人尿源性干细胞的分离培养及诱导分化为平滑肌细胞

doi:10.12307/2025.073

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (19): 4076-4082.doi: 10.12307/2025.073

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

人尿源性干细胞的分离培养及诱导分化为平滑肌细胞

陈佳汇1，戴晓琪1，徐彦钢2，李远超3，黄妹1，詹一飞1，杜宇轩1，李鎏强1，郭耀川1，卞军1，赖德辉1

1广州医科大学附属第五医院泌尿外科，广东省广州市 510000；2广州市中西医结合医院泌尿外科，广东省广州市 510000；3广州中医药大学临床针灸康复学院，广东省广州市 510000

收稿日期:2024-02-26 接受日期:2024-05-09 出版日期:2025-07-08 发布日期:2024-09-13
通讯作者: 赖德辉，博士，副主任医师，广州医科大学附属第五医院泌尿外科，广东省广州市 510000
作者简介:陈佳汇，男，1998年生，湖北省黄冈市人，汉族，广州医科大学在读硕士，主要从事干细胞与泌尿系统修复的研究。
基金资助:
广州市科技计划项目(202201010834)，项目负责人：卞军；广东省自然科学基金-面上项目(2021A1515010065)，项目负责人：卞军；广州市卫生健康科技项目(20211A011103)，项目负责人：卞军；2022年教育部产学合作协同育人项目(220904082210823)，项目负责人：赖德辉；2022年广州医科大学学生创新能力提升计划项目(106)，项目负责人：赖德辉；广东省自然科学基金博士启动项目(2017A030310148)，项目负责人：赖德辉

Isolation, culture and differentiation of human urine-derived stem cells into smooth muscle cells

Chen Jiahui1, Dai Xiaoqi1, Xu Yangang2, Li Yuanchao3, Huang Mei1, Zhan Yifei1, Du Yuxuan1, Li Liuqiang1, Guo Yaochuan1, Bian Jun1, Lai Dehui1#br#

1Department of Urology, Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; 2Department of Urology, Guangzhou Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; 3Clinical Acupuncture and Moxibustion Rehabilitation College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China

Received:2024-02-26 Accepted:2024-05-09 Online:2025-07-08 Published:2024-09-13
Contact: Lai Dehui, MD, Associate chief physician, Department of Urology, Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China
About author:Chen Jiahui, Master candidate, Department of Urology, Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China
Supported by:
Guangzhou Science and Technology Plan Project, No. 202201010834 (to BJ); Guangdong Provincial Natural Science Foundation (General Project), No. 2021A1515010065 (to BJ); Guangzhou Health Technology Project, No. 20211A011103 (to BJ); 2022 Ministry of Education Industry Education Collaborative Education Project, No. 220904082210823 (to LDH); 2022 Guangzhou Medical University Student Innovation Ability Enhancement Plan Project, No. 106 (to LDH); Doctoral Initiation Project of Guangdong Provincial Natural Science Foundation, No. 2017A030310148 (to LDH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

尿源性干细胞：从尿液中分离提取的具有多向分化潜能的成体干细胞，形态呈“米粒”状或“短梭”形，具有较强的分裂增殖活性以及向3个胚层细胞分化的能力，有望成为组织工程学与再生医学领域优秀的种子细胞。
平滑肌细胞：是构成平滑肌的细胞，分布于内脏器官和血管壁中。平滑肌细胞具有一定的自律性，可以在没有外来神经支配的情况下自发地产生节律性收缩。在功能上，平滑肌参与了血管系统、消化系统、泌尿系统等多种生命系统的生理功能。

