程序性细胞死亡受体1影响高糖条件下成骨细胞分化的机制

doi:10.12307/2025.665

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (17): 3521-3528.doi: 10.12307/2025.665

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程序性细胞死亡受体1影响高糖条件下成骨细胞分化的机制

张万里1，白涛2，韩念荣2，艾克热木•吾斯曼2，刘岩路2，黄异飞2，胡炜2

1伊犁哈萨克自治州友谊医院骨二科，新疆维吾尔自治区伊宁市 835000；2新疆医科大学附属中医医院脊柱二科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000

收稿日期:2024-05-28 接受日期:2024-08-05 出版日期:2025-06-18 发布日期:2024-10-30
通讯作者: 胡炜，主任医师，新疆医科大学附属中医医院脊柱二科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000
作者简介:张万里，男，1984年生，江苏省丰县人，汉族，副主任医师，主要从事脊柱外科研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金-杰出青年科学基金项目(2022D01E29)，项目负责人：胡炜

Mechanism by which programmed cell death protein 1 influences osteoblast differentiation under high-glucose conditions

Zhang Wanli1, Bai Tao2, Han Nianrong2, Akram·Osman2, Liu Yanlu2, Huang Yifei2, Hu Wei2

1Second Department of Orthopedics, Friendship Hospital of Yili Kazak Autonomous Prefecture, Yining 835000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Second Department of Spine, Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2024-05-28 Accepted:2024-08-05 Online:2025-06-18 Published:2024-10-30
Contact: Hu Wei, Chief physician, Second Department of Spine, Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Zhang Wanli, Associate chief physician, Second Department of Orthopedics, Friendship Hospital of Yili Kazak Autonomous Prefecture, Yining 835000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region - Excellent Youth Science Foundation Program, No. 2022D01E29 (to HW)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
程序性细胞死亡受体1：是一种跨膜蛋白，广泛表达于活化的T细胞、B细胞以及单核细胞等，与靶细胞上的程序性细胞死亡配体1特异性结合后具有共抑制/共刺激的免疫调控作用，可抑制T细胞活化、增殖及细胞因子分泌，参与肿瘤免疫、自身免疫及免疫耐受等。
糖尿病性骨质疏松：是糖尿病常见的并发症，常伴发骨量的丧失和骨结构的破坏，增加骨折风险。

背景：程序性细胞死亡受体1属于免疫球蛋白基因超家族，可以调控成骨细胞分化、影响骨稳态，然而其在糖尿病性骨质疏松中的调控作用及机制尚不明确。
目的：探讨程序性细胞死亡受体1对高糖环境下大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的调控作用及机制。
方法：①动物实验：采用随机数字法将12只SD大鼠随机分为对照组(n=6)与模型组(n=6)，对照组常规喂养，模型组腹腔注射链脲佐菌素建立1型糖尿病模型，高脂饲料喂养8周建立1型糖尿病性骨质疏松模型。喂养8周后，取2组大鼠股骨，分别进行苏木精-伊红染色、micro-CT检测与程序性细胞死亡受体1、程序性细胞死亡配体1 mNRA表达。②细胞实验：将第3代大鼠骨髓间充质干细胞随机分4组处理：正常对照组、高糖模型组加入低糖培养基，PD-1沉默组转染程序性细胞死亡受体1 siRNA，PD-1沉默空载组转染siRNA-NC。转染48 h后，正常对照组更换为新的低糖培养基，高糖模型组、PD-1沉默组、PD-1沉默空载组更换为高糖培养基，培养48 h后进行成骨诱导培养。成骨诱导21 d后，分别进行茜素红染色、qRT-PCR(程序性细胞死亡受体1、RUNX2 mRNA表达)与Western blot(β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β与Axin2 蛋白表达)检测。
结果与结论：①动物实验：苏木精-伊红染色与micro-CT检测结果显示，模型组大鼠1型糖尿病骨质疏松造模成功。qRT-PCR检测结果显示，模型组程序性细胞死亡受体1、程序性细胞死亡配体1 mRNA表达均高于对照组(P < 0.05)。②细胞实验：茜素红染色结果显示，高糖模型组、PD-1沉默空载组矿化结节形成能力低于对照组、PD-1沉默组。与正常对照组比较，高糖模型组、PD-1沉默空载组程序性细胞死亡受体1 mRNA表达及GSK3β、Axin2蛋白表达均升高(P < 0.05)，RUNX2 mRNA表达及p-GSK3β、β-catenin蛋白表达均降低(P < 0.05)；与高糖模型组、PD-1沉默空载组比较，PD-1沉默组程序性细胞死亡受体1 mRNA表达及GSK3β、Axin2蛋白表达均降低(P < 0.05)，RUNX2 mRNA表达及p-GSK3β、β-catenin蛋白表达均升高(P < 0.05)。③结果表明：沉默程序性细胞死亡受体1表达可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进高糖条件下大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化。

