耻骨联合可作为组织工程种子细胞的供区?

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.11.011

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (11): 1972-1980.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.11.011

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耻骨联合可作为组织工程种子细胞的供区?

葛成¹，臧晓霞²，邹敬才¹，于开涛¹，孙海燕¹，张志光³

1解放军307医院口腔科，北京市 100071
2解放军空军总医院口腔科，北京市 100142
3中山大学附属口腔医院颌面外科，广东省广州市 510055

收稿日期:2012-11-14 修回日期:2013-01-09 出版日期:2013-03-12 发布日期:2013-03-12
通讯作者: 张志光，硕士，教授，主任医师，中山大学附属口腔医院颌面外科，广东省广州市 510055 drzhangzg@163.com
作者简介:葛成☆，男，1972年生，山东省人，汉族，2003年解放军第四军医大学口腔医学院毕业，博士，副主任医师，主要从事口腔临床、科研及教学工作。 gechengde@163.com

Pubic symphysis: A donor area of tissue engineering seed cells?

Ge Cheng¹, Zang Xiao-xia², Zou Jing-cai¹, Yu Kai-tao¹, Sun Hai-yan¹, Zhang Zhi-guang³

1 Department of Stomatology, the 307 Hospital of PLA, Beijing 100071, China
2 Department of Stomatology, Air Force General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100142, China
3 Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Hospital of Stomatology, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510055, Guangdong Province, China

Received:2012-11-14 Revised:2013-01-09 Online:2013-03-12 Published:2013-03-12
Contact: Zhang Zhi-guang, Master, Professor, Chief physician, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Hospital of Stomatology, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510055, Guangdong Province, China drzhangzg@163.com
About author:Ge Cheng☆, Doctor, Associate chief physician, Department of Stomatology, the 307 Hospital of PLA, Beijing 100071, China gechengde@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：耻骨联合是与关节盘、半月板或椎间盘具有相同性质的组织，但是将其作为组织工程种子细胞供区的研究，至今鲜有报道。
目的：观察耻骨联合作为组织工程种子细胞供区的可行性。
方法：取大鼠的耻骨联合组织进行苏木精-伊红、阿尔新蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，观察细胞外基质的组织学特征。再将分离自大鼠耻骨联合组织的细胞，在体外培养扩增后，与藻酸盐凝胶支架复合立体培养，通过活细胞荧光标记方法，观察细胞存活率，通过21 d长期培养观察细胞增殖情况。测量8具成年男性骨盆标本的耻骨联合软骨区的体积，判断其是否有利于分离足够数量的种子细胞。
结果与结论：苏木精-伊红染色显示，大鼠耻骨联合组织有大量平行或交叉排列的纤维束，细胞单独散在、成对或成行排列分布于纤维束之间的陷窝内。阿尔新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色发现，大鼠耻骨联合组织广泛着色，细胞及陷窝附近着色较深。藻酸盐凝胶支架为多孔结构，孔隙间交互通连，孔隙直径为(27.0±16.7) μm，孔隙壁较光滑。在支架上细胞存活率为(72.4±4.5)%。在体外长期培养过程中，支架上的细胞呈圆球形，逐渐形成“同源细胞群”，培养13 d时观察到的细胞团，在第21天时明显增大，所含细胞数明显增多。成年男性耻骨联合组织的体积为(1.13±0.21) cm³。结果证实，大鼠耻骨联合组织细胞具有软骨细胞的排列特征，细胞外间质有软骨组织特异性基质成分。取自大鼠耻骨联合的细胞，在体外立体培养具有持续的增殖能力，耻骨联合组织可作为软骨组织工程种子细胞供区。成年男性耻骨联合组织量较大，有利于分离获取较多的原代细胞。

