脱细胞鱼皮口腔引导组织修复膜的制备和评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1596

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

引导组织修复膜：在口腔医学领域，牙周病、拔牙后剩余牙槽嵴的吸收及在种植牙齿修复时骨量不足等原因均会造成牙周组织的缺损，使得牙齿周围的支撑组织不够。目前这些问题主要通过能够在缺损部位增加骨量或改善骨质量的引导组织再生术来进行治疗。在此过程中用到的屏障膜称为引导组织修复膜，可以阻止上皮与结缔组织长入骨缺损区，形成成骨空间，选择性引导成骨细胞向牙龈面增殖，从而完成缺损部位的骨组织修复。

鱼皮脱细胞真皮基质：采用沙鳗鱼皮为原料，去除表皮层和皮下组织，脱除杂蛋白和细胞后保留基底膜和以胶原纤维为主的真皮基质。处理后去除了能引起宿主免疫反应的主要抗原物质，有一定的孔隙率，并且具有良好的生物相容性，适合用于口腔修复时骨组织和软组织修复过程中的支架材料。

背景：目前口腔修复膜大多价格昂贵且存在人畜共患病疾病风险，因此需要开发新型口腔修复膜材料。

目的：制备鱼皮脱细胞真皮基质，检测其脱细胞有效性、生物力学及生物相容性等，探讨其作为口腔引导组织修复膜的可行性。

方法：通过物理法、化学试剂法和生物制剂法相结合的方法对沙鳗鱼皮进行脱细胞处理，制得脱细胞真皮基质材料；利用扫描电子显微镜观察材料的微观形貌；通过苏木精-伊红染色、Masson染色和PAS染色观察材料的组织成分；使用试剂盒检测材料的DNA含量；通过细胞毒性实验和动物皮肤刺激实验检测材料的生物相容性。

结果与结论：①制得的鱼皮脱细胞真皮基质材料色泽为白色或偏微黄，有一定强度和韧性；②材料由致密面和疏松面形成，具有双层结构；③细胞得到了很好的脱除，材料几乎全为胶原纤维，无PAS阳性物质；④材料DNA含量明显低于天然鱼皮和市售口腔修复膜；⑤材料细胞毒性极低，对动物无致敏性；⑥结果证实制得的鱼皮脱细胞真皮基质材料有望用于口腔引导组织修复膜的制备。

ORCID: 0000-0002-7912-1416(李八方)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 口腔修复膜, 脱细胞, 真皮基质, 鱼皮, 引导组织修复, 细胞毒性, 生物相容性, 力学性能, 口腔材料, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Current oral restoration membranes are expensive with a potential risk of zoonotic virus, so new membranes are in need.

OBJECTIVE: To prepare fish skin acellular dermal matrix and evaluate its efficiency of decellularization, biomechanical properties and biocompatibility, in order to explore its feasibility as an oral restoration membrane.

METHODS: The skin of Astroconger Myriaster was harvested to prepare acellular dermal matrix by decellularization via a combination of physical method and chemical and biological reagents. The micromorphology of the material was observed under scanning electron microscope. Tissue composition was analyzed by hematoxylin-eosin, Masson and PAS staining. The DNA content was detected using a kit. The biocompatibility was evaluated through cytotoxicity and animal skin stimulation tests.

RESULTS AND CONCLUSION: The prepared acellular dermal matrix: (1) was white or light yellow, with strength and toughness; (2) exhibited a double-layered structure composed of a dense layer and a loose layer; (3) was mostly composed of collagen without PAS positive substance, showing good decellularization; (4) had a significantly lower DNA content than natural fish skin and commercial oral restoration membrane; and (5) possessed good biocompatibility, with very low cytotoxicity and no stimulation to the animal skin. Therefore, the prepared acellular dermal matrix of fish skin shows a potential in the preparation of oral guided tissue regeneration membrane.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Collagen, Biocompatible Materials, Tissue Engineering

中图分类号:

R452

R78

Q81

王园园，宋文山，于德君，代元坤，李八方. 脱细胞鱼皮口腔引导组织修复膜的制备和评价[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(10): 1526-1532.

