脱钙骨基质负载脂肪源性干细胞修复兔桡骨节段性骨缺损

doi:10.12307/2026.521

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (7): 1679-1686.doi: 10.12307/2026.521

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脱钙骨基质负载脂肪源性干细胞修复兔桡骨节段性骨缺损

丁一凡1，尹文杰1，张力1，袁淑娅2，孙国驹2，张乃丽1，赵冬梅1，马丽娜2

1滨州医学院基础医学院人体解剖学教研室，山东省烟台市 264003；2滨州医学院第二临床医学院诊断学教研室，山东省烟台市 264003

收稿日期:2024-11-14 修回日期:2025-03-06 接受日期:2025-03-19 出版日期:2026-03-08 发布日期:2025-08-19
通讯作者: 马丽娜，讲师，滨州医学院第二临床医学院诊断学教研室，山东省烟台市 064003
作者简介:丁一凡，男，1998年生，滨州医学院在读硕士，主要从事干细胞与组织修复研究。
基金资助:
山东省医药卫生科技发展计划项目(202104070826)，项目负责人：马丽娜；山东医药卫生科技发展计划项目(202301021239)，项目负责人：张乃丽；山东省自然科学基金项目(BS2015SW021)，项目负责人：张乃丽；山东省大学生创新创业项目(S202310440046)，项目负责人：孙国驹

Repair of segmental bone defect of rabbit radius by decalcified bone matrix loaded with adipose-derived stem cells

Ding Yifan1, Yin Wenjie1, Zhang Li1, Yuan Shuya2, Sun Guoju2, Zhang Naili1, Zhao Dongmei1, Ma Lina2

1Department of Human Anatomy, School of Basic Medical Science, Binzhou Medical University, Yantai 264003, Shandong Province, China; 2Department of Diagnostics, Second School of Medicine, Binzhou Medical University, Yantai 264003, Shandong Province, China

Received:2024-11-14 Revised:2025-03-06 Accepted:2025-03-19 Online:2026-03-08 Published:2025-08-19
Contact: Ma Lina, Lecturer, Department of Diagnostics, Second School of Medicine, Binzhou Medical University, Yantai 264003, Shandong Province, China
About author:Ding Yifan, Master candidate, Department of Human Anatomy, School of Basic Medical Science, Binzhou Medical University, Yantai 264003, Shandong Province, China
Supported by:
Medical and Health Science and Technology Development Project of Shandong Province, No. 202104070826 (to MLN); Medical and Health Science and Technology Development Project of Shandong Province, No. 202301021239 (to ZNL); Natural Science Foundation of Shandong Province, No. BS2015SW021 (to ZNL); Students’ Innovation and Entrepreneurship Training Program of Shandong Province, No. S202310440046 (to SGJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

脱钙骨基质：是人或动物的骨组织经深冻、脱脂、脱钙、去细胞处理而来，主要成分为Ⅰ型胶原。脱钙骨基质基本保存了天然骨的孔隙结构，而且抗原性低、生物相容性好，具备一定的骨诱导性，是临床常用的骨修复材料。
脂肪源性干细胞：是从脂肪组织中分离获得的一种具有自我更新、高度繁殖、多向分化潜能的多能干细胞，是修复组织或器官损伤的干细胞来源之一。

摘要
背景：脱钙骨基质是临床常用的骨修复材料，但在临床应用中发现存在成骨能力不足的问题，将脱钙骨基质与具有成骨潜力的细胞复合可有效提高成骨能力。
目的：探讨脱钙骨基质复合脂肪源性干细胞提高桡骨节段性骨缺损修复能力的可行性。
方法：以猪骨为原材料制备脱钙骨基质，采用酶解贴壁法体外分离、培养新西兰大白兔脂肪源性干细胞，流式细胞术检测细胞表型，并进行成骨、成脂诱导分化。将脂肪源性干细胞接种到脱钙骨基质复合培养3 d，倒置显微镜、扫描电镜观察脂肪源性干细胞在脱钙骨基质上的生长情况。取新西兰大白兔24只，随机分成4组，分别为空白对照组、脱钙骨基质组、脂肪源性干细胞-脱钙骨基质组和自体骨组，建立双侧桡骨节段缺损(12 mm)模型，按组别植入相应材料，术后4，8，12周通过拍摄X射线片、苏木精-伊红染色评价骨修复情况。

