兔离断后肢深低温冻存中二甲基亚砜导入效果的定量分析

doi:10.12307/2025.462

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

微透析-冰点渗透压仪：原理是将一段带有半透膜的微透析探针置入到目标组织中，探针中有持续流动的标准灌流液，依靠灌流液将渗透过半透膜的局部组织液带出，完成标本的局部微创取样，再通过冰点渗透压仪测量溶液的冰点，准确测量目标溶液的渗透压，进而通过换算得到目标溶液浓度。
磁共振波谱技术：工作原理与磁共振相同，利用在强磁场中不同物质原子核的自旋频率不同，只有当外加磁场在某一频率时其能量才能够被该原子核吸收并发生能级跃迁现象。根据此原理可在无创条件下对活体组织内某种化合物进行定量检测，可对各种有机物和无机物的构成进行定性定量分析。

背景：保护剂导入效果在器官深低温冻存中至关重要，定量分析保护剂二甲基亚砜导入效果可为器官深低温冻存成功提供理论依据。

目的：研究兔离断后肢深低温冻存中二甲基亚砜导入效果。
方法：采用随机数字表法将50只新西兰大白兔随机分为A1组(n=8)、A2组(n=8)、B1组(n=8)、B2组(n=8)、C1组(n=6)、C2组(n=6)、C3组(n=6)，均建立离断后肢深低温保护剂灌注模型，A1组、A2组分别使用10%，20%二甲基亚砜溶液经股动脉持续灌注50 min，利用微透析-冰点渗透压仪检测肌肉组织中二甲基亚砜浓度；B1组、B2组分别使用10%，20%二甲基亚砜溶液经股动脉持续灌注30，20 min，利用核磁共振波谱检测血管周围、肌肉与皮下组织中二甲基亚砜浓度；C1组、C2组、C3组分别浸泡于50%，35%，20%二甲基亚砜溶液中30 min，利用核磁共振波谱检测血管周围、肌肉与皮下组织中二甲基亚砜浓度。

结果与结论：①A1组、A2组肌肉组织中的二甲基亚砜浓度随着灌注时间的延长而升高，A1组在灌注30 min后浓度稳定在5%左右，A2组在灌注20 min后浓度稳定在12%左右；A2组各灌注时间点肌肉组织中二甲基亚砜浓度均高于A1组(P < 0.05)；②B2组肌肉组织、血管周围与皮下组织中二甲基亚砜浓度分别为12%，20%，8.6%，B1组血管周围、肌肉组织与皮下组织中二甲基亚砜浓度分别为10.9%，6.9%，1%，两组间相同组织中二甲基亚砜浓度比较差异有显著性意义(P < 0.05)；③C1组、C2组、C3组肌肉组织和血管周围未检测到二甲基亚砜存在，C1组、C2组、C3组皮下组织中二甲基亚砜浓度分别为6.5%，2.3%，1.85%，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；④结果表明，对于兔离断后肢模型，深低温保护剂二甲基亚砜通过传统的浸泡法导入是无效的，而通过动脉灌注法导入20%二甲基亚砜溶液后可在大部分组织达到或接近有效的玻璃化浓度。

https://orcid.org/0009-0000-1350-4177 (李唐波)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 断肢再植, 深低温冻存, 二甲基亚砜, 微透析-冰点渗透压仪, 核磁共振波谱

