2.1  羟基磷灰石矿化前后支架的形态变化  通过优化的静电纺丝技术成功制备出了蓬松的纤维支架，支架的架构立体柔软，呈棉团样构造，见图1A。传统聚乳酸纤维支架中的纤维间隙狭小致密，见图2A；在模拟体液中浸泡21 d后，纤维支架内原本致密的孔隙几乎完全被羟基磷灰石涂层填充，见图2B，使得细胞很难迁移到支架的内部获得了真正的3D细胞培养，其只能形成细胞单层或群落。蓬松聚乳酸纤维支架中大部分聚乳酸纤维彼此离散，他们之间的距离是(75±25) μm，少数聚乳酸纤维处于同一水平，见图2C；在模拟体液中浸泡21 d后由于羟基磷灰石涂层 (图1B-Ⅱ)的生长，大部分纤维仍保持离散状态，只有少数纤维相互缠绕在一起，见图2D，这些结构特征使得羟基磷灰石纤维之间存在许多深度相互连接的孔隙，这些孔隙大小为(65±35) μm(图1B-Ⅲ)，足以让细胞(约15 μm)轻松迁移到支架内部，并有足够的空间增殖。

2.2  羟基磷灰石矿化前后纤维支架物理性能的变化  羟基磷灰石矿化前，蓬松聚乳酸纤维支架中的纤维以1.6-2.8 μm尺寸分布，平均直径为2.15 μm，见图3A；羟基磷灰石矿化后，纤维直径范围为8-14 μm，平均直径为10.45 μm，见图3B。矿化前后结果表明羟基磷灰石涂层厚度约为8.3 μm，说明矿化后羟基磷灰石涂层将为细胞的黏附增殖提供基础，并增加支架材料的生物学性能。

矿化过程中随羟基磷灰石涂层厚度的增加，蓬松羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维支架的质量不断增加，见图3C；在温育的第21天，蓬松羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维支架的质量较矿化前蓬松态聚乳酸纤维支架高出6倍，支架中的羟基磷灰石将更有利于骨传导、蛋白黏附和成骨细胞的增殖。

由于羟基磷灰石和聚乳酸之间的界面黏附随着时间变化而增加，矿化后的蓬松纤维支架脆性及硬度增加，同时羟基磷灰石涂层也可显著增强机械强度；在第21天，蓬松羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维支架的压缩模量高达0.78 kPa(压缩比为30%)，见图3D，远大于矿化前蓬松纤维支架(4.2 Pa)的压缩模量，这足以作为支持细胞3D培养的基质，并且可以作为骨组织工程的填充材料。

吸水率可清楚反映了支架的孔隙率。与传统聚乳酸纤维支架相比，蓬松聚乳酸纤维支架空间结构孔隙更大，吸水率明显增高(P < 0.01)；同样在羟基磷灰石矿化后，羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维支架的吸水率较传统羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维升高(P < 0.01)，见图3E，这将更有利于营养成分进入支架，诱导骨生长增殖。

蓬松聚乳酸纤维支架矿化后的孔隙率略低于矿化前，这是因为纤维直径从最初的2.15 μm(聚乳酸纤维)增加到最终的10.45 μm(羟基磷灰石纤维)。然而，羟基磷灰石涂层使得蓬松羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维支架的表面积(38.5 m²/g)远高于蓬松聚乳酸支架(18.8 m²/g)，这将为细胞附着和生长提供更多的面积和空间。见图3F。

如图4扫描电镜所示，在蓬松聚乳酸纤维表面上可见羟基磷灰石涂层的形成；在模拟体液中温育7 d后，一些大小在3-10 μm的微粒开始出现在聚乳酸纤维表面上，见图4A；随后，沿着聚乳酸纤维附着大量的羟基磷灰石颗粒，并且这些颗粒在纤维周围松散地黏附在一起，见图4B；最后，在模拟体液中温育21 d后，这些羟基磷灰石颗粒生长成厚且致密的涂层，见图4C。在羟基磷灰石生物矿化的整个过程中，由于在静态环境中聚乳酸纤维表面上羟基磷灰石涂层缓慢且规则的形成，原有蓬松空间结构深层互连孔保持不变。