https://orcid.org/0009-0003-1519-0919(张万里)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨髓间充质干细胞, 糖尿病, 骨质疏松, 成骨分化, 程序性细胞死亡受体1, Wnt/β-catenin信号通路, 工程化组织构建

Abstract: BACKGROUND: Programmed cell death protein 1 belongs to the immunoglobulin gene superfamily and can regulate the differentiation of osteoblasts and affect bone homeostasis. However, there are few studies on the regulatory role and mechanism of programmed cell death protein 1 in diabetic osteoporosis.
OBJECTIVE: To investigate the regulatory role and mechanism of programmed cell death protein 1 on osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells under high-glucose environment.
METHODS: (1) Animal experiment: A total of 12 Sprageu-Dawley rats were randomized into a control group (n=6) and a model group (n=6). The control group was fed routinely, whereas the model group was injected intraperitoneally with streptozotocin to establish a model of type 1 diabetes mellitus, and the high-fat feed was fed for 8 weeks to establish a model of type 1 diabetic osteoporosis. After 8 weeks of feeding, the femurs of rats in the two groups were taken and subjected to hematoxylin-eosin staining and micro-CT assay. The mRNA expression of programmed cell death protein 1 and programmed death ligand 1 was detected. (2) Cell experiment: Passage 3 rat bone marrow mesenchymal stem cells were randomly divided into four groups: normal control group, high-glucose model group cultured in low glucose medium, programmed cell death protein 1-silenced group transfected with programmed cell death protein 1 siRNA, and programmed cell death protein 1-silenced null group transfected with siRNA-NC. After 48 hours of transfection, the normal control group was cultured in a new low-glucose medium, and the other three groups were cultured in a high-glucose medium for another 48 hours of culture followed by osteogenic induction. After 21 days of osteogenic induction, alizarin red staining, and qRT-PCR (programmed cell death protein 1 and RUNX2 mRNA expression) and western blot (β-catenin, GSK-3β, p-GSK-3β and Axin2 protein expression) were performed.
RESULTS AND CONCLUSION: In the animal experiment, hematoxylin-eosin staining and micro-CT assay showed successful modeling of type 1 diabetic osteoporosis in the model group. qRT-PCR assay showed that the mRNA expression of programmed cell death protein 1 and programmed cell death ligand 1 was higher in the model group than the control group (P < 0.05). In the cell experiment, the results of alizarin red staining showed that the ability of mineralized nodule formation was lower in the high-glucose model group and the programmed cell death protein 1-silenced null group than in the control group and the programmed cell death protein 1-silenced group. Compared with the normal control group, the programmed cell death protein 1 mRNA expression and GSK3β and Axin2 protein expression were elevated in the high-glucose model group and the programmed cell death protein 1-silenced null group (P < 0.05), and the RUNX2 mRNA expression and p-GSK3β and β-catenin protein expression were decreased (P < 0.05). Compared with the high-glucose model group and the programmed cell death protein 1-silenced null group, programmed cell death protein 1 mRNA expression and GSK3β and Axin2 protein expression were decreased in the programmed cell death protein 1-silenced group (P < 0.05), and RUNX2 mRNA expression and p-GSK3β and β-catenin protein expression were elevated (P < 0.05). To conclude, programmed cell death protein 1 silencing can activate the Wnt/β-catenin and improve the osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells under high-glucose conditions.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: bone marrow mesenchymal stem cells, diabetes mellitus, osteoporosis, osteogenic differentiation, programmed cell death protein 1, Wnt/β-catenin pathway, engineered tissue construction

中图分类号:

张万里, 白涛, 韩念荣, 艾克热木•吾斯曼, 刘岩路, 黄异飞, 胡炜. 程序性细胞死亡受体1影响高糖条件下成骨细胞分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(17): 3521-3528.

