雌雄大鼠脂肪间充质干细胞代谢、增殖、分化及向血管平滑肌细胞分化的差异性

doi:10.12307/2026.060

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (7): 1687-1698.doi: 10.12307/2026.060

• 脂肪干细胞 adipose-derived stem cells • 上一篇下一篇

雌雄大鼠脂肪间充质干细胞代谢、增殖、分化及向血管平滑肌细胞分化的差异性

王秋花1，杜孜玮1，王文双2，赵冬梅1，张晓晴1

1滨州医学院基础医学院，人体解剖与组织胚胎学教研室，生物材料与组织再生国际合作联合实验室，山东省烟台市 264003；2烟台毓璜顶医院妇科，山东省烟台市 264000

收稿日期:2025-01-15 修回日期:2025-05-09 接受日期:2025-05-29 出版日期:2026-03-08 发布日期:2025-08-19
通讯作者: 张晓晴，博士，教授，滨州医学院基础医学院，人体解剖与组织胚胎学教研室，生物材料与组织再生国际合作联合实验室，山东省烟台市 264003 赵冬梅，博士，教授，滨州医学院基础医学院，人体解剖与组织胚胎学教研室，生物材料与组织再生国际合作联合实验室，山东省烟台市 264003
作者简介:王秋花，女，1999年生，山东省德州市人，汉族，硕士，主要从事生物材料与组织再生方面的研究。共同第一作者：杜孜玮，女，1998年生，山东省临沂市人，汉族，硕士，主要从事生物材料与组织再生方面的研究。
基金资助:
泰山学者青年项目(tsqn202103111)，项目负责人：张晓晴；山东省自然科学基金青年基金(ZR2021QC034)，项目负责人：张晓晴；烟台市省级人才配套资金(1007-10073802)，项目负责人：张晓晴；山东省海外高层次人才工作站基金(2023119005)，项目负责人：张晓晴

Differences in metabolism, proliferation, differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells, and differentiation into vascular smooth muscle cells between male and female rats

Wang Qiuhua1, Du Ziwei1, Wang Wenshuang2, Zhao Dongmei1, Zhang Xiaoqing1

1School of Basic Medical Sciences, Binzhou Medical University, Department of Human Anatomy and Histoembryology, Joint Laboratory for International Cooperation in Biomaterials and Tissue Regeneration, Yantai 264003, Shandong Province, China; 2Department of Gynecology, Yantai Yuhuanding Hospital, Yantai 264000, Shandong Province, China

Received:2025-01-15 Revised:2025-05-09 Accepted:2025-05-29 Online:2026-03-08 Published:2025-08-19
Contact: Zhang Xiaoqing, MD, Professor, School of Basic Medical Sciences, Binzhou Medical University, Department of Human Anatomy and Histoembryology, Joint Laboratory for International Cooperation in Biomaterials and Tissue Regeneration, Yantai 264003, Shandong Province, China; Zhao Dongmei, MD, Professor, School of Basic Medical Sciences, Binzhou Medical University, Department of Human Anatomy and Histoembryology, Joint Laboratory for International Cooperation in Biomaterials and Tissue Regeneration, Yantai 264003, Shandong Province, China
About author:Wang Qiuhua, MS, School of Basic Medical Sciences, Binzhou Medical University, Department of Human Anatomy and Histoembryology, Joint Laboratory for International Cooperation in Biomaterials and Tissue Regeneration, Yantai 264003, Shandong Province, China; Du Ziwei, MS, School of Basic Medical Sciences, Binzhou Medical University, Department of Human Anatomy and Histoembryology, Joint Laboratory for International Cooperation in Biomaterials and Tissue Regeneration, Yantai 264003, Shandong Province, China Wang Qiuhua and Du Ziwei contributed equally to this article.
Supported by:
Taishan Scholar Youth Project, No. tsqn202103111 (to ZXQ); Shandong Natural Science Foundation Youth Fund, No. ZR2021QC034 (to ZXQ); Yantai Province-level Talent Matching Fund, No. 1007-10073802 (to ZXQ); Shandong Overseas High-level Talent Workstation Fund, No. 2023119005 (to ZXQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

血管平滑肌细胞：是构成血管中膜层的主要细胞，在调控血压和血流分布方面发挥重要的生理作用。与心肌细胞和骨骼肌细胞不同，成熟的血管平滑肌细胞在成体内仍具备一定的可塑性。
脂肪间充质干细胞：是一类来源于中胚层的成体干细胞。与其他类型的干细胞相比，脂肪干细胞具有采集方便、储存量丰富、创伤小、培养扩增简便以及较强的增殖能力等优点，此外，还具有多谱系分化潜能和免疫调控等特点。

