2.1   磁性壳聚糖微球的形态   扫描电镜显示，壳聚糖与Fe3O4纳米粒子形成的复合微粒呈球状，纳米粒子被包裹在微球内，为核壳结构，微球表面较平滑，单分散性好；微球粒径介于1-15 μm之间，该粒径利于微球在反应体系中分散和磁分离，见图2。"

2.2   加酶量对酶固定化的影响   平行称取5份50 mg磁性壳聚糖微球，分别加入不同质量浓度的酶液5 mL进行固定，测试固定化酶的活力，计算固定化酶活力回收率及相对活力。 由图3可以看出，固定化酶活力随着加酶量的增加而增加，但酶的活力回收率却随加酶量的增大而减少。这是因为载体承载乳糖酶的能力有一定限度，当酶的质量浓度明显超过载酶量时载体被饱和。故加酶量不是越大越好，为适应工业化生产需要需兼顾固定酶的相对活力和活力回收率，当加酶量为0.3 g/L时酶的活力回收率达20%左右，相对活力为60%。考虑活力回收率不高，可将未固定的酶加入下一次固定化过程中。"

2.3   不同戊二醛用量制备磁性壳聚糖微球对酶固定化的影响  如图4所示，随着制备磁性壳聚糖微球时戊二醛用量的增加，固定化酶的相对活力不断增加，当达到一定值以后略有减小。分析原因可能是当戊二醛用量较低时载体机械强度较差，酶在固定化后仍容易脱落；而当戊二醛用量过高时，除了过量的戊二醛自身发生羟醛缩合固化成不规则物附在产物表面，影响微球的表面孔结构，使得酶不易被固定外，酶与载体上过多的醛基反应也会引起酶的构象改变，降低酶活性。因此，选择戊二醛用量为10 mL制备的磁性壳聚糖微球作为乳糖酶的固定化载体。"

2.4   固定化pH值的确定   由于游离乳糖酶的最适合pH值为6.8左右，因此考虑在pH=6.4，6.8，7.0，7.2条件下固定化乳糖酶，测得固定化乳糖酶的相对活力如图5。乳糖酶通过静电吸附固定在磁性壳聚糖微球表面，溶液酸碱度的变化会影响微球表面活性基团的电性，同时也会影响乳糖酶所带的电荷，从而影响乳糖酶在磁性壳聚糖微球表面的吸附。在固定化过程中，酶与载体的多位点结合使固定化酶的构象更加稳定，降低了外部溶液对固定化酶分子结构的影响。由图5可知，当pH=7.0时固定化酶的相对活力最大。"

2.5   固定化时间对酶固定化的影响   平行取6份50 mg 磁性壳聚糖微球，各加入5 mL质量浓度为0.3 g/L的乳糖酶磷酸盐缓冲液(pH=7.0)，在恒温震荡器中震荡1 h后，分别于   4 ℃静置1，2，5，10，15，20 h 进行固定化，测试并固定化酶的活力，计算相对活力。 由图6可以看出，延长固定化时间固定化酶活力升高，但到5 h后趋于稳定，故确定固定化时间为5 h。"

2.6   固定化酶和游离酶的酶学性质   酶固定化以后，酶的催化功能也由原先的均相体系反应变为固相-液相不均相体系反应，从而引起酶的性质变化。 2.6.1   固定化酶和游离酶的最适作用pH值   在室温下分别将一定量固定化乳糖酶和游离乳糖酶置于用不同pH值(4.4，5.2，6.0，6.4，6.8，7.2，8.0)缓冲液配制的底物中，于   39 ℃反应10 min后加入2 mL Na2CO3(1 mol/L)灭活，测定A420，计算相对酶活力，结果如图7所示。 由图7可知，游离酶的最适作用pH值在7.0左右，固定化酶的最适作用pH值为6.8。pH值对酶促反应的影响十分复杂，酶蛋白分子上带有很多酸性、碱性氨基酸残基，pH值的变化直接影响到这些残基侧链基团的解离状态。侧链基团的不同解离状态可能直接影响底物的结合和进一步的催化反应，也可能影响到酶的空间结构，从而影响到酶的活性。在实验的整个pH值范围内，固定化酶的相对活力高于游离酶的相对活力。这是由于酶经过固定化后在酶的周围形成一个对酶蛋白起到保护作用的微环境，减弱了因溶液改变而对酶蛋白构像和活性基团的破坏作用，使得固定化乳糖酶有一个更宽的pH值范围[19]。 其他研究也表明固定化酶具有较好的pH值稳定性，相对于游离酶具有更宽的pH值适用范围[20]。壳聚糖上含有大量的氨基和羟基，使其在碱性溶液中具有一定的缓冲作用，减弱外部溶液对酶蛋白和活性基团的破坏作用在最适pH值范围内。也可能是因为酶的固定化过程中与载体的多位点结合使得固定化酶分子的构象更加稳定，减弱了因外部溶液变化对酶分子构象的影响[21]。"