摘要
背景：传统尿路修复重建手段受限于供体短缺、并发症多以及生理功能恢复不理想等问题，组织工程策略为此领域提供了新方向。鉴于尿路主要由肌性组织构成，其中关键在于发掘适合的种子细胞并高效诱导分化为平滑肌细胞，但关于不同平滑肌细胞诱导方案效能的对比研究仍较为匮乏。
目的：旨在分离、培养及鉴定人尿源性干细胞，并比较两种不同成平滑肌诱导方案的效果。
方法：采用多次离心法从11份健康成人志愿者尿液中分离提取尿源性干细胞，使用流式细胞仪进行表面标志物的鉴定，通过成骨、成脂诱导分化来验证尿源性干细胞的多向分化潜能。尿源性干细胞分别在含转化生长因子β1以及转化生长因子β1联合血小板衍生生长因子的成平滑肌细胞诱导分化培养基中诱导分化14 d，采用免疫荧光染色和Western blot检测平滑肌特异性蛋白(α-SMA、SM22)的表达差异。

结果与结论：①成功从8份健康人尿液中分离出尿源性干细胞，细胞呈“米粒”样，具有很好的分裂增殖能力；②尿源性干细胞高表达间充质干细胞表面标志物CD73、CD90和CD44，极低表达造血干细胞表面标志物CD34和CD45，不表达CD19、CD105和HLA-DR；③经成骨和成脂诱导分化后，可见明显的钙结节和脂滴形成，茜素红染色和油红O染色结果呈阳性；④成平滑肌诱导培养14 d，免疫荧光染色显示转化生长因子β1/血小板衍生生长因子组尿源性干细胞成平滑肌诱导分化率显著高于转化生长因子β1组(P < 0.005)；⑤成平滑肌诱导培养14 d，Western blot检测显示转化生长因子β1/血小板衍生生长因子组α-SMA和SM22蛋白表达量显著高于转化生长因子β1组(P < 0.005)。结果表明：尿源性干细胞可以通过多次离心法无创分离获取；相较于单纯转化生长因子β1，转化生长因子β1/血小板衍生生长因子联合应用能显著提高尿源性干细胞诱导分化为平滑肌细胞的效率。

https://orcid.org/0000-0002-9985-3884 (陈佳汇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 尿源性干细胞, 诱导分化, 平滑肌细胞, 转化生长因子β1, 血小板衍生生长因子, 组织工程

Abstract: BACKGROUND: Traditional methods of urinary tract reconstruction are limited by donor scarcity, high complication rates, and suboptimal functional recovery. Tissue engineering strategies offer new directions in this field. Since the urinary tract is mainly composed of muscle tissue, the key is to find suitable seed cells and efficiently induce them to differentiate into smooth muscle cells. Comparative studies on the efficacy of different smooth muscle cell induction regimens are still lacking.
OBJECTIVE: To isolate, culture, and identify human urine-derived stem cells, and to compare the effects of two different induction protocols.
METHODS: Human urine-derived stem cells were isolated from urine samples of 11 healthy adult volunteers by multiple centrifugations. Surface markers were identified by flow cytometry. The multi-directional differentiation potential of human urine-derived stem cells was verified through osteogenic and adipogenic differentiation. Differentiation was induced by transforming growth factor-β1 or transforming growth factor-β1 combined with platelet derived growth factor for 14 days. Immunofluorescence staining and western blot assay were employed to compare the expression differences of smooth muscle-specific proteins (α-SMA and SM22).
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Urine-derived stem cells were successfully isolated from the eight urine samples of healthy people. These cells exhibit a “rice grain”-like morphology and possess a robust proliferative capacity. (2) Urine-derived stem cells exhibited high expression of mesenchymal stem cell surface markers (CD73, CD90, and CD44) and extremely low expression of hematopoietic stem cell surface markers (CD34 and CD45). These cells did not express CD19, CD105, and HLA-DR. (3) After osteogenic and adipogenic differentiation, the formation of calcium nodules and lipid droplets was observed, with positive staining results from Alizarin Red S and Oil Red O staining. (4) After 14 days of smooth muscle induction culture, immunofluorescence staining revealed that the smooth muscle differentiation rate of urine-derived stem cells treated with a combination of transforming growth factor-β1 and platelet derived growth factor was significantly higher compared to those treated with transforming growth factor-β1 alone (P < 0.005). (5) After 14 days of smooth muscle induction culture, western blot assay further demonstrated that the expression levels of α-SMA and SM22 in the transforming growth factor-β1/platelet derived growth factor group were significantly elevated compared to those in the transforming growth factor-β1 only group (P < 0.005). These findings confirm that urine-derived stem cells can be non-invasively isolated using multiple rounds of centrifugation. Compared with transforming growth factor-β1 alone, the combination of transforming growth factor-β1 and platelet derived growth factor can improve the efficiency of inducing urine-derived stem cells to differentiate into smooth muscle cells.