结果与结论：①培养的细胞贴壁聚集生长，呈长梭形，CD44、CD71高表达，CD34、CD45、CD106低表达；成骨诱导分化后茜素红染色可见被染成橘红色的矿化结节；成脂诱导分化后油红O染色可见细胞内染成鲜红色的脂滴；②脂肪源性干细胞紧密复合于脱钙骨基表面，生长状态良好，并向孔隙内部生长；③X射线片和组织学观察显示，脂肪源性干细胞-脱钙骨基质组新西兰大白兔骨缺损修复情况优于空白对照组、脱钙骨基质组，与自体骨组相当。结果表明，负载脂肪源性干细胞可有效弥补脱钙骨基质成骨能力的不足。

https://orcid.org/0000-0003-2048-1537(马丽娜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 脂肪源性干细胞, 脱钙骨基质, 桡骨, 节段性骨缺损, 成骨, 新西兰大白兔, 组织工程

Abstract: BACKGROUND: Decalcified bone matrix is a commonly used bone repair material in clinical practice, but it has been found to have the problem of insufficient osteogenic ability in clinical application. Combining with cells with osteogenic potential can effectively improve the osteogenic ability of scaffolds.
OBJECTIVE: To investigate the feasibility of decalcified bone matrix combined with adipose-derived stem cells to improve the repair ability of radial segmental bone defects.
METHODS: Decalcified bone matrix was prepared using porcine bone as raw material. Adipose-derived stem cells of New Zealand white rabbits were isolated and cultured in vitro by enzymatic hydrolysis and adherence method. Cell phenotypes were detected by flow cytometry, and osteogenic and adipogenic differentiation was performed. Then adipose-derived stem cells were seeded into decalcified bone matrix. Three days later, the growth of adipose-derived stem cells on decalcified bone matrix was observed by inverted microscope and scanning electron microscope. Twenty-four New Zealand white rabbits were used to establish bilateral radial segmental defects (12 mm), which were randomly divided into blank control group, decalcified bone matrix group, adipose-derived stem cells-decalcified bone matrix group, and autologous bone group. The corresponding materials were implanted according to the groups. X-ray examination and hematoxylin-eosin staining were used to evaluate bone repair at 4, 8, and 12 weeks after surgery.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The cultured cells adhered to the wall and grew together in a long spindle shape, with high expression of CD44 and CD71 and low expression of CD34, CD45 and CD106. In cultured cells induced by osteogenic differentiation, alizarin red staining showed mineralized nodules stained orange-red. Lipid induced differentiation cultured cells were stained with oil red O, and bright red lipid droplets could be seen in the cells. (2) Adipose-derived stem cells were tightly compounded on the surface of decalcified bone matrix, with good growth status, and grew into the pores. (3) X-ray examination and histological observation showed that the repair of bone defects in adipose-derived stem cells-decalcified bone matrix group was better than that in the blank control group and decalcified bone matrix group. The results confirm that loading with adipose-derived stem cells can effectively compensate for the lack of osteogenic ability of decalcified bone matrix.

Key words: adipose-derived stem cell, decalcified bone matrix, radius, segmental bone defect, osteogenesis, New Zealand rabbit, tissue engineering

中图分类号:

丁一凡, 尹文杰, 张力, 袁淑娅, 孙国驹, 张乃丽, 赵冬梅, 马丽娜. 脱钙骨基质负载脂肪源性干细胞修复兔桡骨节段性骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1679-1686.

Ding Yifan, Yin Wenjie, Zhang Li, Yuan Shuya, Sun Guoju, Zhang Naili, Zhao Dongmei, Ma Lina. Repair of segmental bone defect of rabbit radius by decalcified bone matrix loaded with adipose-derived stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(7): 1679-1686.