关键词: 组织构建, 骨组织构建, 耻骨联合, 形态学, 软骨, 细胞外基质\增殖, 立体培养\种子细胞供区, 组织工程, 省级基金, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Pubic symphysis is the same kind of tissue as the temporomandibular joint disc, meniscus or intervertebral disc, but it is rarely reported that pubic symphysis can be used as a donor area of tissue engineering seed cells.
OBJECTIVE: To explore the feasibility of the pubic symphysis as the donor area of tissue engineering seed cells.
METHODS: Hematoxylin-eosin stain, alcian blue stain and type Ⅱ collagen immunohistochemical study were used to detect the histological features of the extracellular matrix of rat pubic symphysis tissue. Cells derived from rat pubic symphysis were cultured in three-dimensional alginate scaffold in vitro. Cell viability in scaffold was detected by living cells fluorescence staining. Cells proliferation in the alginate scaffold cultured in vitro for 21 days was observed. Eight pelvis specimens of adult men were used to measure the cartilage volume of the pubic symphysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Parallel and crossing fibrous bands were spread in the rat pubic symphysis tissue, and between them there were small round or short-fusiform cells in the lacunae, with basophilic cytoplasm. Cells were in pairs or lined up. Sections stained with alcian blue and type Ⅱ collagen antibody showed positive in the cytoplasm and extracellular matrix surrounding the round lacunae, whereas the matrix farther from cells stained lightly. Alginate gel scaffold displayed a porous structure with (27.0±16.7) μm pore diameter. Cell viability in the scaffold was (72.4±4.5)%. The spheroidal cells in the alginate gel grew into isogenous group after long-term three-dimensional culture in vitro. Cell clusters were observed after cultured for 13 days, and became larger with more cells after 21 days culture. Pubic symphysis cartilage region of adult man was wedge shaped with thick front part and its volume was (1.13±0.21) cm². It turns out that cells of the rat pubic symphysis have the chondrocyte features as alignment and specific histological stain of cartilage tissue. Cells derived from the pubic symphysis proliferate well in three-dimensional culture in vitro. Volume of adult man pubic symphysis cartilage is large enough as a donor site to supply cartilage mass for cells isolation.

Key words: tissue construction, bone tissue construction, pubic symphysis, morphology, cartilage, extracellular matrix, proliferation, three-dimensional culture, donor area of seed cells, tissue engineering, provincial grants-supported paper, tissue construction photographs-containing paper

中图分类号:

R318

葛成，臧晓霞，邹敬才，于开涛，孙海燕，张志光. 耻骨联合可作为组织工程种子细胞的供区?[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(11): 1972-1980.

Ge Cheng, Zang Xiao-xia, Zou Jing-cai, Yu Kai-tao, Sun Hai-yan, Zhang Zhi-guang. Pubic symphysis: A donor area of tissue engineering seed cells?[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(11): 1972-1980.

图/表（结果） 9

2.1 大鼠耻骨联合软骨的组织学形态 见图2。

新鲜SD大鼠耻骨联合组织标本常规苏木精-伊红染色后，切片在光镜下观察，耻骨联合组织中有大量平行或交叉排列的纤维束，细胞较小，胞浆嗜碱性着色，细胞呈圆形、卵圆形或短梭形，位于陷窝内，分布于纤维束之间，有的单独散在，更多的成对存在或排列成行。

新鲜SD大鼠耻骨联合组织标本阿尔新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示，耻骨联合组织广泛着色，细胞及陷窝附近着色深，细胞外间质部分着色较浅，两侧近耻骨关节面部分软骨细胞排列更像透明软骨，见图3，4。

2.2 大鼠耻骨联合软骨细胞在藻酸盐凝胶复合物中的分布 藻酸盐凝胶支架在湿润状态下，呈无色透明的均质样外观。细胞与支架复合后，在相差显微镜下通过调节对焦平面的高度，可以观察到分散悬浮在凝胶支架中不同高度的细胞，细胞单个存在，呈圆球形，见图5。扫描电镜下，见藻酸盐凝胶支架为多孔结构，孔隙间交互通连，直径为(27±16.7) μm。孔隙壁较光滑，未观察到细胞贴附于孔隙壁的现象，见图6。

2.3 大鼠耻骨联合软骨细胞在藻酸盐凝胶复合物中的活性 免疫荧光标记结果显示，(72.4%±4.5)%的细胞显示出绿色荧光，见图7，细胞存活率即为(72.4±4.5)%。