摘要
背景：在血管壁结构中，血管平滑肌细胞通过调节血管张力维持压力稳定，确保组织血液供应。血管平滑肌细胞具有高度可塑性，是血管再生的关键细胞类型。然而，成熟的血管平滑肌细胞难以获取且体外扩增能力有限。相比之下，脂肪间充质干细胞易于获取、扩增能力强，并具备向血管平滑肌细胞分化的潜能。目前，雌雄来源脂肪间充质干细胞的代谢活性、增殖、集落形成等生物学特性及向血管平滑肌细胞分化的能力是否存在差异仍需深入研究。
目的：比较雌性和雄性大鼠脂肪间充质干细胞的代谢活性、增殖、分化能力等生物学特征及向血管平滑肌细胞分化潜能的差异。
方法：①分别从雌、雄大鼠腹股沟区获取脂肪组织，采用胶原酶消化法提取脂肪间充质干细胞，通过流式细胞术检测表面抗原(CD90、CD29、CD45)，并利用WST-1实验、细胞倍增实验、集落形成实验及成脂、成骨、成软骨分化实验比较雌雄大鼠脂肪间充质干细胞的生物学特征。②用5 ng/mL 转化生长因子β诱导雌雄大鼠脂肪间充质干细胞向血管平滑肌细胞分化，通过qRT-PCR检测α-SMA、SM22α、Calponin、Caldesmon、SMMHC、Smoothelin基因表达，免疫荧光染色检测α-SMA、Caldesmon、Smoothelin蛋白表达，并通过胶原晶格收缩实验评估血管平滑肌细胞的收缩功能。

结果与结论：①原代培养3 d后，显微镜下观察雌性和雄性大鼠脂肪干细胞形态均一，呈纺锤状；②流式细胞术检测大鼠脂肪间充质干细胞高表达CD90、CD29，低表达CD45；③与雄性大鼠脂肪间充质干细胞相比，雌性大鼠脂肪间充质干细胞代谢活性更好(P < 0.05)；④雌性和雄性大鼠脂肪间充质干细胞在倍增时间、集落形成、成脂、成骨、成软骨分化能力方面相似；⑤向血管平滑肌细胞诱导分化后，在基因层面，相较于雄性大鼠脂肪间充质干细胞，雌性大鼠脂肪间充质干细胞α-SMA、Caldesmon和SMMHC高表达(P < 0.05)；在蛋白层面，相较于雄性大鼠脂肪间充质干细胞，雌性大鼠脂肪间充质干细胞α-SMA高表达(P < 0.05)；在收缩功能层面，雌性和雄性大鼠脂肪间充质干细胞在收缩功能上相似。由此可见，在代谢活性和向血管平滑肌细胞分化方面，雌性大鼠脂肪间充质干细胞更有优势。

https://orcid.org/0009-0006-1656-6676 (王秋花)；https://orcid.org/0009-0009-3591-1270 (杜孜玮)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 脂肪间充质干细胞, 血管平滑肌细胞, 诱导分化, 雌性, 雄性, 小口径人工血管

Abstract: BACKGROUND: In the structure of the vascular wall, vascular smooth muscle cells maintain pressure stability by regulating vascular tension, ensuring blood supply to tissues. Vascular smooth muscle cells exhibit high plasticity and are a critical cell type for vascular regeneration. However, mature vascular smooth muscle cells are difficult to obtain and have limited expansion capacity in vitro. In contrast, adipose-derived mesenchymal stem cells are easily accessible, possess strong expansion capabilities, and have the potential to differentiate into vascular smooth muscle cells. Currently, whether there are differences in biological characteristics such as metabolic activity, proliferation, colony formation, and the ability to differentiate into vascular smooth muscle cells between adipose-derived mesenchymal stem cells derived from females and males remains to be thoroughly investigated.
OBJECTIVE: To compare the differences in biological characteristics of adipose-derived mesenchymal stem cells from female and male rats in metabolic activity, proliferation, differentiation ability, and differentiation potential into vascular smooth muscle cells.
METHODS: (1) Adipose tissue was harvested from the inguinal region of both female and male rats, and adipose-derived mesenchymal stem cells were isolated using collagenase digestion. Surface markers (CD90, CD29, and CD45) were detected by flow cytometry. The biological characteristics of adipose-derived mesenchymal stem cells from both sexes were compared using WST-1 assay, cell doubling assay, colony formation assay, and adipogenic, osteogenic, and chondrogenic differentiation assays. (2) Adipose-derived mesenchymal stem cells from female and male rats were induced to differentiate into vascular smooth muscle cells using 5 ng/mL transforming growth factor-β. The expression of α-SMA, SM22α, Calponin, Caldesmon, SMMHC, and Smoothelin mRNAs was detected by qRT-PCR, while the expression of α-SMA, Caldesmon, Smoothelin proteins was assessed by immunofluorescence staining. The contractile function of vascular smooth muscle cells was evaluated using a collagen gel contraction assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After 3 days of primary culture, microscopic observation revealed that adipose-derived stem cells from both female and male rats exhibited a uniform, spindle-shaped morphology. (2) Flow cytometry analysis showed that rat adipose-derived mesenchymal stem cells highly expressed CD90 and CD29, while CD45 expression was low. (3) Compared to adipose-derived mesenchymal stem cells from male rats, female rat adipose-derived mesenchymal stem cells demonstrated significantly higher metabolic activity (P < 0.05). (4) Adipose-derived mesenchymal stem cells from both sexes showed similar doubling time, colony formation ability, and adipogenic, osteogenic, and chondrogenic differentiation potential. (5) After induction of differentiation into vascular smooth muscle cell, at the gene level, female rat adipose-derived mesenchymal stem cells exhibited significantly higher expression of α-SMA, Caldesmon, and SMMHC compared to male rat adipose-derived mesenchymal stem cells (P < 0.05). At the protein level, female rat adipose-derived mesenchymal stem cells showed significantly higher expression of α-SMA (P < 0.05). However, in terms of contractile function, adipose-derived mesenchymal stem cells from both sexes displayed similar performance. In conclusion, female rat adipose-derived mesenchymal stem cells demonstrated superior metabolic activity and a greater potential for differentiation into vascular smooth muscle cells compared to male rat adipose-derived mesenchymal stem cells.