2.3  羟基磷灰石矿化前后纤维支架的化学特征  通过傅里叶红外光谱和X射线能量色散谱观察聚乳酸纤维表面生物矿物羟基磷灰石的化学特性。傅里叶红外光谱显示，矿化后的蓬松聚乳酸纤维表面存在羟基磷灰石，见图5A，在536，604和1 033 cm^-1有3个峰归因于来自羟基磷灰石的磷酸根基团的P-O键的振动；第2个峰在原始羟基磷灰石光谱中位于1 012 cm^-1处，并且在涂覆羟基磷灰石之后转移到更高的波数(1 033 cm^-1)。聚乳酸纤维的特征峰(对于C=O基团为1 750 cm^-1，对于C-O则为1 083 cm^-1)变得较弱，但蓬松羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维谱图中没有显示波数变化。另外，X射线能量色散谱显示矿化后蓬松聚乳酸纤维支架的主要成分是氧、钙和磷，并且Ca/P比值为1.60，见图5B，表明矿物相为羟基磷灰石。羟基磷灰石涂层的这些化学特性与以前研究一致，表明羟基磷灰石在蓬松纤维支架中的聚乳酸纤维表面上成功生物矿化。

2.4  骨髓间充质干细胞在支架中的增殖  在培养12 h后，骨髓间充质干细胞在两种支架上附着情况相似：83%的细胞黏附在传统羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维支架上，而81%的细胞黏附蓬松羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维支架上。

培养7 d后，传统羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维支架中的细胞增殖数量为6.63×10⁴，蓬松羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维支架中的细胞增殖数量为10.39×10⁴，两组间比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)。这些结果强烈表明，蓬松羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维支架的空间结构及内部相互连接的毛孔与传统羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维支架相比可促进细胞增殖^[8]。

2.5  骨髓间充质干细胞在支架中的活性与形态  培养7 d后FDA染色显示，传统羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维支架上出现了稀疏的骨髓间充质干细胞-细胞接触的独立形状，见图6A；蓬松羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维支架内部出现大量的骨髓间充质干细胞，并且这些细胞生长成具有高细胞活性的细胞簇，见图6B。

培养7 d后扫描电镜显示，培养在传统羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维支架上的细胞保持了与细胞间疏离接触的独立形状，见图6C；培养在蓬松传统羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维支架上的细胞形成整合的细胞-纤维构建体，并且由于细胞膜广泛扩散，导致难以区分单个骨髓间充质干细胞，见图6D，这与荧光图像结果一致。这些结果表明蓬松的空间结构可使细胞容易迁移到羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维支架内部，促进了骨髓间充质干细胞的三维培养，明显改善了细胞活性，并且影响了细胞生长形态。

骨缺损的治疗一直以来是临床难点，骨修复和再生的生物材料将有效解决这一难题。诸多研究都在尝试制备各种具有良好相容性和适应性骨修复及再生的生物材料^[1-4]。通过掺入或者添加无机生物活性涂层来显著促进细胞的活性，如功能性的纳米颗粒、羟基磷灰石、膜材料及三维支架等都已被发展应用于骨组织工程^[5-7]。三维支架生物材料含有多孔结构，可为细胞提供丰富的分布空间并有利于氧气和营养物质的输送。更重要的是这些三维生物材料在一定程度上模拟了细胞外基质的拓扑结构和生物功能，从而诱导骨的修复和再生^[8-10]。

羟基磷灰石因其与生物骨有着相似的无机物成分而成为骨的重要填充材料，已被广泛用于制备骨修复材料^[6，11-12]。此外，羟基磷灰石有着良好的生物活性和生物相容性，例如其可提供有利于骨传导、蛋白黏附和成骨细胞增殖的功能。近些年大量的复合生物材料支架，例如聚乳酸/羟基磷灰石、凝胶/羟基磷灰石、聚己内酯共聚物/羟基磷灰石等都通过结合使用羟基磷灰石用于骨的修复和再生^[13-17]。三维结构的羟基磷灰石作为骨修复材料，其主要特点就是具备了多孔宏观结构。此外，这些生物材料应有良好的载细胞性能和良好的骨传导性，然而目前的羟基磷灰石骨修复生物材料远不能满足细胞外基质的功能需求，因为羟基磷灰石含量不足且内部结构空间过于致密，这些因素非常不利于实现3D细胞培   养^[3，18-20]。尽管诸多努力都致力于研制疏松多孔羟基磷灰石生物支架材料，但是在生物矿化过程中这些理想的支架多孔微结构会消失，这些缺点极大地限制了羟基磷灰石骨修复材料的实际应用。

