β3的总质量×100%；载药量(µg/g)=微球中转化生长因子β3的质量/微球的质量；微球中转化生长因子β3的质量=转化生长因子β3的总质量-上清液中转化生长因子β3的质量。

1.4.5  转化生长因子β3/PLGA微球的体外释放与降解特性  取5 mg转化生长因子β3/PLGA微球(载药量为   37.44 µg/g)粉末于1.5 mL EP管中，加入1 mL含有0.1%牛血清白蛋白的PBS溶液，置于37 ℃恒温摇床中以60 r/min震荡，分别于1，4，7，14，21，44 d收集上清液，使用ELISA测定上清液中转化生长因子β3的含量。共测定3次，结果取平均值；分别于1 d、1个月、2个月、3个月和6个月，使用扫描电镜观察微球降解后的形态。

1.4.6  脂肪间充质干细胞的分离培养  取1月龄新西兰大白兔膝关节腔内髌下脂肪垫，按照文献[17-18]方法进行脂肪间充质干细胞的分离、传代、培养，将第3代脂肪间充质干细胞于液氮中冻存备用。使用流式细胞仪对脂肪间充质干细胞进行表面特异性抗原鉴定^[18]。

1.4.7  转化生长因子β3/PLGA微球对细胞增殖的影响  将第4代脂肪间充质干细胞以3 000/孔的密度接种于96孔板，每孔100 μL，在含有体积分数1%胎牛血清的DMEM/ F12培养基中培养2 h，移去培养基后加入不同组的培养基。实验分6组，分别加入DMEM/F12培养基(阴性对照)、含转化生长因子β3的培养基、含空白聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的培养基、含10，100，1 000 g/L转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的培养基，培养基体积为100 μL，其中PLGA微球载药量均为194.80 µg/g。将培养板置于37 ℃ 体积分数5%CO₂的培养箱中培养1，3，5 d后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h后在450 nm酶标仪测量吸光度值。每个样品重复5次，结果取平均值。

1.4.8  转化生长因子β3/PLGA微球对细胞迁移的影响  取出24孔板，插入Transwell小室，将DMEM/F12培养基加入到下室和上室，放入37 ℃恒温箱过夜孵育，然后移除培养基。实验分组同1.4.7，下室每孔加入0.6 mL各组分培养基，然后插入Transwell小室，再将0.1 mL(5×10⁴/孔)的脂肪间充质干细胞加入到上室中，放入到37 ℃恒温箱中孵育24 h。用棉签小心地刮掉上室中的非迁移细胞并用PBS洗涤，使用40 g/L多聚甲醛固定下侧出现的迁移细胞30 min。用0.1%结晶紫细胞染色20 min。总共计算每个孔的5个视野(×200)以计算平均数，随后使用Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics，Bethesda，MD)来定量迁移的细胞。每个样品重复3次，结果取平均值。

1.5  主要观察指标  转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球对脂肪间充质干细胞增殖与迁移的影响。

1.6  统计学分析  采用SPSS 20.0统计软件进行分析。数据以x(_)±s表示，组间比较采用独立样本t 检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni检验；检验水准α=0.05。

转化生长因子β超家族成员具有相似的生理学效应，在胚胎软骨形成的多个时期都是必不可少的^[26-28]。研究表明，转化生长因子β1和转化生长因子β2是软骨形成的主要调节剂，其主要功能是抑制细胞增殖及促进成软骨分化和成骨分化^[29-31]。而转化生长因子β3被证明具有促进干细胞迁移和软骨分化的作用^{[7，9，32-33]}。同时在转化生长因子β3存在下，成纤维细胞生长因子2能够诱导软骨细胞分化并促进增殖，同时抑制软骨细胞肥大^[34]。但是直接加入外源性转化生长因子β3会被体内的蛋白酶快速降解，无法保持有效浓度和有效缓释时间，其促进干细胞迁移、黏附和诱导成软骨的能力受限。以PLGA微球为载体负载转化生长因子β3则克服了以上的缺陷，在软骨损伤区域缓慢控释转化生长因子β3生长因子，提高了其长效生物学效应。

由于PLGA无毒安全、具有可控的降解性和良好的生物相容性等优势，被广泛应用于医药领域^[19-20]。因此，以PLGA微球为载体则解决了转化生长因子β3在体内半衰期短且易被降解的问题。实验结果表明，转化生长因子β3/ PLGA微球具有良好的球形形态，表面光滑，粒径分布均匀，且微球之间无粘连，是一种理想的药物载体。实验发现PLGA微球在合适的波长激发下可以显示不同的颜色，当激发光的波长为415 nm时，PLGA微球显示蓝色；当激发光的波长为505 nm时，PLGA微球显示绿色，这是PLGA微球具有的特性，在显色与定位方面具有很大的潜力。使用山羊抗小鼠IgG/alexa fluo594二抗蛋白模拟转化生长因子β3在微球中的分布情况，当激发光的波长为565 nm时，PLGA微球显示红色，这是由于荧光蛋白在微球中均匀分布，因此PLGA微球呈现均匀的球形。实验通过优化微球制备技术延长初级乳液的乳化时间，使得转化生长因子β3充分混合在PLGA溶液中，尽可能减少药物的损失。实验采用间接法测量的PLGA微球包封率均在90%以上，显示出其作为药物载体的优势，减少了药物浪费。

