白藜芦醇修复内皮细胞氧化损伤抑制促血栓分子表达的作用和机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0598

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
氧化应激：机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)产生过多，氧化系统和抗氧化系统失衡，导致组织损伤。被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。
PI3-K/Akt/GSK3β信号通路：磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3-K/Akt)通路首先在肿瘤细胞中被发现，该通路通过调控下游的多种效应分子对葡萄糖转运、细胞增殖、分化和凋亡等过程起重要调节作用，其中糖原合成酶激酶3B(GSK3B)是主要效应分子，两者联合被称为PI3-K/Akt/GSK3β信号通路。

摘要
背景：相关研究表明，白藜芦醇具有抗氧化、抑制动脉血栓的作用。
目的：探讨白藜芦醇保护内皮细胞氧化损伤，抑制深静脉血栓形成的分子作用。
方法：使用人脐静脉内皮细胞进行传代培养；实验分3组：①对照组为正常培养液中培养24 h；②H2O2组在培养液中加入200 μmol/L H2O2培养24 h；③H2O2+白藜芦醇组：先分别予以10，20，30 μmol/L的白藜芦醇预处理2 h，再加入200 μmol/L H2O2培养24 h。采用MTT法检测细胞活力；Hoechst 33258染色法、荧光显微镜观察细胞凋亡；Western blot检测P-选择素、P-选择素糖蛋白配体1、血管性血友病因子及PI3-K/Akt/GSK3β、NF-κB信号通路关键蛋白表达。
结果与结论：①与对照组相比，H2O2能够诱导内皮细胞损伤，白藜芦醇对H2O2诱导的内皮细胞损伤具有修复作用(P < 0.05)；②与对照组相比，H2O2组细胞凋亡率明显增加(P < 0.05)；与H2O2组相比，H2O2+白藜芦醇组细胞凋亡率明显减少(P < 0.05)；③与对照组相比，H2O2组P-选择素、P-选择素糖蛋白配体1、血管性血友病因子、NF-κB和GSK3β蛋白的表达显著上调(P < 0.05)，Akt总蛋白无明显变化(P > 0.05)，pAkt蛋白表达下调(P < 0.05)；与H2O2组相比，H2O2+白藜芦醇组上述蛋白表达被逆转(P < 0.05)；④结果表明，白藜芦醇能够修复静脉内皮细胞氧化损伤，对P-选择素、P-选择素糖蛋白配体1、血管性血友病因子蛋白表达具有抑制作用，其机制可能与PI3-K/Akt/GSK3β、NF-κB信号通路相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-2603-4167(何卫)

关键词: 白藜芦醇, 内皮细胞, 氧化应激, 国家自然科学基金, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Resveratrol has been shown to hold anti-oxidant and anti-arterial thrombosis effects.
OBJECTIVE: To explore the mechanism of resveratrol in repairing endothelial cell injury and inhibiting deep vein thrombosis at molecular level.
METHODS: Human umbilical vein endothelial cells were isolated and cultured. The cells were divided into three groups: control group (common medium), H2O2 group (cultured with 200 μmol/L H2O2 for 24 hours), and resveratrol plus resveratrol group (pretreated with 10, 20 and 30 μmol/L resveratrol for 2 hours, and then cultured with 200 μmol/L H2O2 for 24 hours). The cell viability was evaluated by MTT assay. The apoptotic cells were observed by Hoechst 33258 staining and fluorescence microscopy. The protein expression levels of P-selectin, P-selectin glycoprotein ligand-1, von Willebrand Factor and PI3-K/Akt/GSK3β and NF-κB signaling pathways were tested by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUTION: Compared with the control group, H2O2 could induce endothelial cell injury and resveratrol could repair endothelial cells injured by H2O2 (P < 0.05). The apoptotic rate in the H2O2 group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). Compared with the H2O2 group, the apoptosis rate in the H2O2 plus resveratrol group was significantly decreased (P < 0.05). Compared with the control group, the expression levels of P-selectin, P-selectin glycoprotein ligand-1, von Willebrand Factor, NF-κB and GSK3β in the H2O2 group were significantly increased (P < 0.05), the expression of Akt protein showed no significant change (P > 0.05), and the expression level of p-Akt protein was significantly down-regulated (P < 0.05). Meanwhile, resveratrol could reverse all above protein expression (P < 0.05). To conclude, resveratrol can repair human umbilical vein endothelial cells and inhibit the expression of P-selectin, P-selectin glycoprotein ligand-1 and von Willebrand Factor proteins, which may be related to PI3-K/Akt/GSK3β and NF-κB signaling pathways.