实验的目的是开发一种新颖的具有蓬松多孔结构的羟基磷灰石生物支架，其含有相互连接的孔隙，可用于骨组织工程。首先开发了一种优化的静电纺丝技术以制备出如所示的蓬松聚乳酸纤维支架，其中聚乳酸纤维处于离散状态；随后通过生物矿化过程使蓬松纤维支架的纤维表面获得羟基磷灰石涂层；最后在形成的蓬松羟基磷灰石纤维支架中出现了许多可以使细胞轻松进入的相互关联微孔结构，实现了细胞的三维立体培养，检测这种蓬松态纤维结构对人骨髓间充质干细胞生长行为的影响，并评估了羟基磷灰石纤维上培养细胞的增殖、形态和功能，以及这种蓬松羟基磷灰石生物支架在骨组织工程中的应用潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1   设计  观察性实验。

1.2   时间及地点  实验于2018年6月至2019年5月在南京理工大学生物材料实验室完成。

1.3  材料  聚乳酸材料(中国济南岱罡聚合物公司)见表1；羟基磷灰石(美国Sigma-Aldrich公司)；二氯甲烷-N、N-二甲基甲酰胺、胎牛血清、DMEM完全培养基、抗坏血酸、β-甘油磷酸(美国Sigma-Aldrich公司)；dsDNA定量试剂盒(美国Invitrogen公司)；人骨髓间充质干细胞(中国上海抚生生物工程公司)；定轨振荡器(印度Lab-Line公司)；VERTEX 70 FTIR光谱仪(德国Bruker 公司)；微拉伸测试机(中国深圳勤联科技有限公司)；S-4800型扫描电镜(日本Hitachi公司)；注射器泵(中国北京思路高公司)；荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.4  实验方法 

1.4.1  制备蓬松聚乳酸纤维支架 

制备蓬松聚乳酸纤维支架：采用改进静电纺丝工艺制备聚乳酸纳米纤维，见图1A。将质量分数6.8%的聚乳酸溶解在二氯甲烷-N和N-二甲基甲酰胺(二者体积比为9/1)的混合溶液中，将其加入到用0.22号钝头针头喷嘴盖住的注射器中。然后在高直流电源14 kV下使用注射器泵以1.5-2.5 mL/h的速度驱动该溶液。针尖和收集器顶部之间的距离是10 cm。使用专门设计的收集器获得蓬松的纤维支架，将其通过1.5 cm长的不锈钢探针嵌入半球塑料盘(直径8 cm，厚度0.2 cm)中，用铝箔覆盖，并用不锈钢衬里支撑以提供电气接地，并且将针以4-8个等距的方向从盘中心以2 cm的间隔放置。收集器中的这些探针能够从4-8个等距方向收集纳米纤维，并允许纳米层沉积在先前沉积层的旁边，最终在半球形塑料的中心形成蓬松聚乳酸纤维支架，见图1B-Ⅰ，取出后保存于真空干燥器中备用。

制备传统聚乳酸纤维网支架：将质量分数6.8%的聚乳酸溶解在二氯甲烷-N和N-二甲基甲酰胺(二者体积比为= 9/1)的混合溶液中，使用低转速(100 r/min)旋转圆盘获得随机纳米纤维支架^[21]。

1.4.2  制备羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维支架  用于生物矿化的模拟体液(pH=7.2)按文献[22]报道的方法制备。首先，将0.01 g蓬松纤维支架浸入装有50 mL体积分数30%乙醇溶液的玻璃瓶(直径3.5 cm)中，振荡2 min以彻底渗透和膨胀；然后除去乙醇溶液，用模拟体液洗涤支架数次，彻底除去乙醇；随后将50 mL新鲜模拟体液加入到上述玻璃瓶中，并保持在37 ℃使这些支架保持矿化状态，每隔1 d更换一次模拟体液。在不同的时间点温育后，将模拟体液从瓶子中取出，并用去离子水填充几次以完全除去可溶性无机离子，然后将这些保留在玻璃瓶中的羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维最终通过冷冻干燥进行进一步实验。在上述矿化过程中，通过使用传统聚乳酸纤维支架作为模板来制备传统羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维支架。