Key words: urine-derived stem cell, induced differentiation, smooth muscle cell, transforming growth factor-β1, platelet derived growth factor, tissue engineering

中图分类号:

陈佳汇, 戴晓琪, 徐彦钢, 李远超, 黄妹, 詹一飞, 杜宇轩, 李鎏强, 郭耀川, 卞军, 赖德辉. 人尿源性干细胞的分离培养及诱导分化为平滑肌细胞[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(19): 4076-4082.

Chen Jiahui, Dai Xiaoqi, Xu Yangang, Li Yuanchao, Huang Mei, Zhan Yifei, Du Yuxuan, Li Liuqiang, Guo Yaochuan, Bian Jun, Lai Dehui. Isolation, culture and differentiation of human urine-derived stem cells into smooth muscle cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(19): 4076-4082.

图/表（结果） 2

2.1 尿源性干细胞的体外生长状态 分离培养第5天可见少数呈簇状分布的细胞，单个细胞形状呈“米粒状”，见图1B。第7天细胞开始增多，排列逐渐规则，增长加快，细胞呈单层贴壁生长，形态呈“短梭形”，见图1C。第10天，细胞可达到接近60%-80%的融合度，细胞呈单层紧密排列，形态均一，见图1D。传代至第3代的细胞，增殖仍迅速，细胞形态未发生明显变化，见图1E。
2.2 尿源性干细胞表面抗原的表达 流式细胞仪检测结果显示，尿源性干细胞高表达间充质干细胞的表面标志物CD73(84.14%)、CD90(98.70%)、CD44(99.48%)，极低表达造血干细胞标志物CD34(6.13%)和CD45(1.65%)。此外，尿源性干细胞不表达CD19(0.61%)、CD105(0.78%)、HLA-DR(0.24%)，见图2。

2.3 尿源性干细胞的生长曲线 尿源性干细胞第1，2天生长缓慢，为潜伏期；第3天开始生长加速，第3-8天分裂迅速为对数生长期；第9天细胞生长开始放缓，细胞分裂活动变慢，进入平台期；第10天逐渐进入衰退期，细胞数量稍有下降，见图3A。
2.4 尿源性干细胞成骨、成脂诱导分化结果 在成脂诱导分化培养基中培养14 d后，对尿源性干细胞进行油红O染色，显微镜下观察可见大量脂滴广泛分布于细胞内被染成红色，见图3B，证实尿源性干细胞已成功实现了成脂分化。在成骨诱导分化培养基中培养21 d后，对尿源性干细胞进行茜素红S染色，显微镜下观察可见细胞内出现了明显的钙结节并被染成橘红色，见图3C，证实尿源性干细胞已成功实现了成骨分化。
2.5 尿源性干细胞成平滑肌诱导分化形态学变化 尿源性干细胞分别在两种成平滑肌诱导分化培养基中诱导分化14 d，显微镜下观察到细胞形态由规则的“米粒状”“椭圆形”逐渐变为“长梭形”，细胞开始出现一些触角。TGF-β1/PDGF组诱导后的细胞形态呈较规则的均一性改变，细胞呈紧密平行排列，见图4A；TGF-β1组诱导后的细胞排列较松散，部分细胞未呈现均一性改变，见图4B。
2.6 尿源性干细胞诱导分化后平滑肌特异性蛋白的表达 免疫细胞化学染色结果显示，TGF-β1组、TGF-β1/PDGF组均可见α-SMA和SM22蛋白阳性表达，TGF-β1/PDGF组荧光信号明显强于TGF-β1组，见图4A，B。通过统计两组诱导后细胞的荧光信号表达来反映细胞分化比率，结果显示TGF-β1/PDGF组细胞分化比率明显高于TGF-β1组(P < 0.005)，见图4C。Western blot结果显示TGF-β1/PDGF组α-SMA和SM22蛋白表达水平显著高于TGF-β1组(P < 0.005)，见图4D，E。