2.6.2   固定化酶和游离酶的最适作用温度   在不同温度(25，35，40，45，50，55 ℃)下分别对游离酶和固定酶活力进行测定，计算相对酶活力，结果如图8所示。 一方面，随着温度升高活化分子数增多，酶反应速度加快；另一方面，随着温度升高酶蛋白逐渐变性失活。低温也会使酶活性降低，但酶不被破坏，当温度回升时酶的催化活性又随之恢复。由图8可知，游离酶的最佳催化温度为40 ℃，固定化酶最佳催化温度为45 ℃，比游离酶提高了5 ℃，说明固定化后的乳糖酶温度耐受性有所提高。 也有研究表明固定化后的乳糖酶热稳定性提高，可以适应相对较高的温度[19]。固定化酶热稳定性提高是因为固定化后酶与载体之间相互作用，使得酶分子结构刚性增强，使其抗拒热变性作用的能力提高，因此固定化乳糖酶具有更好的热稳定性。也可能是因为固定化后酶分子之间及酶与载体之间的相互作用使得酶分子结构刚性增强，因而抗拒热变性作用能力增加所致，游离酶由于缺乏这些作用力，较容易因为去折叠而变性[22]。  2.6.3   米氏常数Km的测定   采用赖-布二氏法测定酶的表观动力学常数Km。"

将米氏方程的形式适当改变，得： 这个公式相当于y=ax+b，是一个直线方程式，其斜率为Km/Vm，截距为1/Vm，直线与1/S轴的交点等于-1/Km。通过测出不同浓度反应底物下酶的活性，再以底物浓度的倒数(1/S)为横坐标，以反应速度倒数(1/Vm)为纵坐标进行线性拟合。由相应线性方程中的截距和斜率求出米氏常数Km和最大反应速率Vmax，见图9。游离酶与固定化酶的Km和Vmax值检测结果见表2，3。 计算得出：游离酶Km=3.06×10-5 mol/L，固定化酶Km=1.40×10-5 mol/L。Km是使反应系统中有一半的酶分子处于被底物饱和状态时所必须具有的底物浓度。通过比较，经磁性壳聚糖微球固定化后的乳糖酶的米氏常数比游离酶下降，说明乳糖酶在固定化后其结合底物的能力有所增强。这可能是由于壳聚糖的静电效应使壳聚糖微球对附近底物的吸附力增强，从而使固定化酶周围的底物浓度要比溶液中高，导致底物与酶的结合能力增强，反应速率加快。这样对固定化酶在实际生产上的应用是十分有利的，可以使物质的转化反应更为充分和完全。"

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2.6.4   固定化酶的重复使用稳定性   将50 mg固定化酶在相同条件下连续反应5次，每次反应后分别测定酶活力，结果如图10所示，固定化酶反复使用5次后酶活仍保持了65%。"

2.6.5   固定化酶的贮存稳定性   将固定化酶和液体酶置于4 ℃冰箱保存，分别于一定时间取出测其酶活力。由图11可以看出，乳糖酶被固定化后其贮存稳定性有所提高，放置30 d后固定化酶的相对酶活力仍能达到60%以上，而液体酶的相对酶活力则下降至30%左右。"