Zhang Wanli, Bai Tao, Han Nianrong, Akram·Osman, Liu Yanlu, Huang Yifei, Hu Wei. Mechanism by which programmed cell death protein 1 influences osteoblast differentiation under high-glucose conditions[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(17): 3521-3528.

图/表（结果） 7

2.1 动物实验结果
2.1.1 实验动物数量分析 12只SD大鼠全部进入结果分析。
2.1.2 1型糖尿病骨质疏松动物模型建立情况腹腔注射链脲佐菌素72，96，120 h后，对照组大鼠空腹血糖浓度 < 9 mmol/L，模型组大鼠空腹血糖浓度均> 16.7 mmol/L，说明造模组大鼠建立1型糖尿病模型成功。高脂饲料喂养期间，各组大鼠体质量与血糖变化，见图1A，显示模型组大鼠体质量始终低于对照组，血糖浓度均高于对照组。
高脂饲料喂养8周后，股骨组织苏木精-伊红染色结果显示，相较于对照组，模型组骨小梁减少、紊乱、骨皮质变薄，见图1B。micro-CT检测结果显示，模型组大鼠股骨远端骨小梁的骨量减少，松质骨断裂，股骨密度、骨体积分数、骨小梁数及骨小梁厚度均低于对照组(P < 0.05)，骨小梁分离度高于对照组(P < 0.05)，见图1C。以上结果表明，实验成功建立了1型糖尿病骨质疏松大鼠模型。
2.1.3 两组大鼠股骨组织中程序性细胞死亡受体1、程序性细胞死亡配体1 mNRA表达 qRT-PCR检测结果显示，模型组大鼠股骨组织中程序性细胞死亡受体1、程序性细胞死亡配体1 mNRA表达均高于对照组(P < 0.05)，见图2。
2.2 细胞实验结果
2.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞鉴定流式细胞术分析结果显示，骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达(96.6%)，CD45呈阴性表达(0.26%)，见图3。表明骨髓间充质干细胞纯度高。
2.2.2 程序性细胞死亡受体1沉默siRNA筛选 qRT-PCR检测结果显示，正常对照组与PD-1沉默空载组大鼠骨髓间充质干细胞中程序性细胞死亡受体1 mRNA表达比较无明显差异(P > 0.05)，说明空载体siRNA-NC对程序性细胞死亡受体1 mRNA表达无影响；与正常对照组比较，3个程序性细胞死亡受体1 siRNA组大鼠骨髓间充质干细胞中程序性细胞死亡受体1 mRNA表达均降低(P < 0.05)，其中以程序性细胞死亡受体1 siRNA3沉默效果最好，见图4。所以，最终实验选择此组siRNA进行细胞转染。
2.2.3 各组大鼠骨髓间充干细胞中程序性细胞死亡受体1、RUNX2 mRNA表达成骨诱导21 d后qRT-PCR检测结果显示，高糖模型组、PD-1沉默空载组程序性细胞死亡受体1 mRNA表达高于正常对照组、PD-1沉默组(P < 0.05)，RUNX2 mRNA表达低于正常对照组、PD-1沉默组(P < 0.05)；高糖模型组与PD-1沉默空载组程序性细胞死亡受体1、RUNX2 mRNA表达无明显差异(P > 0.05)，见图5。
2.2.4 茜素红染色结果成骨诱导21 d后茜素红染色结果显示，正常对照组大鼠骨髓间充质干细胞矿化结节形成能力最强，高糖模型组、PD-1沉默空载组大鼠骨髓间充质干细胞矿化结节形成能力较弱，PD-1沉默组大鼠骨髓间充质干细胞矿化结节形成能力居中，见图6。
2.2.5 各组大鼠骨髓间充干细胞中Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达 Western blot检测结果显示，与正常对照组比较，高糖模型组、PD-1沉默空载组GSK3β、Axin2蛋白表达均升高(P < 0.05)，p-GSK3β、β-catenin蛋白表达均降低(P < 0.05)；与高糖模型组、PD-1沉默空载组比较，PD-1沉默组程GSK3β、Axin2蛋白表达均降低(P < 0.05)，p-GSK3β、β-catenin蛋白表达均升高(P < 0.05)，见图7。