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Key words: Veratrum, Endothelial Cells, Oxidative Stress, Venous Thrombosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R446

何卫，娄振凯，王兵，李兴国，赵冲宇，赵学凌. 白藜芦醇修复内皮细胞氧化损伤抑制促血栓分子表达的作用和机制[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(3): 464-469.

He Wei, Lou Zhenkai, Wang Bing, Li Xingguo, Zhao Chongyu, Zhao Xueling. Resveratrol protects endothelial cells from oxidative damage and inhibits expression of pro-thrombosis molecules: the underlying mechanisms[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(3): 464-469.

图/表（结果） 1

参考文献

引言

白藜芦醇(resveratrol，RES)又名芪三酚，主要来源于花生、葡萄、虎杖、桑椹等植物，其分子结构是含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。白黎芦醇发现之初被认为是一种植物抗毒素，目前已证实白藜芦醇具有抗癌^[1]、抗炎^[2]、抗氧化应激^[3]、抗病毒活性^[4]、保护内皮细胞等作用^[5]。近年来学者研究表明，白藜芦通过激活沉默信息调节因子1 (silent InformationRegulator 1，SIRT1)增加其活性，调控下游转录分子，具有保护心血管系统的作用^[6]。国内学者对白藜芦醇的抗血栓作用进行了相关研究，闫启光等^[7]证实白藜芦醇可以抑制大鼠动脉血栓形成；陈鹏等^[8]研究指出白藜芦醇具有抗血小板聚集作用，并可以减少血栓形成。尽管如此，目前白藜芦醇在深静脉血栓形成作用方面暂无相关研究。

深静脉血栓发病率高、危害大，是骨科手术常见并发症。深静脉血栓在人体的任何静脉均可发生，以下肢静脉常见，可引起患肢肿胀、疼痛等症状，严重时有致残可能。血栓随血液循环堵塞血管可导致肺栓塞，严重肺栓塞可以在短时间内导致患者死亡，是骨科围手术期致残、致死率极高的并发症之一^[9]。邱贵兴等^[10]报告深静脉血栓形成在关节置换术后的发生率为30.18%。余楠生等^[11]报告深静脉血栓形成在膝关节置换术后发生率高达58.12%，髋关节置换术后达20.16%。吕厚山等^[12]报告深静脉血栓形成在髋关节和膝关节置换后发生率为47.11%。一项多中心研究报告全球每年约有超过1 500万人死于深静脉血栓，其主要的死因为并发肺栓塞^[13]。临床研究发现，90%以上的肺栓塞来源于深静脉血栓，尸检证实，仅不到15%的患者生前确诊为肺栓塞，漏诊率极高^[14]。因此深入探讨研究深静脉血栓形成的机制对临床预防深静脉血栓形成意义重大。

深静脉血栓属静脉回流障碍性疾病^[15]，内皮细胞结构和功能的紊乱在深静脉血栓形成中起关键始动作用^[16]，而氧化应激介导的静脉内皮细胞损伤是导致深静脉血栓形成的重要原因之一^[17]。内皮细胞损伤过程中，多种促血栓形成分子与凝血与抗凝血系统及纤溶与抗纤系统协同作用，促进深静脉血栓形成^[18]。因此，文章通过构建过氧化氢(Hydrogen peroxide，H₂O₂)诱导人脐静脉内皮细胞损伤模型，探讨白藜芦醇对H₂O₂诱导人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用，与P-选择素、P-选择素糖蛋白配体1(P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1)和血管性血友病因子(Von willebrand factor，vWF)之间的关系，最终探讨白藜芦醇对深静脉血栓形成的防治作用。

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材料方法

1.1 设计细胞学实验分析。

1.2 时间及地点实验2016年9月至2017年8月在昆明医科大学第一附属医院云南省骨科研究所完成。

1.3 材料人脐静脉内皮细胞(中科院上海细胞所)，0.25%的乙二胺四乙酸(EDTA)-胰酶、高糖Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，美国Hyclone公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT)溶液、H₂O₂、抗氧化剂白藜芦醇(resveratrol，RES)、Hochest33258(美国Sigma公司)，P-选择素、P-选择素糖蛋白配体1、血管性血友病因子、Akt、p-Akt、NF-κB、GSK3β抗体(美国CST公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养将人脐静脉内皮细胞分为3组：对照组、H₂O₂组、H₂O₂+白藜芦醇组。其中对照组在正常培养液中培养24 h；H₂O₂组在培养液中加入200 μmol/L H₂O₂培养 24 h；H₂O₂+白藜芦醇组先分别予以10，20，30 μmol/L的白藜芦醇预处理2 h，再加入200 μmol/L H₂O₂培养24 h。