图/表（结果） 1

2.1 ADSCs鉴定结果 原代培养接种4 h后，细胞开始贴壁生长，但细胞形态不均一，可见红细胞、成纤维细胞等细胞，随着换液次数的增加，贴壁生长的细胞呈椭圆形或梭形(图2A)；传代到第3代，ADSCs聚集生长，呈长梭形、成纤维细胞样外观，有较多突起(图2B)。流式细胞术检测结果显示，第3代细胞CD44、CD71高表达，CD34、 CD45、CD106低表达(图2C)，符合间充质干细胞的特征。成骨诱导分化培养后，细胞生长旺盛，增殖迅速，逐渐由长梭形变为多边形或立方形，逐渐汇合呈铺路石状，重叠生长，胞质内颗粒状物质增多，胞外基质分泌逐渐增多，有圆形或卵圆形的结节状物出现。茜素红染色可见染成橘红色的矿化结节，结节形状为圆形或不规则型，大小不一(图2D)。成脂诱导分化培养的细胞形状逐渐从长梭形变为方形或圆形，细胞质内开始出现高折光度的圆形脂滴，聚集成多房型。油红O染色可见染成鲜红色的脂滴聚集(图2E)。
2.2 ADSCs-DBM复合培养 大体观察DBM为乳白色，呈蜂窝状疏松多孔样结构(图3A)；倒置显微镜下观察可见ADSCs紧密复合于材料表面，生长状态良好(图3B)；扫描电镜观察可见梭形、三角形及多角形细胞贴附于材料表面，并向孔隙内部生长(图3C)。
2.3 桡骨节段性缺损修复情况
2.3.1 实验动物数量分析 24只新西兰大白兔48侧桡骨参加实验，全部进入结果分析，无脱落。
2.3.2 X射线片观察结果 如图4A所示，术后4周，空白对照组骨缺损两侧骨断端锐利，仅有少量骨痂形成，可见明显骨缺损，截骨端骨髓腔封闭；DBM组植骨部位也可见骨痂形成，但骨生成量明显较ADSCs-DBM组少；ADSCs-DBM组两侧骨端有明显骨痂形成，植入物与骨端有部分骨性连接；自体骨组植入物与骨端有少量连续性骨桥形成。
术后8周，空白对照组骨缺损区缩小，骨端可见少量骨痂形成；DBM组骨缺损两断端在靠近尺骨侧形成高密度骨痂连接，远离尺骨侧由云雾状高密度影填充，且在远端可见明显的骨缺损；ADSCs-DBM组骨缺损区内被高密度影填充，两端基本连接，仅在远端有部分小缺损；自体骨组植入的自体骨与宿主骨连接，骨折线消失，连接处呈现高密度影。

术后12周，空白对照组骨缺损区进一步缩小，但未见连续性骨痂，骨髓腔封闭；DBM组骨缺损两端基本连接，但仍见部分骨缺损，骨髓腔没有再通；ADSCs-DBM组骨缺损区完全修复，皮质骨连续，骨髓腔部分再通；自体骨组植骨区与两端宿主骨无明显界限，皮质骨连续，骨髓腔基本完全再通。
术后不同时间X射线片评分结果显示，ADSCs-DBM组在各个取材时间点X射线片评分低于自体骨组，高于DBM组和空白对照组。统计学分析结果显示，ADSCs-DBM组与自体骨组无统计学差异(P > 0.05)，ADSCs-DBM组X射线片评分高于DBM组和空白对照组(P < 0.05)；DBM组X射线片评分高于空白对照组(P < 0.01)(图4B)。
2.3.3 组织学观察结果 如图5所示，术后4周，空白对照组骨缺损区内纤维结缔组织长入，骨端成骨不活跃；DBM组宿主骨端可见新生骨形成，但数量明显较ADSCs-DBM组少；ADSCs-DBM组材料表面附着大量成骨细胞，沿材料呈线形排列，成骨活跃，材料周围区域明显可见新骨生成；自体骨组植入骨与宿主骨间有新生骨组织形成，无明显炎症反应。
术后8周，空白对照组骨缺损区仍被纤维组织填充；DBM组材料周围可见大量间充质干细胞，并有新生骨组织向材料长入；ADSCs-DBM组植骨区有大量新生骨组织形成，残存材料被新生骨包绕；自体骨组植骨区可见大量新生编织骨形成，排列无序。
术后12周，空白对照组骨缺损区被纤维组织填充，两端骨髓腔骨化闭合；DBM组可见大量新生骨组织生成，但在新生骨组织周围可见纤维组织长入；ADSCs-DBM组植骨区可见大量排列无序的新生编织骨，成骨活跃，植入材料几乎被完全吸收替代，残存材料被新生编织骨包绕；自体骨组植骨区可见新生编织骨开始改建，有新生骨髓腔形成。

