2.1 支架材料 软骨支架材料分为天然生物材料、人工合成高分子材料和复合材料3种[5]。 2.1.1 天然生物材料 胶原：软骨组织工程支架应从结构和成分上模拟软骨细胞外基质，以期为种子细胞增殖和分化提供理想的微环境。而胶原则是最主要的软骨组织细胞外基质成分，具有很好的仿生性，来源广泛，具有水溶性好、免疫原性低、组织相容性及亲和性好、能促进细胞增殖等优点。 Kuroda等[6]对胶原凝胶的临床应用进行了报道：将自体骨髓间充质干细胞复合胶原凝胶植入患者内侧股骨髁并用自体骨膜覆盖，7个月后检查缺损处由新生组织平滑覆盖，并且番红O染色阳性。1年后，患者临床症状显著缓解，并且恢复了受伤之前运动水平，因此将Ⅰ型胶原作为骨组织工程基质材料已经引起了研究者的重视[7-8]。Ⅰ型胶原由于含有特别的识别信号，有利于软骨细胞黏附、增殖、分化，可作为良好的材料包埋添加剂。 透明质酸：透明质酸是葡糖醛酸-N-乙酰氨基葡糖为双糖单位组成的直链高分子多糖，广泛存在于组织细胞基质中，在体内可被降解为氨基葡萄糖而被人体吸收。透明质酸具有优良的生物相容性和生物可降解性。Grigolo等[9]将苯甲醇与透明质酸反应得到透明质酸苯酯，应用到软骨组织培养中得到了预期效果。实验表明人类软骨细胞产生Ⅱ型胶原而向下调节Ⅰ型胶原，说明透明质酸苯酯能够促进人类软骨细胞生长及保持其原显性。利用场发散透镜扫描显微镜方法能够发现细胞与生物材料的交缠，表明透明质酸苯酯能很好地黏附细胞。 壳聚糖：壳聚糖虽然不是人体中细胞外基质的构成物，但其结构和一些性质与细胞外基质的主要成分氨基葡聚糖非常类似[10]。壳聚糖具有良好的生物相容性和可降解性，无刺激性、无免疫原性、无热源反应，并具有促进创面愈合的功能。Cao等[11]将壳聚糖明胶网络与猪软骨细胞构建成的细胞支架复合物植入猪腹部皮下，术后16周观察到新软骨形成，其糖胺多糖分泌量达到正常软骨的78.6%，这说明壳聚糖是一种较好的软骨组织工程支架材料。但与其他的天然材料相比，壳聚糖比较难于电纺。壳聚糖支架在质地、强度上要优于胶原支架，但其质地还是相对较软。 海藻酸盐：海藻酸盐是另外一种常见的生物材料，主要从海藻中提取，其酶解产物对人体无毒害作用，具有很好的亲水性，营养物质易于渗透扩散。Paige等[12]首先采用藻酸钙水凝胶复合软骨细胞移植于小鼠皮下，产生新生软骨获得成功。但是还有学者利用藻酸钙复合软骨细胞修复兔关节缺损时，发现有20%的植入体被纤维组织取代，这说明细胞外支架材料的机械强度不足[13]。 单纯的天然生物材料来源于动物或人体，其网状结构、成分、生物力学环境等适合种子细胞的生长、发育及新陈代谢，而且材料可降解。但是它们在运用中均存在不足：胶原缺乏柔韧性、抗拉强度低，初始强度差，降解速度过快；透明质酸和海藻酸盐体内植入后由于抗压力不足[13]，不能适应重力的变化，难以维持外形而失去支撑力；壳聚糖较难于电纺，且质地较软等。另外生物材料还存在着大量制备困难，而且由于批次不同而产生质量变化等劣势，这就促使人们继续发现和研究新的材料。 2.1.2 人工合成材料 由于天然生物材料不能够直接满足软骨组织工程的要求，于是研究者便把目光投向人工合成材料。