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图/表（结果） 7

2.1 脱细胞鱼皮口腔引导组织修复膜的大体形态鱼皮脱细胞真皮基质厚薄均匀，厚度为(0.67±0.04) mm，对照品口腔修复膜厚度为(0.65±0.02) mm，两者差异无显著性意义(P > 0.05)。鱼皮脱细胞真皮基质呈不透明的双层结构，正面光滑且致密，几乎无孔隙，反面较为粗糙，色泽为白或微黄，具有一定的强度和韧性，见图1。

2.2 脱细胞鱼皮口腔引导组织修复膜的微观形貌扫描电镜结果显示，未处理的鱼皮正反面均致密，内侧带有皮下组织。脱细胞处理后，皮下组织去除干净，皮面形成了孔隙较多且比较均匀的疏松面，孔大小不一，深浅不一，而另一面为致密面，无孔隙结构。市售口腔修复膜致密面带有部分孔洞，疏松面有均一的孔隙，孔隙率高于鱼皮脱细胞基质，胶原纤维直径大于鱼皮脱细胞基质。从断面图中可以看到，天然鱼皮内部胶原纤维由平面二维编织的网状单元相互叠加致密排列，处理后，原本排列致密的胶原纤维层被打断，出现与市售口腔修复膜类似的结构，见图2。

2.3 脱细胞鱼皮口腔引导组织修复膜的组织成分未处理的鱼皮的主要成分是胶原纤维，结构上由平面二维编织的网状单元相互叠加，排列致密。各个网状单元主要靠一些纵向细小的胶原纤维束来联系，另外有极微量的网状纤维和弹性纤维存在，黑色素细胞分布在表皮层部分，切片还能看到皮下脂肪组织。处理过程去除了表皮层、皮下组织层。苏木精-伊红染色可见未脱细胞处理的鱼皮可见蓝黑色细胞核，经脱细胞处理后，鱼皮脱细胞基质中未见细胞核，网状单元层的细小纤维断裂，纤维整体束状有序排列，形成较疏松组织。通过Masson染色结果可见，处理后的材料不含红色胞浆以及深蓝黑色细胞核等物质，均为蓝色胶原纤维。通过PAS染色可见，处理后的材料无PAS阳性物质，即无糖原，见图3。

2.4 脱细胞鱼皮口腔引导组织修复膜的脱细胞效果 DNA定量结果显示，鱼皮脱细胞基质中 DNA 含量明显低于天然鱼皮及对照品口腔修复膜(P < 0.05)，见图4。

2.5 脱细胞鱼皮口腔引导组织修复膜的力学性能根据拉伸力学实验结果，鱼皮脱细胞基质的应力在躯干横向上远大于纵向，因此决定裁剪方向为横向。根据应力-应变曲线计算得出，对照品口腔修复膜的最大应力为(9.43± 0.18) MPa，断裂伸长率为(77.67±0.23)%，小鼠皮肤的最大应力为(0.50±0.09) MPa，断裂伸长率为(77.48±0.86)%，鱼皮脱细胞基质的最大应力为(3.61±0.32) MPa，在二者之间，断裂伸长率为(66.72±1.42)%，略低于前二者，但差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。

2.6 脱细胞鱼皮口腔引导组织修复膜的细胞相容性根据国家标准《GB/T 16886.5体外细胞毒性试验》，培养1，3，5 d时，细胞增殖率均在94%以上，见表3，毒性等级为1级，属于极低细胞毒性。

2.7 脱细胞鱼皮口腔引导组织修复膜的动物皮肤刺激性在除去敷贴片1，24，48和72 h后，各接触部位情况如图6所示。在除去敷贴片后固定时间点观察皮肤接触部位情况，对照组平均记分0分，实验组平均计分0.2分，说明材料对动物皮肤无刺激性。