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引言

创伤、肿瘤等造成的骨缺损修复一直是临床骨科上的难题，骨移植是治疗超出临界修复能力骨缺损的有效方法[1]。自体骨因具备骨传导、骨诱导及骨生成能力，且无免疫原性，是目前治疗骨缺损的“金标准”，但自体骨取材范围有限，可能导致供骨区感染、慢性疼痛等，限制了其应用[2-3]。因此，寻找一种理想的骨移植材料至今仍是研究的热点。
脱钙骨基质(decalcified bone matrix，DBM)是人或动物的骨组织经深冻、脱脂、脱钙处理获得，基本保存了天然骨的孔隙结构，主要成分为Ⅰ型胶原，抗原性低，具有良好的生物相容性，可随新骨的生成而逐渐吸收，内表面积大，有利于细胞黏附长入、获取营养成分及代谢产物排出，还保留了一定量的成骨诱导因子，具备一定的骨诱导性，是临床常用的骨修复材料[4-7]。但在制备DBM过程中，部分成骨活性因子丧失，在一定程度上影响骨修复能力，随着临床应用的增多，DBM的超前吸收及骨诱导不稳定等缺陷逐渐显现[8-9]。
在骨修复过程中，成骨细胞除了分泌基质和纤维诱导钙盐沉积形成骨组织外，还可分泌骨钙素和骨形态发生蛋白等对成骨前体细胞有趋化作用或骨诱导作用的成骨活性因子[10-11]。因此，成骨细胞复合骨移植材料也是弥补成骨能力不足的一种途径[12]。成骨细胞主要分布在骨膜及骨组织，取材时容易造成供区损伤，因而取材的量有限，不适用于临床。间充质干细胞是骨再生研究的热点。目前，已从骨髓、脐带、牙周韧带、肌肉，乃至尿液中分离培养出间充质干细胞[6，13-15]，虽然这些来源的干细胞群体很有应用价值，但常见的问题包括可用组织的数量有限和收获的细胞数量较低[16]。2001年研究者从脂肪组织中获取了间充质干细胞，并命名为脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)[17-18] ，脂肪组织分布广泛，获取方法简单易行，对供者损伤较小，易于分离培养，体外增殖能力强，免疫排斥反应低，还可取于自体，被认为是具有巨大应用前景的成骨细胞来源[19]。已有多项研究探讨ADSCs在骨再生中的作用，WAGNER等[20]将ADSCs注射到骨缺损区域，发现ADSCs可以通过促进成骨细胞和抑制破骨细胞提高骨修复能力。为实现更好的骨修复效果，ADSCs还被用于与各种支架材料复合修复骨缺损，LIU等[21]应用大鼠动物模型证实复合ADSCs提高了异种脱蛋白骨的骨修复能力。临床上应用生物活性玻璃或β-磷酸三钙负载ADSCs修复颌面部骨缺损，短期随访发现负载ADSCs可提高新生骨密度，但因支架材料吸收等因素导致长期修复效果不满意[22]。MAGLIONE等[23]研究发现不同支架材料负载ADSCs的骨修复能力有显著差异。
作为具有天然骨孔隙结构的支架材料，DBM也被用于负载ADSCs促进骨修复。GU等[24]应用DBM负载成骨诱导分化的ADSCs成功修复了家兔尺骨节段性缺损；WEN等[25]也证实复合ADSCs的DBM可有效促进大鼠尺骨节段性缺损；ZHAO等[26]发现交联处理的DBM仍可以作为支架材料促进ADSCs增殖、分化。除种属来源外，制备方法也是影响DBM成骨能力的重要因素。通过脱脂处理去除天然骨中脂类是DBM制备过程中的重要步骤，传统方法通常使用氯仿、丙酮之类的有机化学溶剂，这些有机溶剂不仅对操作人员的健康造成危害，还可能残留在DBM中。课题组前期研究采用脂肪酶脱脂取得了良好的效果，有效避免了有机试剂的应用[27]。
为验证应用改良法制备的DBM负载ADSCs修复骨缺损的能力，该研究以猪骨为原材料制备DBM，体外分离、培养新西兰大白兔ADSCs，将两者在体外复合后植入兔桡骨节段性骨缺损处，通过放射学、组织学评价骨修复情况，探讨ADSCs提高DBM成骨能力、修复骨缺损的可行性。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验，采用析因设计资料的方差分析，组间多重比较采用最小极差法(LSD)。