人工合成材料是一类有机高分子聚合物，具有良好的物理机械性能，可以通过调节分子量及其分布以适应不同组织的需要，作为软骨组织工程支架材料能较好诱导软骨细胞黏附、增殖和分化。 聚羟基乙酸：聚羟基乙酸是一种高度结晶亲水性的线性聚脂体，因此水溶性较佳。刘彦春等[14]将兔耳郭软骨细胞种于聚羟基乙酸支架上，回植到免体内后形成了软骨组织。但聚羟基乙酸的降解半衰期约为2周，由于降解速度过快，在工程化软骨尚未形成之前不能提供足够的支撑强度，故限制了其单独作为支架材料的运用。 聚乳酸：聚乳酸的降解半衰期为6-8周，可以提供足够时长的支架作用。Puclacher等[15]将牛关节软骨细胞接种到用聚乳酸纤维制成的支架上，获得了透明软骨组织，并发现支架对软骨细胞生长有引导作用。Cao等[16]利用聚乳酸溶液处理聚羟基乙酸，也取得了相同的结果。但作为组织工程的细胞载体，合成聚合物需要发挥其降解特性使表面不断更新，为组织细胞提供不断变化的黏附和生长界面。天然软骨的应力屈服强度非常大，通常压缩形变在60%以上，仍可恢复原状，而以聚乳酸制备的聚合物多孔支架材料多在10%形变下就已经产生应力屈服现象，这是由于支架的多孔结构和聚乳酸材料本体性质决定的。 聚羟基乙酸-聚乳酸复合物：聚羟基乙酸-聚乳酸复合物为聚乳酸和聚羟基乙酸按一定比例形成的共聚物，可以结合二者各自的特性，既能提供足够强度的支撑，又利于细胞贴附生长。Uematsu等[17]运用间充质干细胞-聚羟基乙酸-聚乳酸复合物支架复合物修复兔软骨缺损，移植12周后，肉眼可见缺损处覆盖平整并具有光泽的白色组织，组织学上为透明样软骨。聚羟基乙酸-聚乳酸复合物支架可以支持祖细胞分化并在体内成功诱导其成软骨细胞。 但是聚羟基乙酸-聚乳酸复合物的降解过程呈现先慢后快，总体较快，使得其力学特征减弱，支撑作用减弱，另外其细胞吸附力较弱，不利于软骨细胞的增殖，也成为需要改进的不足。虽然聚乳酸和聚羟基乙酸已被美国食品和药物管理局批准在人体内使用，但其亲水性差和对细胞吸附力弱等问题仍然一直困扰着组织工程学家。 聚羟基丁酸酯及其共聚物：聚羟基丁酸酯是一种高分子聚合物，由其人工合成的共聚物具有生物相容性、生物可降解性、光学活性、无刺激性和无免疫原性等特殊性质。王常勇等[18]采用聚羟基丁酸酯泡沫材料作为软骨细胞支架在体内(兔背部皮下)培育出组织工程化软骨。但由于单纯聚羟基丁酸酯易碎、热不稳定、降解时间长、可塑性和机械性能差等缺点限制了它的广泛应用。 2.1.3 复合材料 尽管人工合成高分子材料有着良好的可降解性、可吸收性、材料的吸收率可以通过共聚单位的相关比例来控制等优点，但亲水性差，细胞吸附力较弱，其酸性降解产物易引起无菌性炎症发生，聚合物中残留的有机溶剂可引起细胞毒副作用，以及可能引起周围组织的免疫反应和纤维化。该类材料的研究指向材料的改性、表面修饰和复合不同材料以克服上述缺陷。将两种或两种以上具有互补特性的生物相容性可降解材料按一定比例和方式组合，并选择适宜的制备工艺，可以设计构造出能够满足软骨组织工程所需的结构和性能优化的三维支架复合材料。 胶原-壳聚糖复合支架：胶原是人体结缔组织的主要成分，来源广泛，具有水溶性、免疫原性低、组织相容性和亲和性好、促进细胞增殖的优点[19]，但机械性能差。