Key words: adipose-derived mesenchymal stem cell, vascular smooth muscle cell, induced differentiation, female, male, small diameter artificial blood vessel

中图分类号:

王秋花, 杜孜玮, 王文双, 赵冬梅, 张晓晴. 雌雄大鼠脂肪间充质干细胞代谢、增殖、分化及向血管平滑肌细胞分化的差异性[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1687-1698.

Wang Qiuhua, Du Ziwei, Wang Wenshuang, Zhao Dongmei, Zhang Xiaoqing. Differences in metabolism, proliferation, differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells, and differentiation into vascular smooth muscle cells between male and female rats [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(7): 1687-1698.

图/表（结果） 3

2.1 原代ADSCs的形态 原代培养3 d后，细胞黏附在壁上并开始延伸，细胞形态呈纺锤状，大部分显示成纤维细胞样生长，见图1。
2.2 流式细胞术检测ADSCs表面抗原 第5代ADSCs高表达CD90、CD29，阳性表达率分别为(94.10±0.85)%，(93.80±0.21)%；低表达CD45，阳性表达率为(3.05±0.50)%，见图2。
2.3 雌性和雄性大鼠ADSCs的代谢活性 通过WST-1实验比较雌性和雄性大鼠ADSCs的代谢活性，结果显示与雄性大鼠ADSCs相比，雌性大鼠ADSCs的细胞代谢活性高，见图3。
2.4 雌性和雄性大鼠ADSCs的倍增时间 雌性和雄性大鼠ADSCs的细胞倍增时间分别为(18.047±0.507) h，(18.049±0.428) h，差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。
2.5 雌性和雄性大鼠ADSCs集落形成情况 雌性和雄性大鼠ADSCs集落形成率分别为(85.75±2.77)%，(83.01±2.84)%，差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。
2.6 雌性和雄性大鼠ADSCs的成脂、成骨、成软骨分化能力 在成脂分化实验中，显微镜下观察到有红色的脂滴形成；在成骨分化实验中，显微镜下观察有深红色的钙结节形成。在成软骨分化实验中，显微镜下观察可见蓝染的软骨球，见图6。

2.7 雌性和雄性大鼠ADSCs向血管平滑肌细胞分化的细胞形态 第5代雌性和雄性大鼠ADSCs诱导分化1周后，细胞形态狭长，以“丘陵和山谷”模式生长，见图7。
2.8 雌性和雄性大鼠ADSCs向血管平滑肌细胞分化后的平滑肌相关基因表达 qRT-PCR检测显示，与对照组相比，实验组平滑肌特异性基因α-SMA、SM22α、Calponin、Caldesmon、SMMHC、Smoothelin表达上调。在实验组中，与雌性大鼠ADSCs相比，雄性大鼠ADSCs α-SMA、Caldesmon、SMMHC表达下调，见图8。
2.9 雌性和雄性大鼠ADSCs向血管平滑肌细胞分化后的平滑肌相关蛋白表达 免疫荧光染色检测显示，与对照组相比，实验组平滑肌特异性蛋白α-SMA、Caldesmon、Smoothelin表达上调。在实验组中，与雌性大鼠ADSCs相比，雄性大鼠ADSCs α-SMA表达下调，见图9。

2.10 雌性和雄性ADSCs向血管平滑肌细胞分化后收缩功能 利用转化生长因子β对雌性和雄性大鼠ADSCs进行诱导分化，并利用血管加压素对胶原晶格加以刺激，观察血管平滑肌细胞的收缩功能。实验结果显示，实验组胶原晶格面积与对照组相比明显缩小，表明雌性和雄性大鼠ADSCs分化的血管平滑肌细胞都具有一定的收缩性，见图10。