1.2 时间及地点 实验于2021年7月至2024年7月在滨州医学院人体解剖与组织胚胎学研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 主要仪器与试剂 倒置显微镜(日本，奥林巴斯)；光学显微镜(日本，奥林巴斯)；低真空扫描电镜(日本，日本电子)；X射线机(德国，西门子)；流式细胞仪(ELITE ESP，美国库尔特公司)；CD34-PE、CD44-FITC、CD45-PE、CD71-FITC、CD106-FITC(美国，VMRD)；苏木精-伊红染色液(北京，索莱宝)；脂肪酶(美国，Sigma-Aldrich)；恒温搅拌器(德国，IKA)；胎牛血清(英国，Hyclone)；L-DMEM培养基(美国，Gibico)；成骨诱导分化培养基、成脂诱导分化培养基(武汉，普赛诺)；猪骨(烟台，福祖)。
1.3.2 实验动物 2月龄新西兰大白兔26只，雌雄各半，体质量(2.0±0.1) kg，由山东国际生物科技园发展公司提供，许可证号：SCXK(鲁)2018 0030，实验前适应性饲养1周。研究中所有的处理均符合国家和地方对伦理的要求，通过了滨州医学院伦理委员会的审核和批准(伦研批第2021-105号)。
1.4 实验方法
1.4.1 DBM的制备 取新鲜猪股骨4根，-80 ℃保存2周，采用改良脱脂脱钙方法处理[27-28]。具体步骤：切除肌肉及结缔组织后，取两端松质骨，锯成大小为0.5 cm×0.5 cm×1.2 cm的骨条，去离子水超声清洗，每小时换水1次，共清洗48 h，接着将骨条以1.0 g/100 mL的比例浸泡在pH值为10的NaHCO3/Na2CO3缓冲液配制的1%脂肪酶溶液中4 h，再在蒸馏水中超声清洗3次，每次15 min，将骨条转移至0.6 mol/L HCl溶液中，以1.0 g/100 mL的比例在搅拌器中室温脱钙48 h，蒸馏水冲洗3次，每次5 min，冻干机冻干，密封包装，应用60Co以20 kGy的辐照剂量灭菌备用。
1.4.2 ADSCs的分离培养 选取新西兰大白兔2只，适应性喂养1周，耳缘静脉注射3%戊巴比妥纳(0.03 g/kg)麻醉，腹股沟区剃毛，消毒后切开皮肤，分离并取出双测腹股沟脂肪垫，转移到超净工作台，去除筋膜组织和小血管，PBS冲洗3次，将脂肪组织在10 cm培养皿内用眼科剪剪碎，移入50 mL离心管，加入等体积的0.25%Ⅰ型胶原酶溶液，充分摇匀，置于37 ℃恒温摇床中振荡消化1 h，转速200 r/min，加入等体积的完全培养基终止消化，200目细胞筛过滤，将滤液移入15 mL离心管，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基吹打均匀，接种于25 mL塑料培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，24 h后首次换液，轻摇培养瓶并用PBS冲洗培养瓶3次清除未贴壁细胞，以后每两三天根据培养基颜色换液。待细胞覆盖瓶底约90%时，加入0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例进行传代培养。
1.4.3 流式细胞术检测细胞表型 取指数生长期第3代ADSCs，消化成单个细胞悬液，分别加入CD34-PE、CD44-FITC、CD45-PE、CD106-FITC、CD71-FITC抗体，以同型对照标记的细胞作为对照圈门，流式细胞仪检测细胞表面抗原 CD34、CD44、CD45、CD71、CD106的表达。
1.4.4 成骨、成脂诱导分化 取第3代ADSCs，分别用成骨诱导分化培养基和成脂诱导分化培养基培养，诱导培养3周时，茜素红染色检测成骨诱导分化情况，油红O染色检测成脂诱导分化情况。
1.4.5 ADSCs-DBM复合培养 收集第4代ADSCs，计数，调整细胞浓度为2×1010 L-1，按50 μL/块种植于放置在6孔培养板内的DBM上，静置于37 ℃、体积分数5% CO2、饱和湿度条件下4 h，加入足量的培养基培养3 d，倒置显微镜下观察，然后取出细胞-支架材料，2.5%戊二醛缓冲液(pH=7.4)固定，PBS冲洗，叔丁醇逐级脱水，真空冻干，喷金镀膜，扫描电镜下观察。
1.4.6 兔桡骨缺损模型的建立及修复 选用新西兰大白兔24只，雌雄各半，耳缘静脉注射3%戊巴比妥纳(0.03 g/kg)麻醉，无菌条件下逐层切开皮肤、皮下组织、深筋膜，钝性分离肌肉，骨膜剥离器剥离骨膜，暴露桡骨中段，摆锯截取兔双侧桡骨中段，造成约12 mm骨缺损[29-30]，共48侧，随机分成4组，每组12侧(图1)：空白对照组骨缺损处不植入任何材料，DBM组骨缺损处植入DBM，ADSCs-DBM组骨缺损处植入ADSCs与DBM的复合物，自体骨组将截取的自体骨上下颠倒后再植入骨缺损处。植入材料后逐层缝合，不行内、外固定。