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引言

口腔修复膜广泛应用于牙周疾病的治疗、牙种植及牙槽外科等口腔医学领域，是利用外科手术的方式置于口腔软组织与骨缺损之间的一种生物膜屏障，可以创造一个相对封闭的骨再生环境，选择性地防止迁移速度较快的成纤维细胞和上皮细胞进入骨缺损区影响骨的再生^[1-2]。良好的口腔修复膜材料应当具有以下基本性质：良好的物理性能(起到机械屏障作用)；较低的免疫原性(不引发免疫反应或炎症反应)；适当的降解性(在体内留存适当的时间)；良好的生物相容性(降解产物无毒，并最好可以促进组织的再生)^[3-8]。目前临床上普遍使用的口腔修复膜大多价格昂贵^[4^，^9-10]，且原料大多来自哺乳动物(猪或牛)，存在人畜共患病毒的携带和传播的风险^[11]，因此需要开发更安全的新型口腔修复膜材料。

脱细胞真皮基质凭借良好的生物相容性成为了口腔修复膜材料的研究热点^[12-16]。其中，脱细胞鱼皮作为新型脱细胞真皮基质类产品，在国内外均属于新型的前沿产品，迄今仅有个别产品在美国食品药品监督管理局获批上市。脱细胞鱼皮作为脱细胞真皮基质类产品或组织工程支架材料，具有以下独特优势：结构和组分更利于诱导创面修复，其三维网状结构比猪皮、牛皮类产品更有利于细胞的迁入和增殖，有助于加快创伤修复；生物安全性高，鱼胶原蛋白抗原性低，不会引起明显的变态反应；来源丰富，价格低廉，具备大规模生产的基础；可规避特殊地区、特殊群体的宗教壁垒^[11^，^17]。文章选取沙鳗(Astroconger Myriaster)鱼皮作为研究材料，制备鱼皮脱细胞真皮基质并对其进行形态、组分、物理性能、生物相容性等方面的检测，考察其作为口腔引导组织修复膜材料的可行性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料学实验。

1.2 时间及地点实验于2016年11月至2017年12月在青岛海洋生物医药研究院完成。

1.3 材料

实验动物：①沙鳗(Astroconger Myriaster)，雌雄不限，体质量5.0-6.0 kg，购自浙江省舟山市舟山国际水产城；②雌性ICR小鼠，体质量20-25 g，购自于济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK(鲁)2014-0007；③健康初成年的白化兔5只，雌雄不限，体质量不低于2.0 kg，购自山东省青岛市青岛康大生物科技有限公司,许可证号：SCXK(鲁)2016-0002。实验过程中对动物的处置符合青岛海洋生物医药研究院动物伦理学标准的条例，批准号：QDHYSWYYYJY-201709-001。

实验用主要试剂与仪器：口腔修复膜购自烟台正海生物技术有限公司，医疗器械证号：国械注准20153460386，小鼠成纤维细胞(NCTC clone L929)购自武汉普诺赛生命科技有限公司，伊红Y、Masson三色染色试剂盒、糖原PAS染色试剂盒购自北京Solarbio公司，无毒环保苏木素染液购自南京建成生物科技有限公司，海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，扫描电子显微镜(JSM-7500)购自日本JEOL公司，轮转切片机(JY-1508A)购自北京佳源兴业科技有限公司，光学显微镜(CX31RTSF)、倒置显微镜(CKX53)购自日本Olympus公司，超微量紫外分光光度计(NanoDropTM One/OneC)购自美国Thermo Fisher公司，电子万能试验机(WDW-1)购自济南友创试验机有限公司，单功能光吸收酶标仪(VersaMax)购自上海美谷分子仪器有限公司，数显千分尺购自东莞市景有模具五金有限公司。