复合物在体外长期培养过程中，相差显微镜下可见细胞逐渐形成“同源细胞群”，表现出持续增殖的现象，培养13 d时观察到的细胞团，见图8A，在培养第21天时明显增大，所含细胞数增多，见图8B。

2.4 成年男性耻骨联合软骨的解剖学测量结果 成年男性骨盆的耻骨联合区为一个前部较厚、后部较薄的楔形片状组织，前部的厚度约为后部的2倍。前(腹侧)面较平直，后(背侧)面突度较大，上端比下端圆钝，矢状切面近似于一个椭圆形。其上下、左右、前后径测量结果见表1。

根据前述公式及测量数据，计算出成年男性骨盆耻骨联合软骨组织的体积为(1.13±0.21) cm³。

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引言

颞颌关节盘、半月板及椎间盘病损破坏后，难以自行修复，此类病损一直是临床上亟待解决的一类难题。组织工程化骨、软骨、皮肤及肌腱等组织已经在猪、羊和狗等大型动物中成功构建，修复了相应的组织缺损^[1]。部分组织工程化组织已经在初步的临床应用中获得成功^[2]。这些成果提示组织工程技术在修复颞颌关节盘、半月板或椎间盘缺损或构建完整的关节盘、半月板或椎间盘方面将大有可为。目前，颞颌关节盘、半月板和椎间盘组织工程研究仍处于早期阶段，尤其是关于关节盘构建的相关报道很少。

利用组织工程技术构建一个组织，首先要选择种子细胞来源，可以考虑经干细胞诱导分化，或者直接从要构建的组织、或与其相同性质的组织获取种子细胞。目前干细胞诱导分化研究尚不成熟，所以，从关节盘等目标组织自身、其他相同性质的组织或者异体组织中分离获取种子细胞是比较合适的。但是，关节盘、半月板或椎间盘在各自关节中承担着重要的功能，体积不大，几乎没有非负重区，如果用自体软骨细胞移植的方式从缺损附近的部位切取部分组织用来分离获取种子细胞^[3]，虽可用于实验研究，但不适合将来的临床应用，而异体组织来源的种子细胞存在慢性免疫排斥反应，至今尚无满意的解决方法^[4]。所以，目前适合用做细胞供体的组织仍然以自身的、与关节盘、半月板或椎间盘性质相同或类似的其他组织为好。

人体中与关节盘、半月板或椎间盘具有相同性质的组织有：髁状突关节软骨、胸锁关节的关节盘、耻骨联合、髋臼唇、以及一些肌腱、韧带附着于骨的部位[^5-6]。那么，是否可以从这些组织中，选择对健康和功能影响小的，作为供区来分离获取细胞，作为关节盘、半月板或椎间盘组织工程研究的种子细胞呢？在国内外文献中尚未见报道。

耻骨联合是一个2次软骨关节^[7]，是一个可选择的供体组织。然而，至今关于耻骨联合的文献报道，主要是与怀孕相关的耻骨联合组织改建方面，却没有将耻骨联合组织作为种子细胞供区为目标而进行的相关研究。

作者既往研究证实，从耻骨联合组织中分离的细胞，在体外培养过程中，保持了软骨细胞的一些特性^[8-9]。但若从组织工程研究的角度出发，更关心的应该是该组织的细胞和细胞外基质的主要构成，从该组织分离细胞在体外立体培养、与支架材料复合生长的情况，考虑未来用于临床，人体中该组织的体积是否足够大，以便作为供区分离出足够的种子细胞，这些是要首先研究的基本问题。

实验对取自SD大鼠的耻骨联合组织进行组织学观察，以了解耻骨联合组织特点，再将从该组织分离获取的细胞，在体外培养扩增后，与藻酸盐凝胶支架复合，观察在体外立体培养下的情况，为进一步的体内试验做准备。实验从未来临床应用的角度考虑，测量成年男性的耻骨联合，观察其是否具有适当的体积作为细胞供体组织。