术后分笼饲养，肌肉注射庆大霉素1周，20 000 U/kg。术后4，8，12周，每个时间点麻醉后处死8只兔，每组4侧，行桡骨正位X射线片检查，根据EINHORN等[31]的X射线片评分标准评分(表1)。截取桡骨植骨部位及两端约2 mm正常骨组织，体积分数10%甲醛溶液固定，50%甲酸脱钙，石蜡包埋，常规组织切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察。

1.5 主要观察指标 ADSCs表面标记、成骨分化能力、成脂分化能力以及DBM复合ADSCs对桡骨缺损的影响。

1.6 统计学分析 采用SPSS 22.0统计软件包进行统计分析，计量资料数据用x±s表示，采用析因设计资料的方差分析，各组间采用多样本均数的单向方差分析，若方差齐，组间多重比较采用最小极差法(LSD)，方差不齐，组间多重比较采用Tamhane’s T2法，检验水准为α=0.05。该文章的统计学方法已经通过滨州医学院生物统计学专家审核。

讨论

骨为终生具备再生能力的组织，植入的支架材料临时填充损伤部位，在新生骨组织生成过程中，植入的材料逐渐降解并被新生骨组织替代，最终实现骨性愈合。DBM来源于天然骨，是临床上广泛应用的骨植入材料，但在去细胞、灭菌等制备过程中部分成骨因子丢失，影响了骨修复能力。该研究通过复合ADSCs的方法提高DBM的成骨能力，影像学检测和组织学观察都证实了负载ADSCs的DBM可促进兔桡骨节段性骨缺损愈合，有效提高DBM的骨修复能力。
2001年，ZUK等首次从脂肪组织中分离出来ADSCs，此类细胞黏附于塑料表面生长，可在体外诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，细胞表面标记物表达也符合间充质干细胞的特征[18]。虽然不同组织来源间充质干细胞均符合国际细胞治疗协会制定标准，但不同组织来源间充质干细胞之间也存在一定的差异性，如CD106在脐带来源间充质干细胞表面高表达，在脂肪源性干细胞表面不表达。该研究从脂肪组织中分离培养的细胞高表达CD44、CD71，低表达CD34、CD45、CD106，符合脂肪源性干细胞的特征。此外，不同组织来源间充质干细胞的增殖及分化能力也存在差异[32]。研究报道ADSCs向成脂细胞分化的能力优于骨髓间充质干细胞，而向成骨细胞和软骨细胞分化的能力则较差[33-34]。该研究中分离培养的ADSCs可诱导分化为成骨细胞，表现出了较强的成骨分化潜力，在动物实验中也显示出了一定促进骨修复能力。KANG等[35]以β-磷酸三钙为支架材料，比较骨髓间充质干细胞或ADSCs的成骨能力，结果显示两组的愈合率及新生骨形成面积相似。