Abstract: BACKGROUND: The effect of protective agent penetration is crucial in organ cryopreservation. Quantitative analysis of the effect of cryoprotectant dimethyl sulfoxide introduction can provide a theoretical basis for the successful cryopreservation of organs.
OBJECTIVE: To study the effect of dimethyl sulfoxide penetration on the cryopreservation of rabbits’ severed hindlimb.
METHODS: Fifty New Zealand white rabbits were randomly divided into group A1 (n=8), group A2 (n=8), group B1 (n=8), group B2 (n=8), group C1 (n=6), group C2 (n=6), and group C3 (n=6) by random number table method. The severed hind limb cryoprotectant perfusion model was established in all groups. Groups A1 and A2 were perfused with 10% and 20% dimethyl sulfoxide solution through the femoral artery for 50 minutes, respectively. The concentration of dimethyl sulfoxide in muscle tissue was detected by microdialysis-freezing osmometer. Group B1 and group B2 were perfused with 10% and 20% dimethyl sulfoxide solution through the femoral artery for 30 and 20 minutes, respectively. The concentration of dimethyl sulfoxide in perivascular, muscle and subcutaneous tissue was detected by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Group C1, group C2, and group C3 were immersed in 50%, 35%, and 20% dimethyl sulfoxide solution for 30 minutes, respectively. Nuclear magnetic resonance spectroscopy was used to detect the concentration of dimethyl sulfoxide in perivascular, muscle and subcutaneous tissues.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The concentration of dimethyl sulfoxide in the muscle tissue of groups A1 and A2 increased with the extension of perfusion time. The concentration of group A1 stabilized at about 5% after 30 minutes of perfusion, and the concentration of group A2 stabilized at about 12% after 20 minutes of perfusion. The concentration of dimethyl sulfoxide in the muscle tissue of group A2 at each perfusion time point was higher than that of group A1 (P < 0.05). (2) The concentrations of dimethyl sulfoxide in the muscle, perivascular and subcutaneous tissue of group B2 were 12%, 20%, and 8.6%, respectively. The concentrations of dimethyl sulfoxide in the perivascular, muscle tissue and subcutaneous tissue of group B1 were 10.9%, 6.9%, and 1%, respectively. There were significant differences in the concentrations of dimethyl sulfoxide in the same tissues between the two groups (P < 0.05). (3) The presence of dimethyl sulfoxide was not detected in the muscle and perivascular tissue of groups C1, C2, and C3. The concentrations of dimethyl sulfoxide in the subcutaneous tissue of groups C1, C2, and C3 were 6.5%, 2.3%, and 1.85%, respectively, and the difference between the groups was significant (P < 0.05). (4) These results suggest that for the rabbits’ severed hindlimb model, the dimethyl sulfoxide penetration is ineffective by traditional immersion method, while 20% dimethyl sulfoxide can reach or approach effective vitrification concentration in most tissues after being introduced into the model through arterial perfusion.

Key words: severed limb replantation, cryopreservation, dimethyl sulfoxide, microdialysis-freezing osmometer, nuclear magnetic resonance spectroscopy

中图分类号:

李唐波, 宋迪煜, 郝国兵, 张树明, 朱泽兴. 兔离断后肢深低温冻存中二甲基亚砜导入效果的定量分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(34): 7326-7332.

Li Tangbo, Song Diyu, Hao Guobing, Zhang Shuming, Zhu Zexing. Quantitative analysis on effect of dimethyl sulfoxide penetration in cryopreservation of rabbits’ severed hindlimb[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(34): 7326-7332.

图/表（结果） 6

2.1 A组模型肌肉组织中二甲基亚砜浓度检测结果 A1组离断后肢模型使用10%二甲基亚砜溶液经股动脉灌注后，肌肉组织内二甲基亚砜浓度随时间延长逐渐升高，并且在灌注30 min后稳定在5%左右；A2组离断后肢模型使用20%二甲基亚砜经股动脉灌注后，肌肉组织内二甲基亚砜浓度亦随时间延长逐渐升高，并且在20 min后稳定在12%左右；A2组灌注后各时间点肌肉组织中二甲基亚砜浓度均高于A1组，见表1、图2。

2.2 B组模型不同组织中二甲基亚砜浓度检测结果 B2组模型皮下组织、肌肉组织、血管周围组织内的二甲基亚砜峰下面积值均明显高于B1组(P < 0.001)，见表2、图3。

A2组模型灌注20 min后肌肉组织中二甲基亚砜浓度约为12%，从而推断B2组灌注20 min后肌肉组织中二甲基亚砜浓度为12%，进而通过波峰下面积等比例计算可得出B2组模型血管周围、皮下组织内二甲基亚砜的浓度分别为20%，8.6%，B1组血管周围、肌肉组织、皮下组织内二甲基亚砜的浓度分别为10.9%，6.9%，1%。由此可见，兔断肢模型经10%二甲基亚砜溶液灌注后(B1组)，仅血管周围组织中的保护剂浓度达到10%，其余组织细胞周围二甲基亚砜浓度无法达到目标浓度10%。
2.3 C组模型不同组织中二甲基亚砜浓度检测结果 C组模型中肌肉组织和血管周围均未发现二甲基亚砜波谱峰，只有皮下组织中可发现二甲基亚砜波谱峰，并且C1组、C2组、C3组皮下组织中二甲基亚砜波峰下面积值分别为798.23±51.25，282.45±21.44，227.18±13.55，明显低于B2组皮下组织中二甲基亚砜波峰下面积1 056.11±57.93(P < 0.001)，见图4。