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引言

随着人们生活水平的不断提高，心血管疾病的发病率逐年增高[1]。2017年，全球约有1 780万人死于心血管疾病[2]。心血管疾病涵盖多种类型，其中冠状动脉疾病以及外周动脉疾病较为常见[3]，这类疾病主要是由血管管腔出现狭窄甚至阻塞所引发，进而影响血液循环，对机体健康造成威胁[4]。目前，自体血管移植是治疗动脉疾病的金标准，但是对于有并发症或者之前已经进行血管移植的患者来说自体血管并不容易获取[5]。因此，血管组织工程应运而生，成为当下治疗动脉血管疾病极具潜力的替代方法之一[6]。
血管由内膜、中膜和外膜组成，血管平滑肌细胞是动脉中膜的主要细胞类型，维持血管结构完整性[7]。与内皮细胞相比，血管平滑肌细胞功能多样且可塑性强[8]，在发育过程中通过产生血细胞外基质(如胶原蛋白和弹性蛋白)支持血管结构的完整性。健康血管的血管平滑肌细胞主要表现为收缩表型，通过收缩和舒张调节血管张力，响应生化和力学刺激，调控血压和血流分布[9]。此外，收缩性血管平滑肌细胞与内皮细胞持续沟通，维持功能性内皮。在血管损伤或病理条件下，血管平滑肌细胞可转化为合成表型，参与增殖、迁移和血细胞外基质重塑，以修复损伤[10]。血管壁由内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞和周细胞等组成，各成分相互作用维持血管健康。血管平滑肌细胞的高度可塑性使它在动脉重塑中起关键作用，但血管平滑肌细胞表型转换也可能导致病理性血管重塑[11]。因此，建立从自体来源获取血管平滑肌细胞并诱导其向收缩表型分化的策略，对功能性血管平滑肌组织再生至关重要[12]。血管平滑肌细胞与内皮细胞的相互作用是血管再生的关键，内皮细胞释放的生长因子和趋化因子可调节血管平滑肌细胞表型和功能，而血管平滑肌细胞通过分泌血细胞外基质成分支持内皮细胞存活和功能，这种协同作用对维持血管完整性和功能具有重要作用[13]。然而，成熟自体血管平滑肌细胞获取难度高且体外扩增能力有限，难以满足临床需求[14]。因此，迫切需要构建从自体取材获取血管平滑肌细胞的有效策略，推动功能性与患者特异性血管平滑肌组织再生，为心血管疾病治疗开辟新路径[15]。
在再生医学领域，干细胞展现出极大的潜力。多能干细胞因可用性和多功能性引起组织工程领域的广泛关注[16]，包括诱导性多能干细胞[17]、胚胎干细胞[18]、间充质干细胞[如骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)][19-20]。然而，诱导性多能干细胞和胚胎干细胞存在分化不完全、致瘤性及伦理问题[21-22]，
骨髓间充质干细胞虽免疫原性低，但获取创伤大且数量有限[23]，因此均非血管平滑肌细胞的最佳替代选择。近年来，ADSCs因取材方便、储备丰富、创伤小、培养扩增简便及增殖能力强等优势[24-25]，成为组织工程的研究热点。ADSCs在适当条件下可分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞及肌细胞等[26]，并在体内外表现出较强的可塑性[27]，能够修复组织损伤并恢复功能[28]，被视为再生医学的理想种子细胞[4]。值得注意的是，ADSCs具有多向分化潜能，可在特定条件下分化为血管平滑肌细胞[22]。研究表明，在成肌环境中，ADSCs可表达平滑肌特异性基因[29]；在转化生长因子β1诱导下，间充质干细胞可分化为平滑肌细胞亚型，并具备正常收缩舒张功能[30]。将分化后的细胞用于组织工程血管构建，可提升血管的力学性能和生理功能[31]。通过将ADSCs分化的血管平滑肌细胞与血管内皮细胞共接种于生物支架，可构建具有天然血管结构和功能的组织工程血管[32]，模拟血管的收缩舒张功能，为血管移植提供更接近生理状态的替代物[33]。
对雌性和雄性来源ADSCs差异性研究具有重要科学意义。从基础研究角度来看，探究雌雄来源 ADSCs 在生物学特性、基因表达、分化潜能等方面的差异，有助于深入了解干细胞的性别特异性调控机制，丰富干细胞生物学理论体系，为进一步优化干细胞培养和诱导分化技术提供理论依据[34]。在临床应用方面，明确雌雄来源ADSCs的差异，能够使医生在治疗血管相关疾病时，根据患者性别选择更合适的ADSCs来源，实现精准医疗，提高治疗效果。此外，这一研究对推动血管再生治疗技术提供重要的理论意义。随着研究的不断深入和技术的持续进步，ADSCs在血管组织再生领域将发挥更为重要的作用，而雌雄来源ADSCs 差异性研究也将为该领域注入新的知识，共同为众多血管相关疾病的治疗带来新的突破与希望。