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引言

糖尿病性骨质疏松是一种糖尿病引起的骨骼并发症[1]。在糖尿病高糖微环境下，患者往往会伴随骨量减少、骨微结构改变、骨强度减低、骨质量受损、脆性增加、骨代谢异常等现象，易发生骨痛、骨折等临床问题[2]。现有数据表明，糖尿病患者伴骨质疏松并发症的发生率约为55%，严重影响患者的生活质量[3-4]。
相较于2型糖尿病，1型糖尿病的骨质流失始于发病，早在儿童时期就开始了，这决定了骨量峰值较低，诱发骨质疏松和骨折的风险更大[5]。1型糖尿病性骨脆性的发病机制十分复杂，高血糖和胰岛素缺乏会影响骨细胞功能及骨髓功能，从而损害骨骼强度、几何形状和微结构。胰岛素不足与高血糖还可能引起晚期糖基化终末产物及其受体激活、胰岛素生长因子减少、骨钙素改变，抑制骨形成通路活性，进而导致骨形成障碍[6]。
已知骨生成与骨破坏二者失衡是糖尿病性骨质疏松发生的主要原因[7]。骨髓间充质干细胞具有分化为成骨细胞、破骨细胞的能力，在骨形成、维持和重建中发挥着重要作用[8]。在长期高糖环境下，骨髓间充质干细胞的生物活性及功能特性发生紊乱，高糖会促进骨髓间充质干细胞的老化和凋亡、加速细胞成脂向分化、减缓细胞旁分泌及成血管向分化，进而抑制成骨[9]。已有研究证实，在糖尿病高糖条件下骨髓间充质干细胞的功能作用发生改变，高糖抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化、促进成脂分化，降低骨转换和骨强度，抑制骨再生[10-11]。因此，探讨促进高糖微环境下骨髓间充质干细胞成骨分化的方法对治疗和预防糖尿病性骨质疏松症至关重要。
程序性细胞死亡受体1对于维持自身耐受性至关重要[12]。程序性细胞死亡受体1有2个已知的配体，程序性细胞死亡配体1和程序性细胞死亡配体2。程序性细胞死亡配体1主要表达于造血系统来源的细胞，如活化的T细胞、B细胞、单核细胞、树突细胞、巨噬细胞，亦可表达于外周非造血组织，如内皮细胞、心脏、骨骼肌、胎盘、肺、肾、肝等组织细胞；而程序性细胞死亡配体2的表达主要局限于树突状细胞、巨噬细胞和B细胞[13-14]。因此，程序性细胞死亡受体1/程序性细胞死亡配体1的激活可以调控成骨细胞及破骨细胞的分化，影响骨稳态[15-16]。然而，程序性细胞死亡受体1在糖尿病性骨质疏松中的调控作用及机制尚不明确。
此次实验通过建立大鼠1型糖尿病模型，观察骨组织结构变化及程序性细胞死亡受体1的表达，进而通外细胞实验，探讨程序性细胞死亡受体1对高糖条件下骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，阐明程序性细胞死亡受体1在糖尿病性骨质疏松中的作用，为临床治疗提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计动物实验与体外细胞学实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2023年10-12月在武汉贝赛模式生物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雌性SD大鼠12只，6-8周龄，体质量(200±20) g，购自湖北省实验动物中心，许可证号：SCXK (鄂)2021-0027。实验前适应性饲养1周，环境条件为室温22-25 ℃，相对湿度40%-60%，光照周期12 h，自由饮水，常规饲养饮食。动物实验已通过武汉贝赛模式生物中心实验动物福利与伦理管理委员会批准[BSMS动(福)第2023-08-28B号]。
1.3.2 细胞、试剂与设备大鼠骨髓间充质干细胞(货号：RASMX-01001，Cyagen)；大鼠骨髓间充质干细胞完全培养基(货号：RAXMX-90011，Cyagen)；链脲佐菌素(货号：18883664，阿拉丁)；高脂饲料(脂肪含量32%，武汉贝赛模式生物中心)；GSK3β抗体(货号：#9315，CST)；p-GSK3β抗体(货号：#5558，CST)；Axin2抗体(货号：20540-1-AP，武汉三鹰)；β-catenin抗体(货号：#8480，CST)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：AS1086，ASPEN)；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(货号：AS1012，ASPEN)；成骨诱导分化试剂盒(货号：RAXMX-90021，Cyagen)；茜素红S染液(货号：G1038， Servicebio)；Opti-MEM无血清培养基(货号：31985，GIBCO)；TRIpure Total RNA Extraction Reagent(货号：EP013，ELK Biotechnology)；EntiLink™ 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix(货号：EQ031，ELK Biotechnology)；HRP标记的上样抗兔二抗(货号：AS1107，ASPEN)；CD44抗体(货号：MA5-17522，Invitrogen)；CD45抗体(货号：11-0461-80，Ebioscience)；Lipofectamine 2000(货号：11668019，invitrogen)；流式检测仪(型号：CytoFLEX，Beckman)；micro-CT仪器(型号：SkyScan 1276，德国Bruker)。
1.4 实验方法
1.4.1 动物实验
实验分组与造模：采用随机数字表法将12只SD大鼠随机分为对照组(n=6)与模型组(n=6)。对照组大鼠正常喂养。模型组大鼠腹腔注射链脲佐菌素70 mg/kg建立1型糖尿病模型，72，96，120 h后检测大鼠空腹血糖浓度≥16.7 mmol/L判定为成功建立1型糖尿病模型。1型糖尿病造模成功后，给予模型组大鼠高脂饲料喂养8周，建立1型糖尿病性骨质疏松模型[17]。每周检测大鼠体质量与血糖变化。喂养8周后，腹腔注射3%戊巴比妥钠(60 mg/kg)麻醉后断颈处死所有大鼠，置于体积分数为75%乙醇中浸泡10 min，分离股骨，通过苏木精-伊红染色与 micro-CT检测验证1型糖尿病骨质疏松造模成功；