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引言

干细胞是研究组织修复与再生的中心环节[1-2]。目前，可应用于组织修复的干细胞有骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞等[3-5]，这些干细胞的获取均需要复杂有创的操作，部分研究还面临严苛的伦理申请，使其在组织工程与再生领域应用受到很大限制[6-8]。ZHANG等[9]首次在尿液中发现一种具有良好增殖活性与多向分化潜能的干细胞[10-11]。但是，尿源性干细胞并没有标准化的分离程序，所得到的细胞形态、干性和多向分化能力也存在较大差异[12-15]。
泌尿外科肌性器官，如膀胱、输尿管、尿道等损伤是尿路修复与重建的难点。加速平滑肌修复是保证尿路重建效果的关键之一。LIU等[16]应用负载尿源性干细胞的小肠黏膜下层组织成功修复兔尿道狭窄；SONG等[17]成功构建一种能够原位捕获尿源性干细胞的特异性支架并显著促进了膀胱缺损的修复与再生；ZHAO等[18]尝试了一种更新颖的输尿管重建方法，将尿源性干细胞体外诱导成上皮细胞和平滑肌细胞后，与富含血管内皮生长因子的血管细胞外基质材料结合，种植于大网膜培育成管状结构后用于输尿管的重建。目前诱导人尿源性干细胞为平滑肌细胞的方法没有公认的标准。良好的诱导效率对于尿源性干细胞在组织工程学中的应用至关重要。基于以上问题，该研究分离、培养、鉴定人尿源性干细胞并诱导分化为平滑肌细胞，比较2种不同方案的诱导分化效率，为尿源性干细胞在尿路修复与重建中的应用提供新的研究基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外原代细胞培养，细胞学观察实验，功能研究。
1.2 时间及地点 实验于2022年11月至2023年10月在广州医科大学附属第五医院中心实验室完成。
1.3 材料 Keratinocyte SFM(1×)培养基、F12/DMEM培养基、MEM培养基和澳洲胎牛血清购自Gbico公司；转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、三碘甲腺原氨酸、腺嘌呤、L-谷氨酰胺、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和吲哚美辛购自Sigma公司；青链霉素、CCK-8试剂盒购自碧云天生物技术公司；抗α-SMA抗体(ab5694)、抗SM22抗体(ab14106)购自Abcam公司；甘油2-磷酸酯购自兰博利德公司；抗坏血酸和地塞米松购自Aladdin公司；茜素红染色试剂盒、油红O染色试剂盒购自普诺赛公司。
1.3.1 尿源性干细胞专用培养基的配置 将KSFM培养基与F12/DMEM培养基按1∶1混合，添加体积分数5%胎牛血清、0.4 mg/L氢化可的松、10 μg/L胰岛素、5 μg/L转铁蛋白、2×10-9 mol/ L三碘甲腺原氨酸、10 μg/L表皮生长因子、1.8×10-4 mol/L腺嘌呤、1%青链霉素，1% L-谷氨酰胺。
1.3.2 成骨诱导分化培养基配制 在DMEM培养基中加入10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L甘油2-磷酸酯和50 μg/mL抗坏血酸配制而成。
1.3.3 成脂诱导分化培养基配制 在DMEM培养基中加入1 µmol/L地塞米松、500 µmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10 µg/mL胰岛素和100 µmol/L吲哚美辛配制而成。
1.3.4 成平滑肌细胞诱导分化培养基配制 尿源性干细胞专用培养基与MEM培养基按1∶1的比例混合，添加体积分数5%胎牛血清、1%青链霉素，TGF-β1组诱导培养基中加入2.5 ng/L TGF-β1，TGF-β1/PDGF组诱导培养基中加入2.5 ng/L TGF-β1和10 ng/L PDGF。
1.4 实验方法
1.4.1 尿源性干细胞的分离培养 经广州医科大学附属第五医院伦理审查委员会批准(KY01-2021-05-09)，用无菌容器收集广州医科大学附属第五医院11名18-35岁男性健康志愿者的新鲜中段晨尿400 mL，志愿者已签署知情同意书。取尿液操作之前指导志愿者用蘸有碘伏消毒液的棉签消毒尿道口及周围的皮肤3遍，消毒部位的残余碘伏溶液用无菌生理盐水冲洗干净。将尿液标本摇匀分装于5个50 mL离心管中，在24 ℃、1 500 r/min(相对离心力524×g)离心5 min，弃上清，用50 mL PBS重悬沉淀，再次离心，重复上述离心弃上清步骤3遍。将最终的沉淀用少量PBS重悬，全部移至第6支50 mL离心管中加PBS至50 mL，1 500 r/min离心5 min，弃上清，用25 mL尿源性干细胞专用培养基重悬混匀，按每孔1 mL接种于24孔板中，置于37 ℃、体积分数5%CO2恒温细胞培养箱中静置培养，第2天每孔更换70%培养基，第4天每孔更换100%培养基，以后每隔1 d更换1次培养基。每日在倒置显微镜下观察各孔细胞贴壁及细胞克隆形成情况，如图1A所示流程。