ADSCs展现出巨大潜力，但面临自体与异体干细胞选择的问题。自体ADSCs来源于患者自身，伦理审批便捷、易获取且安全性高[35]。ADSCs与造血干细胞不同，免疫原性低，异体使用不易引发免疫排斥，因此同种异体ADSCs也是一种可行选择[3]。心血管疾病不分性别，尽管普遍认为男性更易患病，但女性同样受影响。目前，雌雄ADSCs在生物学特征(如代谢活性、增殖、集落形成能力)及向平滑肌细胞分化能力(初期、中期、末期特定基因蛋白表达及收缩能力)是否存在差异尚不明确。若雌雄ADSCs在代谢活性、增殖、集落形成、成脂、成骨、成软骨分化能力及向血管平滑肌细胞分化方面存在显著差异，可考虑使用同种异体来源细胞分化为功能性血管平滑肌细胞，用于生成小口径人工血管。该研究旨在通过系统比较雌性和雄性大鼠来源ADSCs的细胞代谢活性、增殖、集落形成、成脂、成骨、成软骨分化能力等生物学特征以及向血管平滑肌细胞分化的差异性，为干细胞疗法在血管组织再生中的应用提供更深入的理解。成熟收缩性血管平滑肌细胞鉴定的基因和蛋白包括α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、平滑肌蛋白22α(smooth muscle22α，SM22α)、钙调蛋白(Calponin)、钙调结合蛋白(Caldesmon)、平滑肌蛋白重链(smooth musclemyosin heavy chain，SMMHC)、平滑素蛋白(Smoothelin)等，共同调节肌动蛋白丝交联和肌动蛋白、钙调蛋白结合，并执行血管平滑肌细胞的收缩和迁移[9，36]。因此，该研究诱导雌性和雄性大鼠来源ADSCs向血管平滑肌细胞分化后，分别检测了α-SMA、SM22α、Calponin、Caldesmon、SMMHC、Smoothelin这些基因在血管平滑肌细胞中的表达，并加入血管收缩剂对血管平滑肌细胞进行刺激，检测血管平滑肌细胞的收缩功能。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学实验；分子生物学实验。
1.2 时间及地点 实验于2024年3-10月在滨州医学院基础医学院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 实验选用8周龄SD大鼠(雄鼠和雌鼠各3只)，此阶段为SD大鼠生长发育的稳定期，有利于控制变量。大鼠体质量为(250±30) g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK(鲁)2023-0002。饲养条件为：温度23-25 ℃，湿度40%-60%，光线较暗的环境，自由进食饮水，并定期更换垫料。实验方案经滨州医学院动物伦理委员会批准，伦理审批号：伦研批第2022-019号。
1.3.2 实验试剂 DMEM/F12培养基、青霉素-链霉素混合液、胎牛血清(武汉普诺赛)；细胞分化诱导试剂盒(大鼠间充质干细胞成脂、成骨、成软骨分化，武汉普诺赛)；染色试剂(油红O、茜素红、阿利新蓝，北京索莱宝)；细胞实验相关试剂(0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、DAPI溶液、抗荧光衰减封片剂、5%牛血清白蛋白，北京索莱宝)；检测试剂(WST-1试剂盒，上海碧云天)；酶制剂(胶原酶Ⅰ型，中国白鲨)；固定剂(40 g/L多聚甲醛，中国白鲨)；生长因子(转化生长因子β1，亚科因生物技术有限公司)；分子生物学试剂(基因引物：ɑ-SMA、SM22α、Calponin、Caldesmon、Smoothelin、SMMHC，烟台润泽生物科技有限公司；RNA提取试剂盒，艾科瑞生物；反转录试剂盒、SYBR Green PCR试剂盒，诺唯赞公司)；抗体试剂(α-SMA、Caldesmon、Smoothelin一抗，美国Immunoway；山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG免疫荧光二抗，美国Immunoway)；血管加压素(美国Sigma)；其他试剂(结晶紫粉末，北京索莱宝；鼠尾胶原蛋白，康宁)。
1.3.3 实验器材 恒温水浴锅(上海力辰邦西)；恒温振荡器(上海一恒)；二氧化碳培养箱(上海力新)；高速离心机(长沙湘仪)；倒置荧光显微镜(德国徕卡)；酶标仪(上海美谷)；PCR仪(罗氏公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 ADSCs的提取 ①取雄性和雌性SD大鼠各3只，按40 mg/kg的剂量腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液，让大鼠过量麻醉而死亡。②快速将大鼠转移至无菌操作区，用圆头手术剪剖开腹部皮肤，尽量避免划破腹膜，分别用体积分数75%乙醇及PBS冲洗暴露的皮下腹股沟区，然后用组织剪及组织镊分离出腹股沟脂肪组织，将分离出的脂肪组织用含青霉素、链霉素的PBS冲洗3次。③放入新的50 mL离心管中，用圆头手术剪将脂肪组织剪碎呈乳糜状。④加入两三倍体积的0.1%Ⅰ型胶原酶，将离心管口用封口膜密封，置于37 ℃恒温摇床中，调整转速120 r/min，消化1 h。⑤消化后脂肪呈乳糜液状，加入等体积的F12培养基终止消化(混匀静置1min)。⑥1 500 r/min离心10 min，离心后可见离心管底部有细胞团沉积，小心倾倒掉上层液体。⑦加入4 mL DMEM/F12培养基重悬细胞团，用70 μm细胞滤网配50 mL离心管进行过滤，收集滤液。⑧接种于T25培养瓶中，标记为P0。⑨将培养瓶放入37 ℃、体积分数5%CO2培养环境中培养。⑩24 h后查看细胞贴壁情况，倒掉原有培养基，用PBS清洗，去除未贴壁细胞，换新鲜培养基，此后每3 d换液1次。
1.4.2 ADSCs的传代 原代细胞融合度达80%-90%时，弃培养基，PBS清洗2次；加入37 ℃预热的0.25%胰酶(含0.01% EDTA) 2 mL，CO2培养箱消化5 min，镜下见细胞脱落后，加等量预热的DMEM/F12完全培养基终止消化，吹打混匀，离心(1 500 r/min，8 min)弃上清，用1 mL DMEM/F12重悬细胞，转至新培养瓶。传至第3代后可用于实验。