qRT-PCR检测程序性细胞死亡受体1、程序性细胞死亡配体1 mNRA表达。

苏木精-伊红染色：股骨组织在40 g/L多聚甲醛中固定24 h，在脱钙溶液中脱钙约1个月，用自来水洗涤48 h，用乙醇梯度脱水，包埋石蜡、切片，进行苏木精-伊红染色。
micro-CT检测：股骨组织用40 g/L多聚甲醛固定24 h，然后使用Micro-CT仪进行分析，扫描参数如下：电压，100 kV；电流，200 μA；曝光时间，384 ms；旋转角度，180°。使用三维重建软件NRecon(软件版本 V1.7.4.2，德国Bruker公司)对原始图像进行选择区域的重建，由软件计算骨体积分数、骨小梁数、骨小梁厚度及骨小梁分离度。
qRT-PCR检测：取股骨组织，采用TRIpure Total RNA Extraction Reagent提取RNA，使用EntiLink™ 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix试剂盒反转录成cDNA：第一链cDNA合成，2×EntiLink™ Synthesis Super Mix 10 μL，RNA 2 μg，加ddH2O至20 μL；25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。
qPCR反应：2×Master Mix 5 μL，引物工作液(2.5 μmol/L)1 μL，Template 1 μL，ddH2O 2 μL，Rox 1 μL，配制成10 μL体系混合均匀，在仪器上保持95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，40个循环，获得qPCR反应结果，采用2-ΔΔCt方法量化计算目标mRNA表达。引物设计见表1。