材料方法

设计：体外组织学、细胞学观察实验。
时间及地点：于2009年6月至2011年1月在中山大学干细胞与组织工程研究中心完成。
材料：
实验动物：健康SD大鼠20只，购自中山大学北校区动物实验中心。
实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》^[10]。
骨盆标本：成年男性骨盆标本8具，生前无骨代谢性疾病，年龄30-60岁，由中山大学解剖学教研室提供。
大鼠的耻骨联合组织学观察实验的主要试剂及仪器：
Main reagents and instruments for histological observation of rat pubic symphysis:

方法：
耻骨联合的组织学观察：
苏木精-伊红染色观察细胞形态：SD大鼠麻醉致死后，切取耻骨联合组织，标本立即置于新鲜配制的40 g/L多聚甲醛中，4 ℃下固定24 h，以石蜡包埋，沿冠状面制作5 μm切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察。
组织化学及免疫组织化学染色观察细胞外基质情况：将新鲜SD大鼠耻骨联合组织标本沿冠状面制作 8 μm冰冻切片，丙酮固定15 min，体积分数1%酸性阿尔新蓝室温染色30 min，0.1 mol/L盐酸分色，蒸馏水洗，光学显微镜下观察。
按PowerVision^TM试剂盒说明的两步法进行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：切片经过氧化氢处理后，进行酶修复，用1∶100稀释的抗体，4 ℃孵育过夜，DAB显色，苏木精复染，常规脱水，透明，封固，光学显微镜下观察。用已知的阳性切片同时同条件下染色作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。
大鼠耻骨联合细胞的分离、培养及传代：无菌条件下切取大鼠耻骨联合软骨组织，在解剖显微镜下仔细去除软骨周围的软组织，剪成约0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm大小碎块，含双抗的磷酸盐缓冲液(含青霉素、庆大霉素各100 U/mL)冲洗3遍，加入10倍体积的2.5 g/L胰蛋白酶，置于37 ℃恒温摇床内消化30 min。静置5 min后，弃去上清液，加入含15%血清的培养液中止胰蛋白酶，静置5 min，PBS洗涤2次，弃上清液。然后再加入5 mL 质量浓度2 g/L的Ⅱ型胶原酶(以含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液配制)，置于37 ℃恒温摇床内分别消化6 h。以200目筛网过滤去除未消化的软骨残渣， 1 000 r/min(离心半径17.3 cm)离心5 min。沉淀细胞以PBS洗2次，洗去胶原酶。加入DMEM/F12培养液，其中含有体积分数15%胎牛血清、质量浓度50 mg/L维生素C、青霉素和庆大霉素各100 U/mL。
细胞-藻酸盐凝胶复合物的制备：胰酶消化法离心收集体外培养的第4代耻骨联合软骨细胞，与质量浓度12 g/L低黏度海藻酸钠溶液混合，细胞浓度为5×10¹⁰ L^-1。将细胞-藻酸钠混合物注入直径7 mm、高2 mm的圆盘形中空模具内。在细胞-藻酸盐混合物上滴加102 μmol/L CaCl₂溶液，使钙离子与藻酸钠发生交联10 min。用培养液浸泡洗涤复合物两次后，以含有体积分数15%FBS、维生素C质量浓度50 mg/L，青霉素、庆大霉素各100 U/mL的DMEM/F12培养液在37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。相差显微镜下观察细胞在复合物中的分布情况。将细胞-藻酸盐凝胶复合物于体积分数2.5%戊二醛中4 ℃固定，体积分数1%锇酸后固定，体积分数50%-100%乙醇逐级脱水，二氧化碳临界点干燥，高真空下纯金镀膜，扫描电镜观察支架结构。
细胞在藻酸盐凝胶复合物中的活性及体外增殖检测：按照Vybrant^TMCFDA SE活细胞示踪试剂盒说明，通过荧光探针标记的方法观察复合物中的细胞活性。从细胞-藻酸盐凝胶复合物的培养皿中吸弃培养液，加入已经 37 ℃预热的含有CFDA SE的标记溶液，37 ℃下培养15 min后，吸弃标记溶液，加入37 ℃预热的培养液，37 ℃培养30 min，使CFDA SE在细胞内发生酶解反应。然后，以PBS漂洗2次后，常规培养液培养，隔日换液。培养4 d后，在5个不同视野下，分别计数相差显微镜下观察到的总细胞数与荧光标记的细胞数，荧光标记的细胞为活细胞，计算标记细胞数与总细胞数的比值，得出细胞的存活率。在相差显微镜下连续观察细胞-藻酸盐凝胶复合物在体外长期培养的情况。
成年男性骨盆标本耻骨联合软骨的解剖学测量：取结构完整的8具成年男性骨盆标本，参照张继宗等^[11]所述的人体骨骼测量的原则和方法，用游标卡尺分别测量耻骨联合软骨区的上下径、前后径、左右径。按如下方法标定各个测量点，见图1。
上下径：首先测量上下长轴的长度，命名为上下B；然后，在长轴前方耻骨联合边缘距长轴上端8mm处做长轴的垂线，在垂线与耻骨联合边缘的交点处，做长轴的平行线，分别测量前(腹侧)、后(背侧)两条平行线上耻骨联合的上下径，分别命名为上下A、上下C。
前后径：首先测量垂直于上下长轴的前后突点间的长度，命名为前后B；然后，在测量上下径时所作的长轴前方(腹侧)的平行线与耻骨联合边缘交点处，分别测上、下部分的前后径，分别命名为前后A、前后C。
左右径：按测量前后径时的3条线在耻骨联合边缘的交点处，分别测量耻骨联合前面(腹侧)上下部分的左右距，自上而下分别命名为前左右A、前左右B、前左右C；同法测量耻骨联合后面(背侧)上下部分的左右距，分别命名为后左右A、后左右B、后左右C。
根据以上所测量的数据，按公式：上下A×前后A×[(前左右A+后左右A)÷2]，初步计算出耻骨联合的体积。