壳聚糖是惟一带正电荷的碱性多糖，无毒、无刺激，具有生物相容性和可降解性等优点，其大分子链是纤维刚性结构，含有大量带正电荷的氨基和羟基，与胶原结合形成大分子聚电介质复合材料可以提高胶原的机械强度，其组织相容性、透明性和力学性能都很好，具有可控的降解吸收率。Shi等[20]将两者混合制备多孔支架材料，其机械强度会有所增强。 复合左旋聚乳酸支架：复合左旋聚乳酸支架具有一定的机械强度，它能维持工程组织预定的形状，有利于细胞接种和分布，可为细胞增殖分化创造良好的微环境，是一种有前途的软骨组织工程支架[21]。Ma 等[22]借助石蜡球制作高孔隙率复合左旋聚乳酸支架，在减压情况下加Ⅰ型胶原，以未经胶原修饰过的左旋聚乳酸支架为对照组，将体外细胞悬液分别注入实验组和对照组，结果显示实验组细胞分布均匀，更快地扩散于支架，说明以Ⅰ型胶原修饰的复合左旋聚乳酸支架能提高其细胞相容性。与在裸鼠皮下种植的单纯左旋聚乳酸支架相比，复合支架有更多更均匀的软骨组织形成，且软骨组织保持原有的支架形态。利用表面修饰技术，经胶原包埋的复合左旋聚乳酸支架培养软骨细胞，才能保持两者的优点，并促进其增殖生长[23]。 壳聚糖/藻酸盐/透明质酸钠复合支架：Hsu等[24]将软骨细胞植入精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸肽表面喷涂修饰的壳聚糖/藻酸盐/透明质酸钠复合支架，发现软骨细胞能良好地在支架上黏附生长和繁殖，并分泌丰富的糖胺聚糖和Ⅱ型胶原。将细胞支架复合物植入兔关节软骨缺损处，8周后缺损区完全修复。但其力学性能较差，不能满足膝关节软骨组织工程的要求。研究表明壳聚糖和海藻酸对于增加支架的生物相容性、亲水性、黏附力和细胞增殖有促进作用，可以考虑添加支架表面修饰材料的做法。 纳米羟基磷灰石/胶原支架：陈鹏等[25]将其负载骨髓间充质干细胞修复兔颅骨15 mm缺损，结果表明修复区无炎症和排异反应，具有良好的组织相容性，8周后有较好的新骨组织形成并修复颅骨缺损区。纳米纤维材料的优点在于高孔隙率、可调节的孔径分布、高表面积体积比、天然细胞外基质相似的形态结构以及间充质干细胞的骨诱导性。此支架目前被广泛关注，并应用于骨的组织工程中，而在软骨组织工程的研究较少，不甚成熟。 左旋聚乳酸-聚已内酯复合支架材料：半月板组织工程支架材料需要有良好的初始力学强度及黏弹性，由于左旋聚乳酸脆性太高及聚已内酯体外完全降解需要二三年等缺点，限制了其在半月板组织工程中的应用。既往研究证实通过对左旋聚乳酸与聚已内酯的组成比、分子量、分子量分布等控制合成其共聚物，可调整其生物降解速度和力学强度，能够获得符合需要的支架材料[26]。其另一优势在于制备的多样性可以使用传统的冻干技术，也可以用于静电纺丝工程，制作纳米级纤维，使得支架有更好的孔隙率和塑形。 刘斌等[27]实验采用的支架材料以聚已内酯为软段，左旋聚乳酸为硬段，利用聚已内酯很好的柔韧性和可加工性及左旋聚乳酸的高强度特性，按组成比1∶2开环共聚合成二嵌段共聚物左旋聚乳酸-聚已内酯。扫描支架表面为多孔状，孔隙分布均匀，孔隙间相互连通，孔壁为纤维网状连接，纤维直径150-350 nm，孔隙率为93%，证明具有良好的力学强度及孔隙率。 