同样方法，经上述等比例计算可得出C1组、C2组、C3组皮下组织中二甲基亚砜浓度分别为6.5%，2.3%，1.85%，这些浓度距离保护剂目标浓度10%都是远远不能达到的，由此可见，在有限的时间内整体浸泡法无法使兔离断后肢模型中各种组织达到有效玻璃化浓度。

参考文献

[1] WANG J, LIN J, PEI Y, et al. Cryopreservation and transplantation of amputated finger. Cryobiology. 2020;92:235-240.
[2] SILAN F, CONSIGLIO F, DELL’ANTONIA F, et al. Cryopreserved fascia lata allograft use in surgical facial reanimation: a retrospective study of seven cases. Maxillofac Plast Reconstr Surg. 2020;42(1):2.
[3] CHEN J, LIU X, HU Y, et al. Cryopreservation of tissues and organs: present, bottlenecks, and future. Front Vet Sci. 2023;10:1201794.
[4] AKEL RA, GUO XM, MORAVEK MB, et al. Ovarian Stimulation Is Safe and Effective for Patients with Gynecologic Cancer. J Adolesc Young Adult Oncol. 2020;9(3):367-374.
[5] PUY V, DUPEUX M, MAYEUR A, et al. Ovarian tissue cryopreservation can be combined simultaneously with oocyte retrieval after controlled ovarian hyperstimulation. Hum Reprod. 2023;38(5):860-871.
[6] LEONEL ECR, CORRAL A, RISCO R, et al. Stepped vitrification technique for human ovarian tissue cryopreservation. Sci Rep. 2019;9(1):1-12.
[7] WU K, SHARDT N, LAOUAR L, et al. Comparison of three multi-cryoprotectant loading protocols for vitrification of porcine articular cartilage. Cryobiology. 2020;92:151-160.
[8] MARQUEZ-CURTIS LA, ELLIOTT JAW. Mesenchymal stromal cells derived from various tissues: Biological, clinical and cryopreservation aspects: Update from 2015 review. Cryobiology. 2024;115:104856.
[9] EL CURY-SILVA T, NUNES MEG, CASALECHI M, et al. Cryoprotectant agents for ovarian tissue vitrification: Systematic review. Cryobiology. 2021;103:7-14.
[10] BARTOLAC LK, LOWE JL, KOUSTAS G, et al. Effect of different penetrating and non-penetrating cryoprotectants and media temperature on the cryosurvival of vitrified in vitro produced porcine blastocysts. Anim Sci J. 2018;89(9):1230-1239.
[11] YANG J, PAN C, ZHANG J, et al. Exploring the Potential of Biocompatible Osmoprotectants as Highly Efficient Cryoprotectants. ACS Appl Mater Interfaces. 2017;9(49):42516-42524.
[12] AWAN M, BURIAK I, FLECK R, et al. Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity? Regen Med. 2020;15(3):1463-1491.
[13] WHALEY D, DAMYAR K, WITEK RP, et al.Cryopreservation: An Overview of Principles and Cell-Specific Considerations. Cell Transplant. 2021;30: 963689721999617.
[14] BO H, SHOUWEN S, GUOHUI Y, et al. Clinical guideline for vascularized composite tissue cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 2021; 15(6):527-533.
[15] GOLEMOVIC M, SKIFIC M, HALUZAN D, et al. Ten-year experience with cryopreserved vascular allografts in the Croatian Cardiovascular Tissue Bank. Cell Tissue Bank. 2022;23(4):807-824.
[16] 董文祥.冰点渗透压仪的原理及故障分析[J].医疗设备信息,2004, 19(3):67-67.
[17] LARKINS MC, ZUBAIR M, THOMBARE A. Osmometer. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing,2024.
[18] 潘丽蓉,吴媛,赵子彦,等.基于两种检测方法对特膳食品渗透压测定的比对[J].食品科学,2023,44(24):339-345.
[19] 安卓玲,丁琨,刘春生,等.二甲基亚砜充当保护剂灌注兔离段肢体局部药物浓度的相对回收率[J].中国组织工程研究,2015,19(24): 3855-3859.
[20] THOMASSEN MB, HANBERG P, STILLING M, et al. Local concentrations of gentamicin obtained by microdialysis after a controlled application of a GentaColl sponge in a porcine model. J Orthop Res. 2020;38(8): 1793-1799.
[21] 张朕,朱泽兴,张树明.冰点渗透压仪定量二甲基亚砜标准曲线的建立[J].检验医学与临床,2015,12(8):1101-1102,1104.
[22] BUE M, THOMASSEN MB, LARSEN OH, et al. Local Vancomycin Concentrations after Intra-articular Injection into the Knee Joint: An Experimental Porcine Study. J Knee Surg. 2019;34(9):936-940.