1.4 方法

1.4.1 脱细胞真皮基质的制备将新鲜沙鳗速冻，取其鱼皮，去除内侧筋膜、脂肪和多余鱼肉，生理盐水冲洗数次，超纯水冲洗数次；50 mmol/L抗坏血酸(无菌PBS配制)处理1 h，0.05 mol/L甲酸室温下振荡5 min溶胀并去除表皮层；7.0%NaCl室温振荡1 h去溶胀，-80 ℃低温反复冻融3次，2.0%脱氧胆酸钠溶液处理12 h；无菌PBS冲洗数次，超纯水冲洗数次，0.5%十二烷基磺酸钠溶液处理1 h；无菌PBS冲洗数次，超纯水冲洗数次，0.2 μg/L胰蛋白酶溶液处理4 h；生理盐水洗涤数次，冻干，定型，⁶⁰Coγ射线辐照灭菌。

1.4.2 脱细胞真皮基质厚度的测量每组取3个样品，用数显千分尺任选6个点测量厚度，计算平均值。

1.4.3 扫描电子显微镜观察样品裁剪成4 mm×4 mm的正方形用于观察致密面和疏松面，置于液氮中折断用于观察断面；样品经真空喷金处理后，在扫描电子显微镜下观察，加速电压为3.0 kV。

1.4.4 包埋、切片及染色样品室温下用中性甲醛固定 24 h；流水冲洗12 h除去固定液；梯度乙醇分别处理1 h；二甲苯透明30 min；将材料转移到槽中，石蜡透蜡30 min；调整好材料位置后自然冷却包埋；材料修块后固定在木块上，进行切片，厚度5.0-7.0 µm；展片机上50 ℃展片后将载玻片立于玻片架45 ℃过夜；切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇、灭菌去离子水复水；用试剂盒进行苏木精-伊红、Masson、PAS染色，封固后光镜下观察、拍照。

苏木精-伊红染色：60 ℃干燥切片；二甲苯孵育；梯度乙醇复水；苏木精染色；体积分数1%盐酸乙醇分化；0.5%伊红复染；梯度乙醇脱水；二甲苯透明；晾干后中性树胶封固，显微镜观察。

Masson染色：60 ℃干燥切片；二甲苯孵育；梯度乙醇复水；Weigert苏木素染色；酸性乙醇分化；Masson蓝化液返蓝；丽春红品红复染；弱酸、磷钼酸溶液、弱酸分别孵育切片；苯胺蓝染色液染色；弱酸工作液洗涤；梯度乙醇脱水；二甲苯透明；晾干后中性树胶封固，显微镜观察。

PAS染色：60 ℃干燥切片；二甲苯孵育；梯度乙醇复水；氧化剂洗涤；Schiff Reagent室温避光浸染；苏木精染色；酸性乙醇分化；梯度乙醇脱水；二甲苯透明；晾干后中性树胶封固，显微镜观察。

1.4.5 DNA含量测定称取约30 mg样品，用基因组DNA提取试剂盒提取DNA，通过超微量紫外分光光度计对提取的DNA进行定量，重复测定6次。

1.4.6 力学性能检测根据国家标准《GBT1040.4-2006 塑料拉伸性能测定第4部分：各向同性和正交各向异性纤维增强复合材料的试验条件》测定材料的力学性能。取制备的组织修复膜、商品口腔修复膜以及小鼠背部皮肤制成 5.0 cm×0.5 cm的哑铃状，用电子万能试验机以20 mm/min的速度拉伸，得到应力-应变曲线，根据应力-应变曲线计算最大应力、断裂伸长率和杨氏模量，重复测定3次。

1.4.7 细胞毒性检测依据国家标准《GB/T16886.5体外细胞毒性试验》，采用MTT法检测材料的细胞毒性。称取经⁶⁰Coγ射线辐照灭菌后的样品适量，加入DMEM培养液(3.0 cm²/mL)，于37 ℃二氧化碳培养箱中放置24 h，制成浸提液，同时以DMEM培养液为阴性对照；将细胞浓度为5.0×10⁶L^-1的小鼠成纤维细胞L929接种于96孔板，每组设置6个平行，培养24 h后将培养液更换成浸提液继续培养；在第1，3，5天，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，培养4 h；再加入100 μL DMSO，37 ℃振荡30 min，用酶标仪读取570 nm处的吸光值(A)。细胞相对增殖度(%)=实验组A值/阴性对照组A值×100%。参照《美国药典》毒性分级法，计算细胞相对增殖度并进行评分，评价标准为：相对增殖度值≥75%，细胞毒性等级为0或1级，无毒或轻微毒性，合格；相对增殖度值为50%-74%，细胞毒性等级为2级，中等毒性，应结合细胞形态综合评价；相对增殖度值≤49%，细胞毒性等级为3-5级，剧毒，不合格。