2.2 支架的制备方法 软骨组织工程支架作为软骨细胞外基质的替代物，其外形和孔结构对实现其作用和功能具有非常重要的意义。可降解性、多孔支架孔径、孔隙率、连通孔径等结构参数决定着支架的力学性能，支架的结构特征直接影响着种子细胞的迁移、分化和增殖。目前已研究出多种制备支架的方法, 因而需要根据不同的支架的材料及要达到的修复目的选择不同的制备工艺。 2.2.1 相分离法 应用相分离原理开发的最常用的制备三维支架技术就是冷冻干燥技术。其原理是将聚合物溶液、乳液或水凝胶在低温下冷冻，诱发相分离，体系稳定后会形成富溶剂相和富聚合物相，然后经真空冷冻干燥除去溶剂而形成多孔泡沫结构支架，泡沫的形态受冷却时相转变的控制。支架的孔形态、机械性能、生物活性和降解性能可由溶液中不同的聚合物浓度，第二相的体积分数，淬火温度及不同的聚合物和溶剂控制[28]。Guo等[29]用此法制备的胶原-壳聚糖多孔支架材料孔隙大小较均一，平均孔径为200 μm，材料表面有一定的皱折，孔隙间能够相通，用于修复关节软骨缺损取得良好效果。用该方法行支架的制备不涉及毒性大的有机溶剂，还可结合释放生物活性物质。但该方法的缺点是其产生的微孔大小难以控制且不规则。 2.2.2 溶剂浇铸/粒子沥滤技术 该方法先将高分子材料制成液态，可以是溶解或熔化,然后在液体中加入不溶(或不熔)的粒径范围一定的致孔剂，将该液体混合物固化 (溶剂挥发或降温凝固)，最后用高分子材料不溶而微粒溶解的溶剂将微粒浸泡沥出，制成不含粒子的多孔隙高分子支架。Lee等[30]通过该技术制备的聚乙二醇水凝胶支架，其孔隙率为87%-90%，孔径大小在115.5-220.9 μm之间。种植软骨细胞后，软骨细胞在微孔内伸展生长，并产生大量的细胞外基质和葡萄糖胺聚糖。能用该法致孔的聚合物有聚羟基乙酸、聚乳酸及其共聚物等[31]。粒子致孔法简单、适用性广，孔隙率和孔尺寸易独立调节，是一个较为通用的方法。但该方法的缺点是致孔时往往需用到有机溶剂，制备的支架有厚度限制，易形成致密表面皮层，难以形成通透孔结构[32]。 2.2.3 气体发泡技术 该技术利用了不同压力下气体在固体中溶解度不同的原理，通过压力的改变在聚合物中形成气腔，并最终形成三维多孔支架。气体发泡法主要有物理发泡法和化学发泡法两种，前者可以避免有机溶剂的使用，且常常与粒子沥滤法相结合使用，制备出了性能较好的支架。后者主要是将聚合物溶液和碳酸盐类化合物混合后浇铸成型，待有机溶剂挥发后再进行加热处理, 最后经冷冻干燥而制得支架[33]。Lee等[34]利用热致碳酸氢铵分解出CO2和NH3, 采用气体发泡法并结合其他方法曾经制备了左旋聚乳酸纳米-微米双重孔结构的多孔支架。但同冷冻干燥法相似，此法的缺点在于不能很好的控制支架的孔径和孔隙率。 2.2.4 快速成型技术 用于组织工程支架制备的主要有3种。 三维打印技术：三维打印技术是在计算机的控制下“打印喷头”依次“打印”出聚合物粉末和黏结剂(通常为溶剂)，黏结剂将粉末黏合成一层，经逐层打印，即可形成三维支架[35]。Schek等[36]用该方法制造聚乳酸/羟基磷灰石双层软骨与骨复合支架，动物实验发现可在异位同时促进骨和软骨生长。 