[23] 冯玉飞,黄海伟,吴先富,等.1H定量核磁共振波谱法测定那红地那非的含量[J].中国新药杂志,2023,32(14):1478-1481.
[24] NAOMI N, NOBUYUKI M, SATOHIRO N, et al. Establishment of sperm cryopreservation and in vitro fertilisation protocols for rats. Sci Rep. 2020;10(1):93.
[25] TAKEO T, NAKAO S, MIKODA N, et al. Optimized protocols for sperm cryopreservation and in vitro fertilization in the rat. Lab Anim (NY). 2022;51(10):256-274.
[26] PI CH, DOSA PI, HUBEL A. Differential Evolution for the Optimization of DMSO-free Cryoprotectants: Influence of Control Parameters. J Biomech Eng. 2019;142(7):071006.
[27] ROGULSKA O, TYKHVYNSKA O, REVENKO O, et al. Novel Cryopreservation Approach Providing Off-the-Shelf Availability of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells for Clinical Applications. Stem Cells Int. 2019;11:4150690.
[28] 熊素雅,王宁,白梦天,等.飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术来源的角膜基质透镜保存方法的研究进展[J].实用临床医药杂志, 2023,27(18):145-148.
[29] 顾嘉敏,许淑嫚,郭帅,等.高压冷冻及冷冻替代样品制备方法在体扫描电镜中的应用[J].电子显微学报,2023,42(4):471-480.
[30] BUE M, HANBERG P, THOMASSEN MB, et al. Microdialysis for the Assessment of Intervertebral Disc and Vertebral Cancellous Bone Metabolism in a Large Porcine Model. In vivo (Athens, Greece). 2020;34(2):527-532.
[31] PELLE H, ANDREA L, KJELD S, et al. Single-dose pharmacokinetics of meropenem in porcine cancellous bone determined by microdialysis: An animal study. Bone Joint Res. 2019;8(7):313-322.
[32] HOGABOOM NS, ONISHI K, WOROBEY LA, et al. Microdialysis to Quantify Inflammatory Cytokines in the Glenohumeral Joint: A Brief Methods Report. Am J Phys Med Rehabil. 2019;98(5):426-429.
[33] CIBICEK N, EHRMANN J, PROSKOVA J, et al. Critical evaluation of colon submucosal microdialysis in awake, mobile rats. PLoS One. 2018; 13(1):e0191041.
[34] BITENCOURT AGV, GOLDBERG J, PINKER K, et al. Clinical applications of breast cancer metabolomics using high-resolution magic angle spinning proton magnetic resonance spectroscopy (HRMAS 1H MRS): systematic scoping review. Metabolomics. 2019;15(11):148.
[35] WISHART DS, CHENG LL, COPIÉ V, et al. NMR and Metabolomics-A Roadmap for the Future. Metabolites. 2022;23;12(8):678.
[36] MITOLO M, STANZANI-MASERATI M, CAPELLARI S, et al. Predicting conversion from mild cognitive impairment to Alzheimer’s disease using brain 1 H-MRS and volumetric changes: A two- year retrospective follow-up study. Neuroimage Clin. 2019;23:101843.
[37] ABBASPOUR F, MOHAMMADI N, AMIRI H, et al. Applications of magnetic resonance spectroscopy in diagnosis of neurodegenerative diseases: A systematic review. Heliyon. 2024;10(9):e30521.
[38] RADKA K, LADISLAV V, MARTIN G, et al. Detection and Alterations of Acetylcarnitine in Human Skeletal Muscles by 1H MRS at 7 T. Invest Radiol. 2017;52(7):412-418.
[39] KLEPOCHOVÁ R, NIESS F, MEYERSPEER M, et al. Correlation between skeletal muscle acetylcarnitine and phosphocreatine metabolism during submaximal exercise and recovery: interleaved 1H/31P MRS 7 T study. Sci Rep. 2024;14(1):3254.
[40] MODRZYŃSKI JJ, CHRISTENSEN JH, BRANDT KK. Evaluation of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a co-solvent for toxicity testing of hydrophobic organic compounds. Ecotoxicology. 2019;28(9):1136-1141.
[41] SCIORIO R, PLUCHINO N, FULLER BJ. Review of human oocyte cryopreservation in ART programs: Current challenges and opportunities. Cryobiology. 2023;113:104590.
[42] 王鐥,王成,史业弘.血管冷冻保护剂的临床应用[J].中国组织工程研究,2023,27(24):3920-3925.