主要观察指标：大鼠耻骨联合细胞及细胞外基质，细胞支架复合物超微结构及细胞活性、立体增殖情况，及成年男性耻骨联合体积。
统计学分析：计量资料以x(_)±s表示，用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析。

讨论

实验组织学观察表明，耻骨联合组织细胞具有软骨组织细胞的特性。纤维软骨主要分布在椎间盘、纤维环、耻骨联合、关节盘和半月板等处，与透明软骨之间的主要差别，是细胞间质内含有大量平行或交叉排列的胶原纤维束。细胞一般呈圆形或卵圆形，但也有一些梭形或扁平形状的细胞，这些细胞也是软骨细胞^[5]。

实验中的苏木精-伊红染色观察到了耻骨联合组织含有平行或交叉排列的大量纤维束成分，细胞排列类似软骨细胞。耻骨联合软骨组织中的细胞大多数以成对的形式存在，细胞及软骨陷窝附近阿尔辛蓝着色较深。阿尔新蓝是一种铜酞菁染料，用来染色酸性黏多糖底物和其他阴离子底物，Scott等^[13]认为阿尔新蓝染色机制是阳离子染剂与阴离子底物间通过盐键结合染色。高改霞等^[14]实验表明，在富含硫酸根的部位，如软骨细胞所处的软骨陷窝阿尔新蓝染色呈深蓝色，基质染色呈浅蓝色。

实验结果提示，在细胞陷窝附近的区域的糖胺多糖含量较多。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性，提示耻骨联合组织中的细胞为软骨细胞。Ortega等^[15]通过天狼星红偏振光法观察雄性及未经产雌性大鼠和雄性豚鼠的耻骨联合组织，证实了耻骨联合组织包含纤维软骨组织及居于其中核心区的透明软骨组织，认为大鼠耻骨间关节是一个软骨联合。