促进骨再生的支架材料需有良好的生物相容性，可以让细胞附着、增殖、沉积细胞外基质。前期研究已证实应用改良法制备的骨材料无细胞毒性，MT3C3-E1成骨细胞前体细胞在材料上生长状态良好。GU等[24]研究表明，种植在DBM上的ADSCs保持成骨表型，并分泌沉积钙基质。该研究将ADSCs与改良法制备的DBM复合培养，细胞在DBM表面及内部孔隙内贴附生长，细胞形态未见明显变化，显示了良好的生长状态。除支架材料外，细胞种植密度也是影响成骨能力的一个重要的因素。研究表明，较高的细胞密度可通过多细胞团的形成促进细胞间接触，刺激间充质干细胞成骨分化。HIXON等[30]研究发现在支架材料上种植间充质干细胞浓度为1.5×1010 L-1时，可在早期促进细胞间联系和矿化。ZHANG等[36]发现高初始细胞接种密度间充质干细胞在三维支架上培养早期成骨分化更显著。因此该研究采用2×1010 L-1的初始细胞浓度，与DBM复合培养3 d可观察到ADSCs在DBM表面及孔隙内部生长，细胞之间紧密连接在一起，展现处良好的生长状况。
为证实DBM复合ADSCs对长骨节段性缺损的修复能力，该研究建立了兔桡骨缺损模型。一般认为长骨骨缺损达到一定的临界值，即达到长骨直径的1.5-2倍时就超过骨的自我修复能力，引起不愈合[29-30]。该实验中兔桡骨的直径在4.0-5.0 mm之间，12 mm的节段性骨缺损超过了桡骨直径的2倍，属于无法自行愈合的节段性骨缺损，空白对照组术后12周不能达到骨性修复，证实了所采用动物模型的可靠性。
研究表明，ADSCs不表达主要组织相容性复合体Ⅰ类、主要组织相容性复合体Ⅱ类以及共刺激分子CD80(B7-1)、CD86(B7-2)和CD40，免疫原性低，并具有负向免疫调节作用，同种异体移植不引起免疫排斥反应，可有效促进骨缺损修复[24-25]，这一点在体内研究中也得到了证实，X射线片和组织学观察均显示ADSCs-DBM组骨缺损修复虽然较自体骨差，但优于DBM组，ADSCs较好地弥补了DBM的成骨能力不足。GODOY ZANICOTTI 等[37]应用钛支架负载PKH26标记的ADSCs 修复绵羊股骨外上髁缺损，术后1个月仍可在缺损区域发现标记的细胞。WEN等[38]应用转染绿色荧光蛋白的ADSCs修复大鼠颅盖骨缺损，8周时在缺损区仍然可以观察到绿色荧光蛋白表达，证实移植的细胞参与了骨修复。HUSCH等[39]研究证实在裸鼠皮下植入ADSCs可以异位成骨。此外，ADSCs还通过分泌微囊泡的形式向植入区域释放多种细胞因子、生长因子、微小RNA和其他大分子，募集并刺激机体内的干细胞促进组织修复[40]。
综上所述，酶解贴壁法分离培养的ADSCs具有体外成骨分化能力；ADSCs可以在改良法制备的DBM支架上生长增殖，ADSCs复合DBM修复骨缺损的能力优于单纯DBM，可以有效修复原位骨缺损，具有较大的临床应用潜力。但在研究中未对比不同的ADSCs初始接种数量对成骨效果的影响，体内研究中ADSCs促骨修复的具体作用机制也有待进一步探索。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脱钙骨基质负载脂肪源性干细胞修复兔桡骨节段性骨缺损

Repair of segmental bone defect of rabbit radius by decalcified bone matrix loaded with adipose-derived stem cells

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