1.4.3  不同支架的表征  在日立S-4800N扫描电镜上以20 kV的加速电压获得不同支架的扫描电镜图像和X射线能量色散谱，通过X射线能量色散谱和RONTEC软件测定传统与蓬松羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维支架的Ca/P原子比。

为了测量蓬松支架中孔隙的尺寸和相互连接性，将其切割为厚度2 mm的冷冻成型样品，切割操作须缓慢渐进，因为切片过程中的快速切割会导致羟基磷灰石涂层的小碎片脱落。然后冷冻干燥以进行扫描电镜扫描检测。在扫描电镜图像中，这些支架中的孔隙被定义为由处于相同水平的纤维组成的闭合圆。通过ImageJ软件(NIH，USA)在获得的扫描电镜图像中测量100个不同的孔来获得平均孔径。

用VERTEX70 FTIR光谱仪记录傅里叶红外光谱。使用Micromeritics ASAP 2010分析仪在77 K进行N₂吸附测量。使用微拉伸测试机测量浸泡于模拟体液后支架的机械性能。检测传统与蓬松态聚乳酸纤维支架、传统与蓬松羟基磷灰石/聚乳酸纤维复合支架的吸水率与表面积。吸水率通过吸水质量/支架质量计算评估。

1.4.4  人骨髓间充质干细胞的传代培养  将人骨髓间充质干细胞重悬于补充有体积分数10%胎牛血清的完全培养基中，在37 ℃、体积分数5%CO₂的环境中培养，使贴壁细胞达到约80%汇合(第1次传代7-9 d)。细胞在培养过程中传代，取第3代细胞用于实验。

1.4.5  细胞接种  将传统与蓬松的羟基磷灰石/聚乳酸纤维复合支架保持在直径为3.5 cm的玻璃瓶中，注入30 mL去离子水，并保持在-20 ℃进行成型，然后用酒精灯加热破碎玻璃瓶，迅速移入-5 ℃的冷冻切片机中。随后使用无菌剃刀将成形的羟基磷灰石/聚乳酸纤维复合支架切成厚度为2.0 mm的薄片，最后通过冷冻干燥进行细胞接种。通过将两种支架浸泡在体积分数70%乙醇和30%PBS中12 h进行灭菌，然后用PBS洗涤几次后放入6孔板中；在定轨振荡器中用完全培养基(DMEM，体积分数10%FBS，100 U/mL青霉素和100 g/L链霉素)洗涤支架2次，每次2 h；将人骨髓间充质干细胞接种到每个蓬松羟基磷灰石/聚乳酸纤维复合支架(厚度为2.0 mm)和传统羟基磷灰石/聚乳酸纤维复合支架上，细胞密度为1.0×10⁴。将得到的支架/细胞构建体置于培养箱中6 h以允许细胞附着，然后向每个孔中再加入3 mL适当的培养基。使用含有体积分数10%FBS的DMEM培养基来研究细胞的形态、附着和增殖。

细胞增殖：基于DNA分析方法，培养7 d后对两组支架中的细胞进行定量分析。即通过将支架浸入0.5%Triton X-100无DNA去离子水中并在37 ℃温度下温育，将黏附的细胞进行裂解1 h。根据PicoGreens dsDNA定量试剂盒对DNA浓度进行定量，使用读板仪在485 nm的激发波长和530 nm的发射波长下测量荧光。将经过相同处理的浸泡空支架的培养基用作空白对照。细胞增殖表达为黏附细胞与原始接种细胞的比率。

细胞活力：为了评估细胞活力，培养7 d后将样品在37 ℃下与1 mL荧光素二乙酸酯(5 mg/L)在培养基中温育10 min，然后用PBS洗涤2次。为观察在蓬松的羟基磷灰石纤维支架内部培养的人骨髓间充质干细胞，采用超薄切片技术将样品切成片，在荧光显微镜下成像。

细胞形态：培养7 d后使用扫描电镜观察细胞形态。将细胞用3%戊二醛固定2 h，并使用递增浓度的乙醇-水(体积分数25%，50%，70%，80%，90%，95%和无水乙醇各     30 min)进行脱水。随后在CO₂临界点下干燥(HitachiHCP-2)，并在扫描电镜观察之前溅射涂覆铂。