1.4.8 动物皮肤刺激性检测依据国家标准《GBT 16886.10-2005第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验》进行动物皮肤刺激实验。称取经⁶⁰Coγ射线辐照灭菌后的样品适量，加入生理盐水(3.0 cm²/mL)，于37 ℃二氧化碳培养箱中放置24 h，制得浸提液。选用健康、初成年体质量不低于2 kg的雄性白化兔5只，实验前24 h将兔背部脊柱两侧被毛除去，用脱毛剂将剩余毛发除净，且实验期间需要对动物反复除毛；将0.5 mL浸提液滴到2.5 cm×2.5 cm的吸收性纱布上，按对角线方式敷贴于动物背部，对照组使用生理盐水；用绷带固定敷贴片4 h，用温水清洗实验部位并拭干，在除去敷贴片1，24，48和72 h时记录各接触部位情况，按表1和表2进行计分和评价。

1.5 主要观察指标脱细胞真皮基质的理化性能以及生物相容性情况。

1.6 统计学方法采用SPSS 17.0统计分析软件进行统计分析。计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

引导骨再生主要是利用引导骨再生膜作为物理屏障，利用朝向软组织的致密面阻止非成骨细胞进入骨缺损区，形成成骨空间，利用朝向骨缺损区的疏松面允许成骨细胞优先迁移和生长，促进缺损区骨组织的修复和再生，增加骨生成量^[1-2^，¹⁵^，^18-19]。1989年，Dahlin等^[20]在临床中首次将引导骨再生技术引入牙种植过程并取得了非常理想的骨再生效果。目前引导骨再生膜已广泛应用于牙种植等口腔医学领域^[21-22]。Aloy-Prósper等^[23]对种植病例进行为期三年的临床观察发现，把引导骨再生技术应用到种植体植入后出现骨裂开或骨开窗与种植体植入后无骨缺损的患者中，在种植体成功率和种植体周围边缘骨丧失等方面差异无显著性意义。近年来，脱细胞真皮基质凭借良好的物理性能与生物相容性成为了引导骨再生膜材料的研究热点。脱细胞真皮基质是采用特殊工艺将真皮内引起宿主排斥反应的成分脱除制成的材料，只保留真皮中含胶原网架的细胞外基质及真皮层与表皮层之间的基底膜，主要成分是胶原蛋白，抗原性低，内部的纤维网状结构有利于再生细胞的黏附，此外还具有凝血作用，能够促进组织愈合^[14^，^24-28]。Rubin等^[29]发现，脱细胞真皮基质的真皮面有利于脱细胞真皮基质快速血管化，基底膜面可为上皮细胞的移行和定植提供一个天然平面，有利于脱细胞真皮基质上皮化。2000年，Fowler等^[13]首次报道了脱细胞真皮基质应用于口腔修复的情况，脱细胞真皮基质复合脱矿冻干骨可以防止牙槽嵴萎缩，具有良好的抗感染能力，且生物相容性和诱导骨再生能力强。Harris等^[30]报道了应用脱细胞真皮基质做牙根覆盖来矫治牙龈退缩，阻止了齿龈缘的进一步退缩。Simion等^[31]将引导骨再生理论用于修复牙槽嵴，经过组织学观察发现，引导骨再生技术可以增高牙槽嵴。随着引导骨再生技术的成熟，越来越多的学者将脱细胞真皮基质用于牙种植过程中，取得了良好的效果^[13-14^，^32-33]。