1.4.3 显微镜下观察细胞形态 观察原代及多次传代的ADSCs形态特征、密度及融合度等生长状况，并拍摄照片进行记录。
1.4.4 流式细胞术检测ADSCs表面抗原 取第5代ADSCs，胰酶消化后收集细胞，预冷PBS洗涤，1 500 r/min离心10 min，得细胞沉淀。用流式缓冲液调整细胞浓度至2×109 L-1，每EP管加50 µL细胞悬液、45 µL缓冲液，分别加入5 µL CD90(PE)、CD29(FITC)、CD45(APC)，混匀后4 ℃避光孵育40 min，孵育后4 ℃、1 500 r/min离心5 min，弃上清，预冷PBS洗涤2次，500 µL缓冲液重悬，转移至上样管，立即上机检测。
1.4.5 WST-1检测 将第5代ADSCs以5 000个/孔密度接种至96孔板，培养7 d。培养结束后，WST-1试剂与DMEM/F12完全培养基按1∶10混合，每孔加入100 μL混合液，CO2培养箱孵育1 h，用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度值。
1.4.6 细胞倍增时间的测定 将第5代ADSCs以2×104个/孔密度接种至24孔板，分别于培养24 h和72 h时计数，记录各时间点的细胞数量。按公式计算倍增时间：倍增时间=(T-T0)×log2/(logN-logN0)，其中T0为起始时间，T为结束时间，N0和N分别为起始和结束时的细胞数。
1.4.7 细胞集落形成实验 将第5代ADSCs以40个/孔密度接种于6孔板，培养14 d，40 g/L多聚甲醛固定20 min，蒸馏水洗2次，3%结晶紫(50 mL甲醇+1.5 g结晶紫)染色10 min，蒸馏水洗后镜检。集落数=n孔集落总数/n孔(n=9)，集落形成率=集落数/接种细胞总数×100%。
1.4.8 成脂、成骨、成软骨诱导分化实验 将第5代ADSCs以1×104个/孔密度接种于96孔板，培养至细胞融合度达到80%时，分别加入成脂诱导培养液、成骨诱导培养液和成软骨诱导培养液继续培养，每2 d更换1次诱导液，诱导2周后，分别进行油红O染色、茜素红染色、阿利新蓝染色，在显微镜下观察染色后的细胞形态。
1.4.9 ADSCs分化为血管平滑肌细胞 将第5代ADSCs以5×104个/孔密度接种于6孔板，分为实验组和对照组，培养24 h细胞贴壁后，实验组用含体积分数1%胎牛血清和5 ng/mL转化生长因子β1的DMEM/F12培养基诱导分化，每天换液1次，培养1周；对照组用含体积分数1%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养，每3 d换液1次，培养1周。在显微镜下观察两组细胞形态。
1.4.10 qRT-PCR 将第5代ADSCs以5×104个/孔密度接种于6孔板中，分为实验组和对照组，培养 24 h细胞贴壁后，实验组用含体积分数1%胎牛血清和5 ng/mL转化生长因子β1的DMEM/F12培养基培养1周，诱导分化为血管平滑肌细胞；对照组用含体积分数1%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养1周。采用qRT-PCR检测两组细胞中平滑肌相关基因(α-SMA、SM22α、Calponin、Caldesmon、SMMHC、Smoothelin)的表达。
(1) RNA的提取：使用快速RNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书操作。吸除培养基，PBS洗1次，加500 μL Buffer QLS，轻摇混匀；刮下细胞，转移至1.5 mL离心管，室温静置2 min；加等体积100%乙醇，混匀；转移混合液至Quick RNA Mini Column，12 000 r/min离心2 min，弃滤液；加700 μL Buffer QWB，12 000 r/min离心1 min，弃滤液；转移吸附柱至新的2 mL Collection Tube，12 000 r/min离心2 min；将吸附柱移至RNase Free管，加20 μL RNase Free Water，室温静置3 min；12 000 r/min离心2 min洗脱RNA。取1 µL RNA测浓度，剩余RNA于-80 ℃保存。
(2)反转录为cDNA：将RNA放于室温溶解，根据测定好的浓度，计算出200 ng RNA所需体积用于后续反转录。cDNA合成实验步骤(根据反转录试剂盒说明书)：①去除基因组DNA：在无RNA酶管中加入4 μL 4×g DNA wiper Mix、1 pg-1 μg提取的RNA溶液，用RNase-free ddH2O补足至16 μL，轻轻混匀后离心，将反应管置于PCR扩增仪中，42 ℃处理2 min；②配制反转录反应体系：在第1步处理后的反应管中直接加入4 μL 5×HiScript II Select qRT SuperMix II，用移液枪轻轻吹打混匀；③反转录反应：将反应管置于PCR扩增仪中，按照37 ℃，15 min；85 ℃，5 s程序进行反转录反应。
(3) qRT-PCR：将反转录得到的cDNA稀释10倍放于冰盒上，按照表1在2 mL RNase-free EP管配制混合液；将混合液加入到八排管中，用掌式离心机离心1 min，放入PCR仪器中，按照表2设置参数；以β-actin作为内参检测α-SMA、SM22α、Calponin、Caldesme、SMMHC、Smoothelin mRNA的相对表达量，使用2-∆∆Ct方法进行半定量分析。引物序列见表3。