体外缓释结果表明，PLGA微球缓释机制主要包括扩散机制和降解机制。在初期，黏附在PLGA微球表层的转化生长因子β3最先扩散到周围介质中，呈现出快速突释相，前3 d释放达到10 µg/L，充分发挥其早期促进干细胞迁移与黏附作用，这与YAO等^[30]的研究结果是一致的。然后，随着PLGA微球的降解，转化生长因子β3缓慢线性释放，维持成软骨分化的最佳浓度^[23-24]，并且其完全降解与药物释放可以持续6个月左右，这与软骨的再生周期是相符合 的^[21]。总的来说，药物释放行为遵循双向动力学缓释规律，初相为快速突释相，后相为慢速缓释相，这种缓释特点可以使得转化生长因子β3在局部软骨缺损区域快速达到有效药物浓度并维持下去，这也是PLGA微球作为药物控释载体的一大优势^[25]。

当前，大多数学者对转化生长因子β3的研究侧重于其对间充质干细胞的分化调控，关于其对于间充质干细胞增殖与迁移调控的研究较少。因此，实验重点探究了转化生长因子β3及转化生长因子β3/PLGA微球对兔脂肪间充质干细胞增殖与迁移调控的影响。通过CCK-8试剂盒检测转化生长因子β3/PLGA微球对兔脂肪间充质干细胞增殖实验发现，随着时间的延长细胞数量逐渐增加，在不同时间点，10 µg/L转化生长因子β3、空白PLGA微球及不同质量浓度的转化生长因子β3/PLGA微球对细胞增殖性并未产生促进作用，这与LUO等^[35]研究结果是一致的，说明转化生长因子β3对脂肪间充质干细胞增殖无明显调控作用，同时也表明制备的PLGA微球具有安全无毒、良好生物相容性的特点。

实验还探究了转化生长因子β3对兔脂肪间充质干细胞迁移的影响，结果表明10 µg/L转化生长因子β3可以显著促进脂肪间充质干细胞的迁移，同时转化生长因子β3/PLGA微球也表现出类似的结果，这与LEE等^[9]的研究结论是一致。通过结合PLGA微球缓释特性，在短时间内释放速率为10 µg/L，因此在10-1 000 g/L 转化生长因子β3/PLGA微球溶液中，转化生长因子β3因子质量浓度可达到2-20 µg/L，达到了其促进脂肪间充质干细胞迁移的有效浓度。实验也间接证明了可通过调整转化生长因子β3/PLGA微球在局部软骨缺损的植入量，在早期突释，达到并维持转化生长因子β3促进组织周围间充质干细胞迁移的有效浓度；在后期慢速缓释过程中可以维持其促进成软骨分化的长期有效浓度^[23]。

综上所述，通过乳化-溶剂挥发法制备的转化生长因子β3/PLGA缓释微球呈球形，药物分布均匀，具有良好的缓释特性与生物相容性。转化生长因子β3/PLGA缓释微球通过初期突释达到促进脂肪间充质干细胞迁移的有效浓度，后期通过缓慢释放转化生长因子β3维持其促进成软骨分化的有效浓度，在软骨损伤修复领域具有巨大潜力。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

转化生长因子β3：是转化生长因子β超家族成员，在胚胎软骨形成的多个时期都是必不可少的软骨组织形成的关键调节因子，可以促进间充质干细胞迁移并诱导其向软骨组织分化与成熟，促进软骨缺损的愈合。

聚乳酸-羟基乙酸微球：属于食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准的可生物降解聚合物，具有可控的降解性和良好的生物相容性，被广泛应用于医药领域。由于其生物可降解性，聚乳酸-羟基乙酸微球微球被广泛应用于小分子药物、蛋白质和其他大分子药物的可控持续释放。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

(1)通过优化制备工艺，制备出的转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸微球呈球形，粒径分布均匀，药物空间分布均匀，并且具有较高的包封率、良好的缓释特性与生物相容性。

(2)研究着重探究了转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸微球对间充质干细胞的增殖性及迁移性研究。结果表明，在不影响脂肪间充质干细胞增殖的情况下促进其迁移，为临床治疗软骨损伤提供精准性研究与理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程