此次实验中制备的鱼皮脱细胞真皮基质去除了表皮层，暴露出的基底膜层为致密面，完全没有孔隙，同时得到了孔隙较多且比较均匀的疏松面，形成了双层的引导骨再生膜结构。鱼皮网状层在结构上不同于牛、猪、羊皮的编织方式。牛、猪、羊皮的网状层编织是立体三维方向基本均一的，而鱼皮则在各个网状单元层呈平面二维编织形式，各个网状单元相互叠加且它们之间主要靠一些纵向细小的胶原纤维束来联系^[34-35]。未处理的鱼皮在结构上由平面二维编织的网状单元相互叠加致密排列，处理后，原本排列致密的胶原纤维层被打断，创造出了细胞增殖、迁移的通道，可以促进缺损区骨组织的修复和再生。

作者制备的脱细胞真皮基质来源于鱼皮。鱼皮是由鱼鳞、表皮、真皮及皮下组织构成，可分为鳞面层、网状层及皮下组织层，真皮层主要由糖胺聚糖、蛋白聚糖、胶原纤维、弹性纤维和网状纤维等蛋白纤维组成，其中胶原纤维占真皮全部纤维的95%-98%^[36-38]。脱细胞处理去除了表皮层、皮下组织层，减少了抗原性物质的存在。染色结果证明细胞得到了很好的脱除，鱼皮脱细胞真皮基质几乎全为胶原纤维，无PAS阳性物质，即无糖原，证明抗原性很低。与市售哺乳动物来源的口腔修复膜相比，作者制备的脱细胞真皮基质的最大应力相对较低，但针对该类产品的力学强度并没有明确的标准要求。此外，天然脱细胞基质膜可以通过交联的方法改良力学强度，同时还可以通过交联时间或交联剂浓度控制交联强度，进而控制其体内降解速率。细胞毒性实验结果证明毒性等级为1级，属于极低细胞毒性，证明所制备脱细胞基质符合生物材料应用要求，具备促进组织再生的可能性。动物皮肤刺激实验结果证明该材料对动物无致敏性。

目前常用的口腔修复膜多来源于猪或牛等陆生哺乳动物。由于疯牛病、口蹄疫等人畜共患病的出现，人们对这类生物制品的安全性产生了怀疑。另外，某些宗教习俗禁止使用猪或牛来源的生物制品，这进一步限制了这类口腔修复膜的应用。因此，把目光投向水生生物不仅可以解决上述问题，还可以将鱼类加工副产物变废为宝，在保护环境的同时扩展胶原蛋白的原料。水生生物胶原具有低免疫原性、可促进细胞增殖、安全性好的优点^[39-42]，其人畜共患病毒传播风险也远低于陆地哺乳动物来源的猪、牛皮，临床使用的安全性更高，因此已经成为生物医学材料领域优良的原料^[11]。此外，鱼皮材料来源丰富，价格低廉，具备大规模生产的基础。虽然目前水生生物材料来源的稳定性有待提高，但已有大量研究(包括作者所在课题组进行中的项目)正在考察优化水生生物材料来源稳定性的方法，对水生生物材料应用领域的研究和拓展也将反过来带动这类材料的开发和稳定供应。实验制备的鱼皮脱细胞真皮基质保留了真皮层结构，增加了胶原纤维的间隙，具有疏松层和致密层双层结构，既具有良好的机械屏障作用又有利于新骨的生成，同时对细胞成分去除干净，免疫原性低，细胞相容性和生物相容性良好。此外，这种材料可以避免现有天然组织修复材料常见的人畜共患病毒的携带和传播的风险以及宗教习俗的影响，同时可被生物吸收，能够避免二次手术及其对患者的损伤。实验为制备用于组织修复膜的脱细胞真皮基质提供了新的思路和原材料来源，但该类产品在医学临床中的应用研究尚处于起步阶段，植入后的组织再生和生理功能等仍需进一步深入的研究，此次实验中所制备材料的进一步动物实验正在进行中。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程