耻骨联合组织具有较强的损伤修复能力，有作为细胞供区的条件。两侧耻骨于中线处借纤维软骨形成耻骨联合，其表面被覆皮肤及皮下组织，主要是脂肪组织^[6]。在妊娠晚期和分娩过程中耻骨联合可出现轻度分离，其中的细胞活性发生变化，开始分裂增殖，并分泌更多的基质成分到细胞外，使纤维软骨组织量增加^[16]，说明耻骨联合的软骨细胞能够根据人体的生理需要，发生适应性变化。另外，创伤导致的耻骨联合分离，在妥善复位固定后，一般经10-12周即可愈合^[17]，说明在受到损伤时，耻骨联合的自身修复能力很强，这应该是其中的细胞成分在发挥作用。提示将耻骨联合软骨作为供区切取软骨组织时，这种轻度的医源性损伤很可能不会对其自身及骨盆产生大的影响。

成年男性耻骨联合软骨体积较大，便于用来分离获取种子细胞。通过对骨盆标本耻骨联合软骨的测量可知，成年男性的耻骨联合软骨组织呈楔形片状形态，组织量较大，矢状面约为2.7 cm×1.4 cm，体积为(1.13±0.21) cm³，大部分软骨组织在前(腹侧)部分，与Sgambati等^[18-20]的研究结果近似。王淑雯等^[19]通过X射线观察对1 000例中国成年女性的耻骨联合测量显示，耻骨联合的高度为(4.20±0.36) cm，左右间距为(0.5± 0.2) cm，比实验中对成年男性耻骨联合的测量数据稍大，提示女性耻骨联合的体积大于男性，这个现象也在Alicioglu等[20]的研究中证实。由此可见，成年人的耻骨联合软骨组织是一个较大的解剖结构，按照水占软骨基质湿重75%来推算[5]，软骨密度约为1.3 g/cm3，那么，1.13 cm3相当于1.47 g。作者既往实验中观察到，平均每100 mg耻骨联合软骨获取的原代细胞数是(3.03±0.21)×10⁶个^[8-9]，那么1.13 cm3的耻骨联合组织，约分离获取原代细胞4.45×10⁷个，能够得到较大量的原代细胞，有利于体外扩增。

耻骨联合细胞被藻酸盐凝胶包裹，有利于保留细胞外基质成分。藻酸盐凝胶是一种天然亲水性材料，具有交互通连的微孔结构，很好的生物相容性、降解性和可注射性，这些特性使其可以作为支架材料应用在软骨及骨组织工程领域^[21-22]，还可以作为药物的微载体^[23]。其微孔结构有利于营养物质进入到支架的内部营养细胞。实验观察到，藻酸盐凝胶为细胞提供了较好的三维生长空间，但是，未观察到细胞附着于孔隙壁的现象，结合相差显微镜下观察到的细胞分散悬浮于凝胶中的情况，推测细胞是被包裹在凝胶材料中。这与Wong等^[24-25]用藻酸盐凝胶作为支架时的观察结果一致。Dembczynsk等^[25]研究发现相对分子质量大于78 000的蛋白质、大于21 000的葡聚糖等大分子物质不能通过包裹细胞的那层藻酸盐凝胶薄膜，认为被包裹的细胞处于免疫隔离状态。鉴于细胞培养液中的营养物质主要是氨基酸等小分子物质，因此，这种包裹现象不仅不会影响细胞的营养摄取，反而可能有助于防止细胞外分泌的糖胺多糖、胶原蛋白等基质成份的流失。同时，这种细胞被包裹于支架的复合方式，有助于减少细胞支架复合过程中的细胞丢失，保证了细胞负载密度^[26]，而支架上较高的种子细胞初始负载密度对组织工程研究是非常重要的^[27]。