1.4.2 MTT检测将人脐静脉内皮细胞调细胞浓度至2×10⁷L^-1，接种在96孔板上，每孔100 μL，加入相应浓度的H₂O₂及白藜芦醇处理。将5 mL MTT溶剂溶解成为25 mg MTT溶液，配制成质量浓度为5 g/L的MTT溶液，在每孔中加入10 μL MTT溶液，在细胞培养箱内培养4 h。然后在每孔加入100 μL甲瓒溶解液，继续培养，直至用普通光学显微镜观察到甲瓒溶解液完全溶解。在酶标仪吸光度570 nm处测量各孔吸光度值(A值)。

1.4.3 Hochest33258染色观察细胞凋亡将Hoechst 33258染色液加入到细胞中，充分覆盖住待染色的样品。将1 mL染色液加入到六孔板中的每个孔，对于96孔板每个孔需加入100 μL染色液；在37 ℃细胞培养箱中培养细胞10-20 min；用PBS洗细胞2次，每次3-5 min；封固后在荧光显微镜下观察或者直接在荧光显微镜下观察。荧光显微镜下随机选取3个高倍视野，细胞核亮度增强的为阳性表达，计算人脐静脉内皮细胞阳性细胞数和人脐静脉内皮细胞总数。人脐静脉内皮细胞凋亡率(%)=人脐静脉内皮细胞阳性细胞数/人脐静脉内皮细胞总数×100%。

1.4.4 Westernblot检测将各组人脐静脉内皮细胞用胰酶消化完全、裂解、离心、提取蛋白，采用BCA法测量相关蛋白浓度。取等量蛋白样品，按照每孔30 μg点样，依照目的蛋白相对分子质量不同，使用6%或12%的SDS-聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳90 min。待蛋白完全分离，用半干法转膜60 min，将蛋白转印至PVDF膜。在室温条件下用5%BSA的TBST将PVDF膜封闭60 min。

按相对分子质量不同剪下各目的条带分别加入稀释后的抗体：P-选择素、P-选择素糖蛋白配体1、血管性血友病因子、Akt、p-Akt、NF-κB、GSK3β抗体，在4 ℃条件下孵育过夜。提取条带，洗涤后放入稀释后的二抗管中室温条件下孵育60 min。取出条带，洗膜后的二抗管中室温条件下孵育60 min。取出条带，洗膜后ECL显色，化学发光呈像分析系统进行分析。

1.5 主要观察指标人脐静脉内皮细胞形态，细胞凋亡比例，P-选择素、P-选择素糖蛋白配体1、血管性血友病因子蛋白及PI3-K/Akt/GSK3β、NF-κB信号通路蛋白表达变化。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行相关统计学分析。采用x(_)±s来表示计量资料，采用单因素方差分析来进行组间两两比较，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

深静脉血栓的形成机制较复杂，是多种因素参与、多种促血栓因子共同作用的结果，其机制目前尚不明确^[19]。血管壁内皮受损、血管收缩、血流瘀滞，血小板黏附、激活、聚集，凝血因子级联反应，是血栓形成的基本过程。氧化应激是导致内皮细胞损伤的重要原因之一^[20]。现已在体内动物及内皮细胞培养等实验中证实低密度脂蛋白、同型半胱氨酸、高血糖、低氧、过氧化氢、活性醛等均可损伤内皮细胞^[21]。目前，诸多研究已经表明白藜芦醇具有保护内皮细胞损伤的作用。Liu等^[22]研究白藜芦醇通过降低内皮细胞氧化损伤时超氧化物歧化酶活性，减少还原型谷胱甘肽含量，最终发挥保护内皮细胞氧化应激损伤、凋亡的作用。Wang等^[23]指出，白藜芦醇可以通过活化PI3K-AKT-mTOR信号通路保护内皮细胞氧化应激损伤。刘永刚等^[24]表明，白藜芦醇可抑制caspase-3表达，减轻内皮细胞氧化损伤。与上述发现一致，此次实验研究进一步验证了白藜芦醇保护内皮细胞氧化损伤作用。

在缺氧、炎症因子、自由基及凝血酶等因素刺激下，内皮细胞损伤、凋亡，启动促血栓反应^[25]。多种促血栓形成分子在深静脉血栓形成中起关键作用。P-选择素在血栓形成、炎症反应及肿瘤转移等过程中起重要作用，其主要的机制是介导细胞与细胞间、细胞与细胞基质间的黏附^[26]。P-选择素糖蛋白配体1是白细胞表面的一种黏蛋白类型的糖蛋白，在介导白细胞黏附以及血栓形成、肿瘤转移及细胞外信号传导等过程中均发挥重要作用^[27]。血管性血友病因子贮存于内皮细胞Weibel-Palade小体内，在体内主要来