1.5  主要观察指标  蓬松羟基磷灰石/聚乳酸复合纤维支架材料表面骨髓间充质干细胞的增殖、活性及形态。

1.6  统计学分析  所有数据均使用SPSS 19.0进行分析，数据表示为x(_)±s，统计分析使用t 检验。

用于骨组织再生的支架应具有生物相容性和可生物降解性，并具有适当的机械性能和结构^[23-24]。 三维打印技术的发展意味着所需的支架特性(例如形状、表面形态及孔的形状和尺寸)变得更加容易获得。 三维打印可轻松、快速且可重复地生产特定形状，并且在组织工程领域已经使用3D打印技术进行了许多尝试^[25-27]。当前研究合成的可吸收聚合物，例如聚己内酯、聚乙交酯、聚丙交酯和聚乳酸-乙醇酸共聚物已用于生产3D打印支架，但存在局限性细胞附着和成骨分化问题，很难获得令人满意的促进骨再生骨移植物或支架^[28-31]。天然细胞外基质包含胶原蛋白、非胶原蛋白和蛋白聚糖等，它们通过为细胞间连接提供微环境而在细胞增殖和分化中发挥重要作用，但难以通过模仿靶组织的细胞外基质成分来开发生物材料^[32-33]。

同时将三维打印的支架移植到骨缺损中时，首先需要考虑的是支架会影响细胞活动，例如细胞的附着、分化和死亡，因此支架应具有良好的细胞生物活性，便于血液渗透到支架上，然而这种渗透和细胞黏附通常受到合成聚合物疏水特性的抑制。另外，需要考虑成骨作用的早期标志物和钙沉积量的碱性磷酸酶表达，因此支架要形成良好的相互连接孔，使细胞更容易迁移，并且细胞与生物分子接触，促进细胞与支架的黏附^[34-36]。

实验结果表明，蓬松的羟基磷灰石纤维支架在细胞增殖和分化中发挥重要作用，并且该支架也可以像β-磷酸三钙支架一样作为生长因子的来源，如血管内皮生长因子、细胞因子、趋化因子和其他生物信号，为细胞增殖、分化和血管生成提供生物活性信号^[34-35]。另外，还可以通过共同接种骨髓间充质干细胞衍生的内皮细胞来开发预血管化的羟基磷灰石纤维支架，用它来促进节段性骨缺损的修复。

此外，该项研究加强了人们对羟基磷灰石支架骨组织修复和再生中细胞-基质相互作用的认识。仿生微环境可提供生物活性信号，调节骨髓间充质干细胞的成骨行为。因此，通过体外产生细胞衍生的细胞外基质，可以改善支架的细胞功能。另一方面，蓬松羟基磷灰石纤维支架可以调整适用各种形状和尺寸的缺陷，易于在临床中处理和储存。于此同时，该材料的生物力学强度还有待于进一步提高，相信这种生物支架可能成为细胞衍生的填充剂，其独特的蓬松空间纤维结构确保了骨髓间充质干细胞进入支架内部并实现三维细胞培养，可显著促进骨髓间充质干细胞的细胞附着、增殖、成骨分化和矿化。同时也将进一步行动物实验，在骨缺损动物模型中明确该支架在体内的治疗效果。因此该生物支架材料有望在骨缺损、骨不连及现代医学中骨缺失治疗中发挥重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

静电纺丝技术：是一种特殊的纤维制造工艺，聚合物溶液或熔体在强电场中进行喷射纺丝，在电场作用下，针头处的液滴会由球形变为圆锥形，并从圆锥尖端延展得到纤维细丝，这种方式可以生产出纳米级直径的聚合物细丝。

三维支架生物材料：含有多孔结构，可以为细胞提供丰富的分布空间并有利于氧气和营养物质的输送；三维生物材料在一定程度上模拟了细胞外基质的拓扑结构和生物功能，从而诱导骨的修复和再生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

研究通过改良的静电纺丝技术结合聚乳酸纤维制备出了蓬松的纤维支架(PLLA fluffy-FSs)，克服了传统技术下制备出的纤维支架(PLLA FMs)材料的缺陷，真正意义上实现了细胞的3D培养，该研究中对新型纤维支架的理化特性分析研究显示，其空间结构蓬松深度互联，矿化后羟基磷灰石分布均匀，表面积大，吸水率高，压缩模量强，并且骨髓间充质干细胞培养结果提示接种及增殖性能良好，因此该材料有望解决临床中的骨缺损修复难题。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程