引言

随着交通和工业的快速发展，肢体离断伤并不罕见，虽然以目前的医学技术完全可以做到断肢再植，但断肢再植“黄金6 h”严重限制了再植手术的实施。如果离断肢深低温冻存获得成功，移植将不再受时间和地域的限制，这对断肢再植技术来说将具有划时代的意义。但是当研究者们把成功深低温冻存细胞或单一组织的方法应用于器官或大块复合组织时，其结果却往往是失败的[1-3]。目前除卵巢及极少数简单的器官以外[4-5]，临床尚无经深低温保存后器官或大块复合组织经再植成功的案例[6]。目前对深低温冻存的第一步，如何使大块复合组织中不同细胞的外周环境满足深低温冻存所需的玻璃化程度有待进一步研究。二甲基亚砜作为常用的深低温冻存保护剂，可以渗透进入细胞内发生水合作用，使细胞发生玻璃化，调节细胞内外渗透压，保护细胞膜，减少冰晶损伤，从而对组织细胞冻存过程产生保护作用[7-9]。但二甲基亚砜同样会对组织产生细胞膜毒害、渗透损伤等毒性作用，并且随着二甲基亚砜浓度的升高，对组织细胞产生毒性作用增强[10-14]，因此，需要对二甲基亚砜导入大块组织内的浓度进行定量分析，以获得最佳的导入浓度及导入时间。此次研究通过定量分析二甲基亚砜在经动脉灌注或整体浸泡兔离断后肢模型中的导入效果，初步揭示深低温保护剂二甲基亚砜导入兔离断后肢模型时在时间和空间上的规律，得到了有效灌注时间和浓度分布范围，为将深低温冻存技术运用于断肢再植术提供理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2017年6月至2018年6月在北京农学院动物医院实验中心、中科院药物研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康新西兰大白兔50只，6月龄，体质量2.8-3.2 kg，雌雄不拘，清洁级，由北京农学院兽医学院提供，动物许可证号：SYXK(京)2015-0004，实验全过程均严格遵循《关于善待实验动物的指导性意见》。实验方案已获得中国人民解放军火箭军特色医学中心动物实验伦理委员会批准(批准号为KY2017029)。
1.3.2 主要试剂与仪器二甲基亚砜(≥99.5%，Sigma-Aldrich，Munich，Germany)；氯化钠注射液(9 g/L，100 mL、500 mL，石家庄四药有限公司)；肝素钠注射液(上海第一生化药业)；医用手术显微器械(宁波市成和显微器械厂)；微透析探针(CMA 30 Linear MD 4，CMA Microdialysis AB，Solna，Sweden)；微透析样品收集器(MAB 85低温微量型，上海永州实验设备有限公司)；冰点渗透压仪(OM806型，Löser Messtechnik，Berlin，Germany)；Bruker 7.0T小动物磁共振成像仪 (Pharma Scan 70/16 US，Bruker Corporation，Billerica，USA)；腰椎穿刺针(琼花牌，中国扬州市江洲医疗器械有限公司)。
将二甲基亚砜与氯化钠注射液分别以1∶9、1∶4、7∶13、1∶1的体积比混合，得到10%，20%，35%，50%二甲基亚砜溶液。
1.4 方法
1.4.1 实验分组采用随机数字表法将50只新西兰大白兔随机分为A1组(n=8)、A2组(n=8)、B1组(n=8)、B2组(n=8)、C1组(n=6)、C2组(n=6)、C3组(n=6)。7组均建立离断后肢深低温保护剂灌注模型，A1组、A2组分别使用10%，20%二甲基亚砜溶液经股动脉持续灌注50 min，利用微透析-冰点渗透压仪检测肌肉组织中二甲基亚砜浓度；B1组、B2组分别使用10%，20%二甲基亚砜溶液经股动脉持续灌注30，20 min，利用核磁共振波谱检测血管周围、肌肉与皮下组织中二甲基亚砜浓度；C1组、C2组、C3组分别浸泡于50%，35%，20%二甲基亚砜溶液中30 min，利用核磁共振波谱检测血管周围、肌肉与皮下组织中二甲基亚砜浓度。
研究表明，通常二甲基亚砜浓度高于10%可以实现组织细胞有效玻璃化，进而达到深低温保存细胞的目的[13，15]，故实验各组使用的二甲基亚砜溶液最低浓度为10%。
1.4.2 截肢造模所有新西兰大白兔经耳缘静脉注射空气处死，右髋部环形切口，腹股沟处分离保护股动脉、股静脉，于髋关节处离断兔后肢。密闭式静脉留置针取出内芯后，置入离断后肢的股动脉中，以家兔生理压力，用4 ℃肝素钠盐水持续灌注5 min，直至股静脉流出清澈液体，获得兔离断后肢深低温保护剂灌注模型。
1.4.3 深低温保护剂灌注方法所有灌注模型于恒温垫上操作。用腰穿针于小腿后外侧斜向入针至胫骨后面，稍退针至小腿三头肌内，然后调整进针，使穿刺针穿过小腿后侧肌群后穿出皮肤；拔出针芯，将微透析探针沿穿刺针管腔导入，通过长度测量计算确定微透析探针半透膜段位于兔小腿后侧肌群中，保持探针不动，抽出腰椎穿刺针，用丝线将微透析探针固定于皮肤，以确保线性微透析探针位于模型肌肉不变动，然后按照实验分组采用对应浓度的二甲基亚砜溶液进行灌注。
A1组、A2组在灌注后的第1，3，5，10，20，30，40，50分钟进行微透析取样，使用冰点渗透压仪检测肌肉组织中二甲基亚砜准确浓度，对每组同一时间点的8个样本检测浓度取平均值，绘制时间-浓度曲线，对比分析两组曲线的特点。冰点渗透压仪是基于拉乌尔冰点原理发明的，可通过测量溶液的冰点准确测量目标溶液的渗透压，进而通过换算得到目标溶液浓度[16-18]。课题组前期研究对二甲基亚砜灌注兔离断后肢模型进行了微透析技术可行性验证，获得了稳定的模型相对回收率[19]，结果认为透析技术可以作为模型局部组织持续、稳定取样的微量检测方法[20]。课题组前期使用二甲基亚砜标准浓度液对冰点渗透压仪准确性进行了验证，结果认为冰点渗透压仪可以作为模型中二甲基亚砜浓度准确检测方法[21]。