1.4.11 免疫荧光染色 将第5代ADSCs以5×104个/孔密度接种于含圆形细胞爬片的24孔板中，分为实验组和对照组，培养24 h细胞贴壁后，实验组用含体积分数1%胎牛血清和5 ng/mL转化生长因子β1的DMEM/F12培养基培养1周，诱导分化为血管平滑肌细胞；对照组用含体积分数1%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养1周。取出细胞爬片，PBS清洗3次，加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，0.2% TritonX-100室温孵育10 min， PBS洗3次，以0.5% BSA室温封闭30 min；按1∶100比例加入一抗α-SMA、Caldesmon、Smoothelin，4 ℃孵育过夜；第2天复温45 min，PBS清洗3次，加入二抗室温孵育1 h，PBS清洗3次，用200 µL 100 nmol/L DAPI溶液对细胞核复染3 min，PBS清洗3次，滴加抗荧光衰减剂封固，在倒置荧光显微镜下观察并拍照，观察平滑肌相关蛋白的表达。通过Image J软件定量分析相对荧光面积。
1.4.12 胶原凝胶晶格收缩实验 将第5代ADSCs以5×104个/孔密度接种于6孔板中，分为实验组和对照组，培养24 h细胞贴壁后，实验组用含体积分数1%胎牛血清和5 ng/mL转化生长因子β1的DMEM/F12培养基培养1周，诱导分化为血管平滑肌细胞；对照组用含体积分数1%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养1周，待细胞融合达90%左右加入胰蛋白酶-EDTA消化，以1×109 L-1的细胞浓度在无血清DMEM中重悬。配制胶原蛋白凝胶：将400 µL鼠尾胶原蛋白Ⅰ型加入24 µL 0.1 mol/L NaOH，再加入10×PBS，迅速混匀，用碳酸氢钠中和至pH 7.0。将2.5×105个细胞加入到50 µL胎牛血清，接着加入到上述凝胶混合液中。在48孔板中，每孔加200 µL细胞-胶原蛋白混合物，37 ℃孵育30 min，凝胶聚合后，每孔加500 µL DMEM/F12培养基继续孵育24 h使细胞胶原混合液充分形成胶原晶格凝胶。在24 h孵育结束后，立即对形成的胶原晶格凝胶拍照记录；然后加入10 μmol/L血管加压素继续孵育6 h对胶原晶格加以刺激，再次对胶原晶格凝胶拍照记录，用Image J软件量化凝胶面积，通过(6 h凝胶面积/0 h凝胶面积)×100%计算相对凝胶面积大小。
1.5 主要观察指标 雄性和雌性ADSCs的细胞形态、代谢活性、增殖活性、集落形成率、成脂、成骨、成软骨分化能力、成血管平滑肌细胞分化能力、平滑肌相关基因和蛋白表达、血管平滑肌细胞的收缩功能。