1.4.2 细胞实验

大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定：大鼠骨髓间充质干细胞正常培养传代，细胞融合到80%-90%时胰酶消化，收集细胞至离心管中，300×g离心5 min，去上清，用100 μL 4 ℃预冷的PBS重悬细胞。取1 mL细胞悬液转移至流式管中，加入荧光标记的一抗(CD44抗体10 μL，CD45抗体0.5 μL)4 ℃避光孵育20 min；加入1 mL PBS重悬细胞，300×g离心5 min，弃上清；加入100 μL PBS重悬，收集细胞悬液至流式管中，上流式检测仪检测。
实验分组与处理：将第3代大鼠骨髓间充质干细胞以 5×105/孔的密度接种于6孔板中，随机分为正常对照组、高糖模型组、PD-1沉默组、PD-1沉默空载组。正常对照组、高糖模型组加入低糖完全培养基(含5.6 mmol/L葡萄糖)，PD-1沉默组转染程序性细胞死亡受体1 siRNA，PD-1沉默空载组转染siRNA-NC。转染48 h后，对照组更换为新的低糖完全培养基，高糖模型组、PD-1沉默组、PD-1沉默空载组更换为高糖完全培养基(含30 mmol/L葡萄糖)，培养48 h后进行成骨诱导培养。成骨诱导21 d后，分别进行茜素红染色、qRT-PCR(程序性细胞死亡受体1、RUNX2 mRNA表达)与Western blot(β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β与Axin2 蛋白表达)检测。
细胞转染：用250 μL Opti-MEM无血清培养基将siRNA(表2，委托广州锐博生物公司设计)分别稀释至200 nmol/L，轻轻混匀，室温孵育5 min。使用前轻轻摇匀Lipofectamine 2000，取5 μL Lipofectamine 2000，用250 μL Opti-MEM无血清培养基稀释，室温孵育5 min。将稀释的程序性细胞死亡受体1 siRNA或siRNA NC与Lipofectamine 2000混合(总体积500 μL)，轻轻混匀，室温放置20 min。在每孔细胞中加入500 μL转染液和1 500 μL Opti-MEM培养基，轻轻摇匀，置于37 ℃ CO2培养箱中培养。转染6 h后，更换为骨髓间充质干细胞完全培养基。转染48 h后，采用qRT-PCR法检测正常对照组、PD-1沉默空载组及PD-1沉默组程序性细胞死亡受体1 mRNA表达，筛选程序性细胞死亡受体1沉默效果最明显的siRNA进行转染。
茜素红染色：成骨诱导21 d后，倒去培养基，

用PBS清洗3次，每次5 min。用40 g/L多聚甲醛固定15 min，用PBS清洗3次，每次5 min。0.1%茜素红S染液染色10 min，用PBS清洗。将玻片取出晾干，二甲苯透明5 min，中性树胶封固，置于倒置显微镜下观察。采用Image Pro Plus 6.0计算累积吸光度值。

qRT-PCR检测：成骨诱导21 d后，采用qRT-PCR检测程序性细胞死亡受体1、RUNX2 mRNA表达，检测方法同上。引物序列设计见表1。
Western blot检测：成骨诱导21 d后，裂解细胞，4 ℃条件下12 000 r/min离心5 min，收集上清，BCA定量后检测蛋白表达。配置5%浓缩胶和10%分离胶，依次进行样本变性加样、电泳和转膜，将膜装入5% TBST封闭液，置于室温摇床中2 h；加一抗(p-GSK3β 1∶500稀释，Axin2、β-catenin 和GSK3β 1∶1 000稀释，GAPDH 1∶10 000稀释)4 ℃孵育过夜；加HRP标记的上样抗兔二抗(1∶10 000稀释)置于摇床上孵育2 h，显色，在暗室中压片曝光显影。使用AlphaEaseFC软件处理系统分析目标带的吸光度值。
1.5 主要观察指标对照组与模型组大鼠股骨组织中程序性细胞死亡受体1、程序性细胞死亡配体1 mNRA表达；各组大鼠骨髓间充质干细胞中程序性细胞死亡受体1与RUNX2 mRNA表达、茜素红染色以及p-GSK3β、β-catenin、GSK3β、Axin2蛋白表达。
1.6 统计学分析实验数据利用SPSS 25.0软件进行分析，计量资料组间比较进行单因素方差分析，采用LSD法进行两两比较，检验水准α=0.05。该文统计学方法已经由新疆医科大学附属中医医院生物统计学专家审核。