B1组使用10%二甲基亚砜经股动脉持续灌注30 min，B2组使用20%二甲基亚砜经股动脉持续灌注20 min，灌注结束后，使用7.0T小动物磁共振成像仪检测离断兔后肢模型中血管周围、肌肉组织、皮下组织中二甲基亚砜峰下面积(图1)，对比分析两组离断后肢模型中各组织二甲基亚砜浓度差异。两组灌注时间是根据A组结果确定的。与磁共振成像技术主要原理相同，磁共振波谱技术利用了不同物质在不同磁场强度下会产生共振的特点，并且不同物质一般会以不同的频率共振，物质越多在该频率范围内产生的信号强度就越大，从而在磁共振波谱中产生不同信号强度的波谱峰，其峰下面积与物质浓度呈正比[22-23]，故可通过二甲基亚砜特有的波峰下面积等比例计算出各组织中二甲基亚砜浓度。此次实验中7.0T小动物磁共振成像仪按照1 mm×1 mm×1 mm进行取样，每个样本取2处，取平均值。

C1组、C2组、C3组断端皮肤紧密缝合封闭创面，室温条件下分别浸泡在50%，35%，20%二甲基亚砜溶液中30 min，取出去除表面冻存保护剂溶液后，使用7.0T小动物磁共振成像仪检测各模型中血管周围、肌肉组织内、皮下组织内二甲基亚砜的峰下面积。
1.5 主要观察指标 ①A组兔离断后肢肌肉组织中各时间点二甲基亚砜浓度值；②B组兔离断后肢皮下组织、肌肉组织、血管周围组织中二甲基亚砜波峰下面积值；③C组兔离断后肢皮下组织、肌肉组织、血管周围组织中二甲基亚砜波峰下面积值。
1.6 统计学分析使用SPSS 20.0、GraphPad Prism 8.0对数据进行统计分析和图形绘制，所有计量资料均符合正态分布，表示为x±s，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05被认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经中国人民解放军火箭军特色医学中心生物统计学专家审核。