1.6 统计学分析 所有实验数据均使用GraphPad Prism 8.02软件和Image J软件进行处理和统计分析。两组间数据分析比较采用两独立样本t检验，多组间数据比较分析采用单因素方差分析和Turkey’s多重比较检验方法。P < 0.05为差异有显著性意义。所有实验结果均经过3次独立的实验。该文统计学方法已经滨州医学院生物统计学专家审核。

讨论

心血管疾病在全球发病率和死亡率逐年升高，其中冠状动脉和外周动脉疾病占据主导地位[37]。自体血管移植是治疗动脉疾病的金标准，在临床应用中展现出显著效果[38]。然而，对于存在并发症或已接受过自体血管移植的患者，获取合适的自体血管变得极为困难[3]。鉴于此，在动脉血管疾病治疗领域，随着医学需求的不断增长与技术的持续进步，血管组织工程技术蓬勃发展，主要集中在生物材料、细胞来源、血管支架和生物反应器等方面[5]。天然和合成材料用于构建血管支架，通过结合自体细胞或干细胞促进血管再生。生物反应器模拟体内环境，提升细胞功能[39]。尽管在小口径和大口径血管的临床应用中取得了一定成果，但仍面临免疫排斥、血栓形成等挑战[40]。未来，随着材料科学和生物工程技术的进步，血管组织工程有望为动脉血管疾病提供更有效的治疗方案，为血管疾病的治疗提供了新的替代方案[41]。
血管平滑肌细胞是动脉血管中膜层的关键细胞，具有重要的结构和生理功能。与血管内皮细胞相比，血管平滑肌细胞功能多样且维持血管结构完整性[42]。然而，自体血管平滑肌细胞难以从成熟血管中获取，且体外扩增能力有限[14]。因此，建立从自体来源获得血管平滑肌细胞的策略对功能性血管平滑肌组织再生至关重要[43]。然而，现有干细胞类型存在局限性：诱导多能干细胞可能因分化不完全导致致瘤性；胚胎干细胞存在分化不完全、致瘤性及伦理争议；骨髓间充质干细胞虽免疫原性低，但获取创伤大且数量有限。ADSCs因多向分化潜能、易获取、数量多且可诱导分化为血管平滑肌细胞，被认为是血管组织工程有前景的细胞来源[44]。尽管已有研究证实ADSCs可诱导分化为血管平滑肌细胞，但尚未系统研究雌雄来源ADSCs在代谢活性、增殖、集落形成、成脂、成骨、成软骨分化能力及向血管平滑肌细胞分化方面的差异，这一研究的缺乏可能影响ADSCs在血管组织工程中的潜在应用及临床转化。尽管普遍认为男性更易患心血管疾病，但女性同样受影响。研究表明，雌性ADSCs在代谢活性及向血管平滑肌细胞分化方面优于雄性。因此，可考虑使用同种异体来源细胞分化成功能性血管平滑肌细胞，用于小口径人工血管生成。该研究成功从雌雄大鼠腹股沟区提取ADSCs，细胞呈纺锤状生长，具有多向分化能力及集落形成能力，增殖能力强，且雌性细胞活性优于雄性。以上结果表明，ADSCs具有易获取、数量多、自我复制及多向分化潜能等特点，对基于干细胞的临床治疗具有重要价值。
从血管分离的血管平滑肌细胞在体外培养时呈狭长、山谷状形态[45]。成熟血管平滑肌细胞表达收缩相关基因和蛋白，如α-SMA、SM22α、Calponin、Caldesmon、SMMHC、Smoothelin[46]。该研究发现，雌性和雄性大鼠ADSCs来源的血管平滑肌细胞均呈细长纺锤状，且α-SMA、SM22α、Calponin、Caldesmon、SMMHC、Smoothelin基因表达相似，α-SMA、Caldesmon、Smoothelin蛋白表达也相似，收缩性表现一致。与雄性大鼠ADSCs相比，雌性大鼠ADSCs代谢活性更高，且雌性大鼠ADSCs来源血管平滑肌细胞的平滑肌特异性基因(α-SMA、Caldesmon、SMMHC)和蛋白(α-SMA)表达更高。α-SMA和Caldesmon是血管平滑肌细胞早期和中期的特异性标志，对成熟血管平滑肌细胞的形成至关重要。因此，α-SMA和Caldesmon高表达表明ADSCs向血管平滑肌细胞分化良好。该研究表明雌性和雄性大鼠ADSCs均可诱导为血管平滑肌细胞，而雌性大鼠ADSCs在代谢活性和向血管平滑肌细胞分化方面优于雄性。这可能与雌激素有关系，雌性大鼠体内的雌激素水平相对较高，雌激素可以通过与雌激素受体结合来发挥作用[47]。在ADSCs中，雌激素与雌激素受体结合后，可能会激活一系列信号通路，促进细胞的增殖和代谢，增强细胞代谢活性；同时，雌激素还能上调某些与血管平滑肌细胞分化相关的转录因子的表达，从而促进ADSCs向血管平滑肌细胞分化。除了雌激素，雌性大鼠体内的其他激素如孕激素等也可能与雌激素相互协同[48]，共同调节ADSCs的代谢和分化。未来将深入探究雌性大鼠ADSCs在代谢活性和向血管平滑肌细胞分化方面优于雄性的相关机制。目前，在临床上获取新鲜的ADSCs面临着伦理审批等问题。动物模型为人类疾病建模提供了有价值的工具，大鼠是常用的动物模型，但是可能在某些生物学特性上与人类有差异，在未来将进一步深入研究这些差异性，为临床转化奠定基础。
结论：此研究发现了雌性大鼠ADSCs的代谢活性显著优于雄性，且雌性大鼠ADSCs来源血管平滑肌细胞中平滑肌标志物α-SMA、Caldesmon和SMMHC表达显著高于雄性。α-SMA、Caldesmon和SMMHC是血管平滑肌细胞成熟的关键基因和蛋白，其高表达表明雌性大鼠ADSCs向血管平滑肌细胞分化能力更强，提示雌性大鼠ADSCs可能激活了特定分子通路。未来研究可进一步探索这些通路的分子机制，揭示性别差异影响干细胞分化的基础，为调控干细胞分化提供新靶点。该研究首次系统揭示了雌雄大鼠ADSCs向血管平滑肌细胞分化的差异，强调了性别因素在干细胞生物学中的重要性，表明了雌性大鼠ADSCs相较于雄性在一些方面更具优势。为基于干细胞的治疗策略提供了性别特异性参考，有助于优化个体化医疗方案，推动血管组织工程及临床转化的发展。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

雌雄大鼠脂肪间充质干细胞代谢、增殖、分化及向血管平滑肌细胞分化的差异性

Differences in metabolism, proliferation, differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells, and differentiation into vascular smooth muscle cells between male and female rats

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