耻骨联合软骨细胞在藻酸盐凝胶中立体培养形成同源细胞群，有利于保持细胞原有的生物学特性。与藻酸盐凝胶复合后，耻骨联合软骨细胞的存活率大于70%，与兔关节软骨细胞在琼脂糖凝胶中的存活率近似^[28]。部分细胞失去活性，可能跟胰酶消化、机械吹打、离心收集细胞及复合过程中的细胞损伤有关。但是，失去活性的细胞因为被支架材料包裹而不易被去除，是否对活细胞有影响还不能明确。复合物中细胞团块或“同源细胞群”的形成，也证实了细胞的活性，说明细胞仍保持了一定的增殖能力。细胞团块有助于种子细胞的功能分化，因为经过体外单层培养，软骨细胞会发生一定程度的去分化现象，在支架上恢复圆球形外形，以及细胞团块中细胞之间的三维接触及信号传递，对软骨细胞保持分化表型是至关重要的，在这种情况下，软骨细胞的去分化现象可以发生逆转^[28-30]。何清义^[31]通过激光共聚焦显微镜扫描和RT-PCR分析了复合在藻酸盐凝胶支架上的软骨细胞的Ⅱ型胶原荧光染色和基因表达情况，认为藻酸盐三维立体培养对软骨细胞特性的保持要明显优于离心管聚集体培养和无血清诱导培养。

耻骨联合作为自体软骨细胞供区，值得探讨。种子细胞来源的选择一直是软骨组织工程面临的关键问题之一。胚胎干细胞具有全分化潜能，理论上可以被诱导分化为构成人体组织的任何一种细胞，因而日益受到重视，具有巨大的应用前景，但目前只在建系和诱导分化方面取得了一些初步的研究进展，即使通过核转移技术，也没有成功建立病人特异性的胚胎干细胞系。另外，胚胎干细胞面临的伦理、免疫排斥等很多难题，尚不易解决。

具有多分化潜能的骨髓基质干细胞，向软骨细胞诱导分化的研究也取得了一些成果^[32-33]。骨髓基质干细胞具有自发的向成骨细胞分化的趋势^[34-35]，用骨髓基质干细胞诱导分化获得的软骨细胞具有较高的碱性磷酸酶活性^[36]，提示可能使基质矿化，而这种诱导获得的软骨细胞也许是骨髓基质干细胞向成骨细胞分化进程的一个中间阶段。通过酶消化方法，能够将软骨细胞从坚韧的软骨组织中分离出来，获得高纯度的软骨细胞并在体外扩增。

尽管增殖能力比干细胞低，来自自体的软骨细胞仍然被公认为比较合适的种子细胞来源。而且，自体软骨细胞移植已被FDA批准可以在临床应用^[3]，这充分说明了自体软骨细胞的实际应用价值。自体软骨细胞可以取自缺损区近旁组织，也可以取自自体的其他部位。耻骨联合软骨能否作为供区，从中分离细胞作为软骨组织工程的种子细胞，值得探讨。
如果将耻骨联合软骨组织作为关节盘及半月板等特殊软骨组织工程研究的种子细胞供区，其已经具备了以下几个特点：①与椎间盘、关节盘及半月板等特殊的关节辅助结构一样，属于纤维软骨组织。②解剖位置表浅，取材方便。③体积较大，可以提供较多的软骨组织，有利于分离获取大量的原代细胞，从而减少体外传代扩增过程的细胞去分化或老化现象^[37]。④作为供区，因取材而受到损伤后，有较强的自身修复能力。如仅切取部分软骨组织，对耻骨联合的损伤会更小。

致谢：感谢中山大学干细胞与组织工程研究中心项鹏教授在实验技术上的支持。
基金资助：广东省科学技术厅基金资助项目(2004A30201004)。
作者贡献：葛成和张志光进行实验设计，实验实施和成文由葛成完成。邹敬才审校。细胞培养由臧晓霞完成。细胞支架复合培养及观察由于开涛和孙海燕完成。张志光和葛成对文章负责。
利益冲突：实验未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》中相关动物伦理学的条例。
文章概要：关节盘、半月板或椎间盘组织工程研究所需的种子细胞，目前仍然以其自身或与其性质相同或类似的其他组织为主。耻骨联合在组织学上与这些目标器官相似。然而，至今关于耻骨联合的文献报道，主要是与怀孕相关的耻骨联合组织改建方面的。实验首次提出将耻骨联合组织作为种子细胞供区为目标而进行相应研究。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

耻骨联合可作为组织工程种子细胞的供区?

Pubic symphysis: A donor area of tissue engineering seed cells?

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