讨论

3.1 复合组织中深低温冻存保护剂导入效果的定量评估以往研究者们常采用细胞培养方法对细胞的深低温保存技术进行评估，但是对于复合组织，尤其是功能复杂、结构多样的复合组织的评估，靠细胞培养的方法是明显无法到达的[24-26]。因此对于复合组织的深低温冻存有效性评估，目前大多是通过免疫组化、光镜、电镜等方法去观察功能单位的微观结构甚至超微结构的变化情况，进而定性评估复合组织的深低温冻存效果[27-29]。但是这些只能对复合组织“破坏与否”进行定性判断，缺乏一种对于复合组织深低温保护剂导入效果进行定量评估的方法。课题组前期针对二甲基亚砜灌注兔离断后肢模型进行了微透析技术可行性验证并获得了稳定的模型相对回收率；同时用二甲基亚砜标准浓度液对冰点渗透压仪准确性进行了验证，认为冰点渗透压仪可作为二甲基亚砜样本的准确检测方法，故此次实验采用冰点渗透压仪对兔离断后肢模型中二甲基亚砜浓度进行定量分析。
3.2 微透析-冰点渗透压仪微透析技术是用灌流液通过特制的带有透析膜的探针，对活体生物的某一部位进行动态微量取样的一种技术[30]，该技术经过校正后可精准地对局部组织中的小分子物质进行取样，并可以长时间在体持续取样检测[31]。该技术最大的优势在于可以持续取样，即可以得到目标物在某一特定位置多个时间点的浓度，便于依据具体情况变化及时处置[32]。冰点渗透压仪可通过测量取样溶液的冰点准确测量目标溶液的渗透压，进而通过换算得到目标溶液的浓度[16-18]。
此次实验采用微透析-冰点渗透压仪检测兔离断后肢小腿后群肌肉中灌注的二甲基亚砜浓度，得到肌肉组织内保护剂时间-浓度曲线，结果显示在最大取样时间50 min内，不论A1组还是A2组，其二甲基亚砜时间-浓度曲线的形态都表现为快速上升期和稳定平台期2个部分。A2组断肢模型使用20%二甲基亚砜经股动脉灌注约20 min后肌肉组织内二甲基亚砜浓度稳定在12%左右，由此可得出该保护剂导入方法的有效灌注时间至少需要20 min，并且二甲基亚砜浓度在肌肉组织内达到12%左右时达到平衡，这与组织细胞玻璃化所需的二甲基亚砜目标浓度(10%)相近[13，15]，从而使肌肉组织细胞在深低温冷冻-复温过程中得到有效保护。因此，对于兔离断后肢模型二甲基亚砜持续导入时间的合理性有了明确量化标准。此次实验结果显示，A1组兔断肢模型经10%二甲基亚砜溶液灌注约30 min后肌肉组织中二甲基亚砜浓度稳定在5%左右，可见该保护剂导入方法的有效灌注时间至少需要30 min，同时也表明灌注10%二甲基亚砜在肌肉组织间液达到5%左右时与细胞内液的渗透压达到平衡，这与目标浓度10%相比明显是不够的，因此常规使用10%二甲基亚砜进行动脉灌注是无法是断肢模型各组织细胞达到有效玻璃化。
微透析-冰点渗透压仪技术可以帮助人们获得深低温保护剂灌注时间-浓度曲线，但同时也存在一定的弊端[33]，主要表现在该技术无法在空间上自由切换，故对断肢模型中皮下组织、血管周围组织内保护剂浓度的定量检测及变化规律还需进一步研究，因此进一步引入了核磁共振波谱技术。
3.3 核磁共振波谱技术核磁共振波谱技术是近年发展起来的一种检查手段[34-35]，可以在无创条件下对活体各组织内某种化合物进行定量检测[36-37]。与既往常规切片检测以及微透析-冰点渗透压技术相比，核磁共振波谱技术的最大优势是可以多点位取样，获得完全客观、量化的检测值，这对复合组织深低温冻存效果评估方法的改进来说具有重要意义。