讨论

1型糖尿病相关骨质流失的主要机制特征是骨形成受损，而不是骨吸收增强，这主要是由于1型糖尿病相关的慢性高血糖干扰了骨髓间充质干细胞的功能[18-19]。骨髓间充质干细胞的成骨分化对骨骼生长和重塑至关重要[20]。此外，骨髓间充质干细胞因易于获取、具有成骨潜能和免疫调节功能被认为是治疗骨缺损的理想细胞[21-22]。因此，揭示高糖条件下骨髓间充质干细胞成骨抑制的机制对糖尿病骨质疏松的治疗具有重要意义。
此次实验结果显示，高脂饲料喂养8周后，模型组大鼠体质量降低、血糖升高，股骨骨小梁减少、紊乱、骨皮质变薄，股骨密度、骨体积分数、骨小梁数与骨小梁厚度降低，骨小梁分离度升高，表明成功建立了1型糖尿病骨质疏松模型，这与SUN等[17]研究报道一致。进一步的检测结果显示，1型糖尿病骨质疏松模型大鼠骨组织中的程序性细胞死亡受体1和程序性细胞死亡配体1 mRNA表达升高。已知程序性细胞死亡受体1和程序性细胞死亡配体1在维持免疫稳态、调节T细胞活化以及免疫介导的器官损伤中起着关键作用，而免疫系统和骨骼系统之间存在复杂的相互作用，免疫微环境在骨组织愈合、修复和再生中起着至关重要的作用，它决定了骨组织的再生能力[23-24]。已有研究报道，T细胞可以介导甲状旁腺激素的合成代谢作用，刺激骨形成，触发成骨细胞分泌白细胞介素6、白细胞介素6受体等促造血因子[25]，而程序性细胞死亡受体1抑制T细胞的增殖和功能[26]。因此，程序性细胞死亡受体1和程序性细胞死亡配体1激活后会抑制T细胞的活性，进而抑制骨形成。已有研究表明，过表达程序性细胞死亡受体1通过激活SHP2信号和抑制核因子κB通路抑制人根尖乳头干细胞的成骨和牙生成[27]。因此，1型糖尿病可能会通过上调程序性细胞死亡受体1表达而抑制成骨分化，导致1型糖尿病骨质疏松的发生。
为了探讨程序性细胞死亡受体1在糖尿病性骨质疏松中的调控作用，以大鼠骨髓间充质干细胞为研究对象，建立高糖条件细胞培养模型，沉默程序性细胞死亡受体1表达后观察大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化变化。已有报道表明，高糖条件促进骨髓间充质干细胞的成脂分化而抑制其成骨分化[28-30]。此次实验结果显示，高糖条件下大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力降低，与已有文献报道一致；同时高糖条件下大鼠骨髓间充质干细胞中程序性细胞死亡受体1的表达升高，这与动物实验结果一致。沉默程序性细胞死亡受体1表达可以有效促进高糖条件下大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化，表明程序性细胞死亡受体1低表达有利于大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化。
骨髓间充质干细胞可以分化为脂肪细胞和成骨细胞，这取决于主要的信号分子[31-32]。高糖条件可诱导多种信号分子表达水平的改变，通过信号转导、基因表达及免疫调节等方式影响骨髓间充质干细胞的成骨分化[33-35]。既往研究表明，Wnt信号通路对骨代谢稳态和骨骼发育的调节至关重要[36-37]，在骨髓间充质干细胞成骨分化中起核心调节作用。已有研究表明，高糖条件可以通过激活GSK-3β破坏β-catenin的稳定性，对骨髓间充质干细胞成骨分化产生负面影响[38]。抑制糖尿病骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞中GSK-3β活性可激活β-catenin，缓解高糖条件下对成骨细胞分化的抑制[39]。Axin2是Wnt信号通路的负反馈调节因子，高糖条件下Axin2高表达，抑制Wnt通路活性，影响成骨细胞分化[40]。为了进一步明确程序性细胞死亡受体1对高糖条件下大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的调控机制，检测了Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达，结果显示：高糖条件下大鼠骨髓间充质干细胞中p-GSK3β、β-catenin蛋白表达降低，GSK3β、Axin2蛋白表达升高；沉默程序性细胞死亡受体1后，高糖条件下大鼠骨髓间充质干细胞中p-GSK3β、β-catenin蛋白表达升高，GSK3β、Axin2蛋白表达降低，表明高糖条件抑制了Wnt/β-catenin信号通路的活性，沉默程序性细胞死亡受体1表达可激活该信号通路，改善高糖状态对大鼠骨髓间充质干细胞成骨细胞分化的抑制。
综上所述，此次实验发现程序性细胞死亡受体1在1型糖尿病骨质疏松大鼠股骨中及高糖环境下大鼠骨髓间充质干细胞中表达，沉默程序性细胞死亡受体1可通过激活 Wnt/β-catenin信号通路促进高糖条件下大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化，为糖尿病性骨质疏松进展的分子机制提供了新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

程序性细胞死亡受体1影响高糖条件下成骨细胞分化的机制

Mechanism by which programmed cell death protein 1 influences osteoblast differentiation under high-glucose conditions

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