1.4.2 流式细胞仪检测细胞表型 采用流式细胞仪检测尿源性干细胞表面抗原标记物的表达。取第3代对数生长期的尿源性干细胞，调整细胞浓度为1×109 L-1，向每个流式检测试管中加入200 μL细胞悬液，随后与异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)标记的CD19、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR单克隆抗体混合室温避光孵育30 min，用PBS洗涤细胞2次，上流式细胞仪进行荧光信号检测。
1.4.3 尿源性干细胞诱导成脂分化 取第3代尿源性干细胞，以3×104/cm2接种于6孔板中，用尿源性干细胞专用培养基培养24 h后，更换成脂诱导分化培养基培养，每隔2 d更换1次培养基，14 d后用油红O染色试剂盒检测尿源性干细胞成脂分化情况，倒置显微镜观察。
1.4.4 尿源性干细胞诱导成骨分化 取第3代尿源性干细胞，以3×104/cm2接种于6孔板中，用尿源性干细胞专用培养基培养24 h后，更换成骨诱导分化培养基培养，每隔2 d更换1次培养基，21 d后用茜素红染色试剂盒检测尿源性干细胞成骨分化情况，倒置显微镜观察。
1.4.5 CCK-8法检测细胞增殖活性 取生长状态良好的第3代尿源性干细胞，以1.0×104/孔接种于96孔板中，置于37 ℃孵箱内静置培养，分别于第0-12天每天加入10% CCK-8工作液37 ℃孵育3 h，用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值，绘制生长曲线。
1.4.6 尿源性干细胞向平滑肌细胞方向诱导分化 取生长状态良好的第3代尿源性干细胞，以2×104/cm2接种于多聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白(50 μg/mL)包被的6孔板中，37 ℃培养箱内静置培养24 h，然后TGF-β1组更换为添加2.5 ng/L TGF-β1的成平滑肌细胞诱导分化培养基培养，TGF-β1/PDGF组更换为添加2.5 ng/L TGF-β1和10 ng/L PDGF的成平滑肌细胞诱导分化培养基培养，空白对照组未经诱导培养基处理。每隔2 d更换1次培养基，在荧光倒置显微镜下观察细胞的形态变化，诱导14 d进行免疫荧光化学染色和Western blot检测。
1.4.7 免疫细胞荧光染色检测平滑肌细胞特异性蛋白的表达 取诱导分化14 d的细胞，用PBS缓慢清洗3次，每孔加入2 mL 40 g/L多聚甲醛37 ℃下固定20 min，PBS清洗3遍，每孔加入2 mL 0.3% Triton-X100破膜20 min，PBS清洗3遍，每孔加入2 mL 5% BSA封闭30 min，加入稀释的一抗anti-α-SMA(1∶100)、anti-SM22(1∶500)，4 ℃孵育过夜，回收一抗并用PBS清洗3遍，在避光条件下滴加带荧光标记的二抗溶液(1∶500)，避光孵育1 h，PBS清洗3遍，滴加含DAPI的抗荧光淬灭剂，在共聚焦显微镜(ZEISS LSM 900)10倍镜下拍照观察目标蛋白的荧光表达。
1.4.8 Western blot检测平滑肌特异性蛋白的表达 取诱导分化14 d的细胞，加入含磷酸蛋白酶抑制剂和PMSF的RIPA裂解液裂解细胞10 min，收集裂解混合物在4 ℃下14 000 r/min离心15 min，用BCA法进行蛋白质定量，将提取的蛋白以每个泳道20 μg在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上进行分离，跑完电泳将分离的蛋白用湿转法转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉溶液封闭2 h，PBST清洗1次，加入稀释好的一抗溶液anti-α-SMA(1∶1 000)、anti-SM22(1∶1 500)、anti-GAPDH(1∶5 000)，4 ℃孵育过夜，次日回收一抗，PBST溶液清洗3遍，每次10 min，加入稀释好的二抗溶液(1∶8 000)室温摇床上慢摇2 h，再用PBST溶液清洗3遍，滴加ECL显影工作液在UVP凝胶成像系统下检测目的蛋白对应的条带，并用Image J软件进行灰度分析，特异蛋白条带灰度值与GAPDH灰度值的比值记为目的蛋白的相对表
达量。
1.5 主要观察指标 ①尿源性干细胞的形态；②尿源性干细胞生长曲线；③尿源性干细胞的抗原表达；④尿源性干细胞成脂、成骨诱导分化能力鉴定；⑤不同诱导方案下尿源性干细胞成平滑肌诱导分化情况。