此实验利用核磁共振波谱技术将二甲基亚砜的定量检测范围由肌肉组织扩大到了血管周围、皮下组织，这种量化检测方法较传统定性评估方法更有说服力 [38-39]，可以得到二甲基亚砜在复合组织中任意部位的浓度值，对复合组织深低温保护剂导入方法的改进有重要的指导意义。此实验结果显示，B1组与B2组在血管周围、肌肉组织、皮下组织内的二甲基亚砜浓度差异均有统计学差异，结合A2组的结果，可知B2组肌肉组织中二甲基亚砜的浓度为12%左右，由此等比推算，可得出B2组血管周围、皮下组织中二甲基亚砜的浓度分别为20%，8.6%，B1组血管周围、肌肉组织、皮下组织中二甲基亚砜的浓度分别为10.9%，6.9%，1%。由此可见，如果常规使用10%二甲基亚砜溶液进行灌注，只有血管周围可以达到10%的目标浓度，而肌肉组织及皮下组织均无法达到玻璃化所需要的目标浓度，进而无法使断肢模型各组织细胞均达到有效玻璃化；而采用20%二甲基亚砜进行灌注时，断肢模型中皮下组织中二甲基亚砜的浓度可以达到8.6%，这已很接近10%的目标浓度，这也提示既往使用10%二甲基亚砜灌注导入的方法具有明显缺陷，可能也是低温冻存断肢再植技术尚未取得明显突破的原因。但也应注意到，采用20%二甲基亚砜灌注后血管周围保护剂浓度已达到20%，较目标浓度明显偏高，提示虽然这种方法可以保证模型所有组织都达到有效玻璃化，但也需考虑到高浓度保护剂对组织的毒性作用[40-42]，这可能需要进一步研究，是否需要使用复合保护剂以减轻二甲基亚砜的毒性作用。
3.4 灌注法的评估对于大块复合组织来说，灌注法具有独特优势。灌注法利用了复合组织血管解剖结构，理论上可以通过动静脉血管将深低温保护剂送至每个细胞周围，也是灌注法与浸泡法的本质区别。此次实验通过微透析-冰点渗透压仪技术对复合组织肌肉内的深低温保护剂浓度进行连续测定，得到其时间-浓度曲线，并发现了保护剂灌注的稳定平台期，进而得出了对于兔离断后肢模型的保护剂平衡时间。在得到复合组织中保护剂灌注的时间分布规律后，还要对保护剂的空间分布进行定量检测，因此实验引入了核磁共振波谱技术。从实验结果上看，各组织间二甲基亚砜存在浓度梯度，梯度的方向与经血管灌注梯度的规律是一致的；在以肌肉保护剂灌注拐点时间为标准检测其他部位二甲基亚砜浓度时，发现传统使用10%保护剂浓度是不够的，尤其在皮下组织其保护剂浓度只有1%，远没有达到10%的目标浓度，而在使用浓度为20%保护剂进行灌注时，皮下组织内二甲基亚砜浓度也达到了8.6%，接近目标浓度。总而言之，将二甲基亚砜灌注浓度提高到20%时可以使断肢模型各组织细胞达到或接近有效玻璃化所需的保护剂浓度，有理由认为该改进方向有可能成为大块复合组织深低温保护剂导入方法修改的重要方向之一。
3.5 浸泡法的评估此次实验结果显示，C组肌肉、血管周围均未发现二甲基亚砜波谱峰，也就是说在有限的时间内二甲基亚砜无法渗透到离断后肢模型深部，使其组织细胞有效玻璃化。由此可见，由于皮肤的隔离作用，常规浓度保护剂整体浸泡无法使模型深部细胞达到有效玻璃化。其次，在提高了二甲基亚砜浸泡浓度以后，发现整体浸泡法可在模型皮下组织内起到一定的玻璃化效果。因此，虽然理论上可以通过升高二甲基亚砜浸泡浓度进而提高模型深部组织内的保护剂浓度，但继续提高浸泡浓度可能会对皮肤及皮下组织造成不可逆的毒性损害[40-42]。
3.6 结论此次实验以兔离断后肢模型作为研究对象，分别采用微透析-冰点渗透压仪、核磁共振波谱技术定量检测二甲基亚砜导入模型的效果，揭示了肌肉组织中二甲基亚砜的时间-浓度变化规律，以及皮下组织、肌肉组织、血管周围组织的空间-浓度分布规律。研究结果显示，采用整体浸泡法或常规10%二甲基亚砜溶液经动脉灌注法无法使断肢模型中所有组织达到深低温冻存所需的玻璃化浓度，但是将二甲基亚砜浓度提高到20%时可使断肢模型中大部分组织达到或接近达到深低温冻存所需的玻璃化浓度。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

HTML			PDF

最新录用	在线预览	正式出版	最新录用	在线预览	正式出版
0	0	0	0	0	22

来源	本网站	其他网站

次数	14	8
比例	64%	36%

摘要

147

最新录用	在线预览	正式出版

0	0	147

	来源	本网站

	次数	147
	比例	100%