源于内皮细胞的合成与释放，在人体内血管性血友病因子表达量的变化是内皮细胞受损或功能障碍的特征性指标^[28]。为此，该研究选取以上血栓形成标志物进行检测分析，P-选择素与P-选择素糖蛋白配体1主要提示内皮细胞与白细胞间的黏附作用，血管性血友病因子主要提示内皮细胞与血小板间的黏附作用。该实验中，H₂O₂组P-选择素、P-选择素糖蛋白配体1及血管性血友病因子蛋白的表达上调，使用白藜芦醇预处理后，以上蛋白表达被逆转，提示白藜芦醇可抑制内皮细胞与白细胞的黏附，抑制血小板的黏附活化，推测白藜芦醇可能具有抑制深静脉血栓形成的作用。

目前内皮细胞损伤的机制并未完全清楚，但主要研究集中在NF-κB、PI3-K/Akt/GSK3β等信号通路。关于NF-κB功能，2011年Oeckinghaus等^[29]即详细阐述NF-κB的持续激活会通过促进细胞因子等的表达促发一系列慢性炎症过程，导致细胞的损伤进而引起疾病的发生。2004年Chandrasekar等^[30]阐释NF-κB激活后在细胞炎性反应过程起到重要的作用，可影响炎性和代谢性疾病的发病。PI3-K/Akt/GSK3β信号通路参与增殖、分化和凋亡等多种细胞功能的调节。在血栓形成过程中，PI3-K/Akt异常激活，促进血小板黏附聚集^[31]。糖原合成酶激酶 3β(Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是Akt下游因子之一，在细胞的生长、分化和细胞凋亡等生过程具有重要的调控作用^[32]，但GSK-3β在深静脉血栓形成的发生中是否参与静脉内皮细胞氧化损伤尚未见报道。基于以上研究，在该研究中，通过过氧化氢诱导的内皮细胞损伤，P-选择素、P-选择素糖蛋白配体1、血管性血友病因子、NF-κB和GSK3β蛋白的表达明显升高，而在使用白藜芦醇预处理之后，NF-κB和GSK3β蛋白表达降低，P-选择素等促血栓分子也随之下调。因此，说明了NF-κB、PI3-K/Akt/GSK3β信号通路可能共同参与过氧化氢诱导内皮细胞损伤后促血栓分子P-选择素、P-选择素糖蛋白配体1、血管性血友病因子表达，进而影响深静脉血栓形成。但该研究中Akt蛋白的表达未见明显改变，与Niwa等^[33]和Wang等^[34]学者的实验结果有所不同，可能与白藜芦醇的作用时间、浓度及相关蛋白检测时间的不同有关。

该研究虽然从细胞层面证明了白藜芦醇可以保护内皮细胞氧化损伤，并具有下调内皮细胞损伤后促血栓分子P-选择素、血管性血友病因子、P-选择素糖蛋白配体1的表达的作用，推测白藜芦醇对预防深静脉血栓形成有一定的作用。但该实验仍存在一定不足，研究仅局限于细胞层面，如果能在动物实验建立深静脉血栓动物模型，加入白藜芦醇观察静脉血栓形成情况，NF-κB、PI3-K/Akt/GSK3β通路以及促血栓分子表达变化情况，就能更进一步证明白藜芦醇抑制深静脉形成的作用机制。另外如果能继续研究白藜芦醇对促凋亡通路(MAPKs)、氧化通路(Nrf2/ARE)等信号通路以及其他促血栓分子如t-PA、TM等的影响，将更加完善白藜芦醇抑制深静脉血栓形成的作用机制，为防治深静脉血栓形成提供新的实验依据。

综上所述，该实验通过研究不同浓度白藜芦醇处理H₂O₂诱导人脐静脉内皮细胞损伤模型，来探讨白藜芦醇对内皮细胞损伤的保护作用。最终发现，白藜芦醇可以明显增加H₂O₂诱导损伤后人脐静脉内皮细胞活力，并且抑制内皮细胞氧化损伤后促血栓分子P-选择素、P-选择素糖蛋白配体1、血管性血友病因子蛋白的表达，抑制促抑制炎症反应通路(NF-κB)，并且激活抗凋亡通路(PI3-K/Akt/GSK3β)。这些综合作用的结果，可能就是白藜芦醇能够修复内皮细胞损伤的重要因素，这个结果也为进一步研究白藜芦醇成为预防血栓相关疾病的临床药物展现出乐观的前景。

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