熔融沉积成型：该方法采用丝状材料为原料，用热熔喷头使半流动状态的材料流体按CAD/CAM分层数据控制的路径挤出来，并在指定的位置沉积凝固成型、逐层沉积，凝固后形成多孔支架，该技术可以作为制造具有模拟人体器官生理结构特点的人造器官模型的方法，适合于人工骨的制造。Cao[37]和他的同事们利用此方法制备了聚已酸内酯多孔支架，用于体外培养成骨细胞与软骨细胞，两种细胞都增殖、迁移并与支架表面整合为一体，表明此支架用于骨缺损修复具有发展潜力。 选区激光烧结：该方法利用激光束来选择性地烧结聚合物或者混合物(聚合物/陶瓷，多相金属)粉末，从而形成材料层。由于粉末在成形时被压缩得不紧密，所以用选区激光烧结的制品常常是多孔的，并且通过调节成形过程的参数，孔率可以得到控制。 2.2.5 静电纺丝法 1934年Formalas发明了用静电力制备聚合物纤维的实验装置并申请了专利，静电纺丝技术是聚合物溶液或熔体在静电作用下进行喷射拉伸而获得纳米级纤维的纺丝方法，能简单而可控的使有机大分子形成纳米纤维，通过电纺制作的材料具有较大的面积-体积比和孔隙率，这对于其降解速度、蛋白吸附和细胞黏附等特性将非常重要。将天然材料与高分子材料混合电纺，能使电纺材料模拟天然生物组织的微观结构，并且使其应用为细胞外基质成为可能。具有纳米结构的多孔高分子材料和生物材料可以作为临时细胞外基质用作组织工程支架，为细胞的黏附提供位点并可指导细胞与支架的相互作用[38]。Li等[39]将聚己内酯用静电纺丝技术制成一种纳米纤维支架与骨髓干细胞复合并在不同的培养环境中分别诱导形成了脂肪组织、软骨组织、骨组织。 由于电纺技术的良好应用范围，科学家进一步研究出同轴共纺技术，在电纺材料中加入功能性物质，如酶、生长因子、药物、DNA、多肽及一些其它的具有生物活性的分子，使其在组织工程支架的应用中具有特异性释放功能。实验结果显示具有壳-芯结构的纤维可以达到这一要求，其中芯结构部分控制功能性物质的储藏，壳结构部分控制释放动力学[40]。 Jiang等[41]通过同轴共纺技术制备以聚己内酯为壳、牛血清白蛋白为芯的纤维，用于控制蛋白释放，结果表明，牛血清白蛋白的装载比例和释放速度可通过电纺时的给料速度来控制。将聚乙二醇添加到壳内进一步改善牛血清白蛋白的释放行为：随着聚乙二醇含量的增加，牛血清白蛋白释放速度也增加；大部分牛血清白蛋白都可以在1周到1个多月内从壳-芯式纤维中释放出来。以上研究表明同轴共纺技术能够将天然材料和合成材料有效融合在一起，既能发挥天然材料良好的生物相容性作用，又可利用合成材料良好的机械性能和可加工性，同时还能保证活性因子的缓慢释放。 静电纺丝法技术是现阶段惟一能够直接、连续制备聚合物纳米纤维的方法，并且具有较好的前景，该技术已经发展成为制备生物支架材料的最有效的方法之一[42]。软骨组织工程中较为理想的支架材料是左旋聚乳酸-聚已内酯复合三维支架，而且可以应用静电纺丝法制备此支架[43]。经张建松等[43]实验后通过各项性能的综合评价，纺丝液质量分数6%的P(LLA-CL)(50/50)制得纳米纤维的各项性能都有着充分的优势，且具有良好的生物相容性。"