1.6 统计学分析 用SPSS 13.0软件进行数据统计分析，实验数据以x±s表示，采用t检验进行两样本均数比较，采用单因素方差分析进行多样本均数比较，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过广州医科大学生物统计学专家审核。

讨论

泌尿系统各种损伤导致的组织结构缺损和功能缺失是困扰泌尿外科医生的难题。泌尿系组织工程学技术旨在通过将生物材料、种子细胞与生物活性因子有机地结合，从而实现泌尿系统组织结构缺陷的修复与功能的重建，最终提高患者的生活质量[19-23]。尿源性干细胞相比于骨髓、血液、脂肪等来源的成体细胞具有很多优势，逐渐被研究者们所青睐：①用于提取尿源性干细胞的原材料来源充足。实验发现只需400 mL尿液就可以成功分离出尿源性干细胞，新鲜尿液加入5 mL尿源性干细胞专用培养基在4 ℃环境下保存24 h，仍然可以分离出生长活性良好的尿源性干细胞，这与先前的研究是一致的[24-25]。②它的分离程序简易、无创，这就意味着可以有效避免了很多伦理问题。在该研究中，随机选取11名健康男性志愿者，收集尿液，在8名志愿者尿液中成功分离出了尿源性干细胞，整个收集过程中志愿者无诉任何不适，且不存在心理压力。经过询问3名提取失败志愿者的近期生活信息，猜测可能与志愿者近期的生活状态有关，比如他们在近期有吸烟、饮酒、熬夜的情况。从尿液中分离的尿源性干细胞形态呈“米粒”状、椭圆形，无触角，这种形态很符合未分化细胞的特点，它表达间充质干细胞的表面抗原标志物(CD44、CD73、CD90)，不表达造血干细胞标志物(CD34、CD45)和人类白细胞表面抗原(HLA-DR)。更重要的是，尿源性干细胞具有向3个胚层细胞分化的潜能[26]。在特定的诱导条件下，BHADAWARAJ等[24-28]将尿源性干细胞分化为外胚层细胞(神经元样细胞)、中胚层细胞(平滑肌细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和内皮细胞)和内胚层细胞(尿路上皮细胞)。该研究在提取尿源性干细胞过程中经历了三四次离心，通过多次离心程序能够尽可能稀释掉尿液中遗留下来的毒素、尿酸、肌酐等多种对细胞生长不利的成分；其次，洗涤后的细胞沉淀物适宜首先接种于24孔或12孔培养板中，这一操作主要是基于尿液来源细胞提取过程易受污染的特点，采用多孔板培养体系的优势在于能够将实验拆分为24个或12个独立单元格。在整个实验进程中，一旦发现个别孔位遭受污染，即可针对性地对污染孔进行消毒处理并剔除，从而确保实验的准确性和有效性。最终分离出的尿源性干细胞具有良好的分裂增殖能力，呈典型的“S”型生长曲线，倍增时间约为72 h，与先前研究中单次离心分离方法相比细胞活性及细胞群的均一性表现更好[29-31]。
此前，许多研究成功地将干细胞分化为平滑肌细胞并用于泌尿系损伤的修复与重建，但各自的诱导方案不尽相同[17-18，32-34]。TGF-β1在干细胞成平滑肌分化过程中发挥着重要的作用[35-36]。TGF-β1通过激活TGF-β受体激酶进而激活Smad2和Smad3来诱导干细胞向早期平滑肌细胞分化[37]。KURPINSKI等[38]发现Notch配体JAG1在TGF-β诱导干细胞成平滑肌过程中发挥重要作用，Notch信号通路可能是介导成平滑肌分化的新机制。PENG等[39]研究发现过表达CREG1可以通过激活TGF-β-smad2/3信号通路来促进胚胎干细胞向平滑肌细胞分化和成熟。PDGF是一种重要的生长刺激因子，在促进个体发育、细胞增殖与分化方面起着重要的调节作用。PDGF有2种信号受体PDGFα和PDGFβ，它们与PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D 4种配体结合后经过信号传导连续磷酸化激活RAS/ERK通路，从而参与细胞生长分化的调节过程[40-41]。CIPRIANI等[42]研究发现PDGF与TGF-β1在肌成纤维细胞分化中起协同作用。此外，CHEN等[43]发现PDGF可以通过ERK通路刺激海马神经祖细胞增殖分化从而达到改善神经退行性疾病的效果。SIVARAMAN等[44]研究表明PDGF可以促进间充质干细胞成平滑肌分化过程中平滑肌特异性基因ACTA2和miRNA-145-5p的表达。
该研究采用单纯TGF-β1和TGF-β1/PDGF两种方式来诱导尿源性干细胞分化成平滑肌细胞，对比哪种方式的转化效率更高。研究发现经过诱导分化后TGF-β1/PDGF组相比于单纯TGF-β1组具有更高水平的平滑肌特异性蛋白(α-SMA、SM22)的表达。α-SMA、SM22是平滑肌的早期表达蛋白。该研究的不足之处：首先，未能从诱导成平滑肌晚期蛋白的表达以及是否具有功能性肌纤维收缩活性的角度深入探索，需要更多的研究进行尿源性干细胞诱导成平滑肌后的功能学评估，包括但不限于收缩性、电生理特性等；其次，没有探索这两种细胞因子如何协同作用以及具体调控平滑肌细胞分化的分子机制，团队后续实验将以探索诱导出具有功能表型的平滑肌为研究重点，并进一步研究具体的分子调控机制。相信不久的将来尿源性干细胞可以为泌尿系损伤修复与重建作出重要贡献。
该研究通过一套可行的方案成功地从健康人尿液分离出尿源性干细胞，经成平滑肌诱导分化后显著表达平滑肌特异性蛋白α-SMA、SM22。研究发现，与单纯使用TGF-β1相比，TGF-β1/PDGF两种因子联合的诱导方式能获得更高效的转化率，此研究为尿源性干细胞的工程化应用提供了坚实的研究基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人尿源性干细胞的分离培养及诱导分化为平滑肌细胞

Isolation, culture and differentiation of human urine-derived stem cells into smooth muscle cells

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