黄芪甲苷可缓解MC3T3-E1细胞氧化应激损伤并促进成骨

doi:10.12307/2025.706

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (17): 3529-3536.doi: 10.12307/2025.706

• 骨组织构建 bone tissue construction • 上一篇下一篇

黄芪甲苷可缓解MC3T3-E1细胞氧化应激损伤并促进成骨

张加豪1，李嘉程2，温明韬1，郭艳波1，2，骆帝2，李刚2

1山东中医药大学第一临床医学院，山东省济南市 250014；2山东中医药大学附属医院，山东省济南市 250014

收稿日期:2024-06-13 接受日期:2024-08-21 出版日期:2025-06-18 发布日期:2024-10-30
通讯作者: 李刚，博士，教授，主任医师，博士生导师，山东中医药大学附属医院，山东省济南市 250014
作者简介:张加豪，男，1998年生，山东省济南市人，山东中医药大学在读硕士，主要从事骨与关节疾病研究。
基金资助:
山东省重点研发计划(重大科技创新工程)项目(2021CXGC010501)，项目负责人：李刚；山东省自然科学基金项目(ZR2022LZY003)，项目负责人：李嘉程

Astragaloside IV alleviates oxidative stress injury and promotes osteogenesis in MC3T3-E1 cells

Zhang Jiahao1, Li Jiacheng2, Wen Mingtao1, Guo Yanbo1, 2, Luo Di2, Li Gang2

1The First Clinical Medical College of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China; 2The Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China

Received:2024-06-13 Accepted:2024-08-21 Online:2025-06-18 Published:2024-10-30
Contact: Li Gang, MD, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, The First Clinical Medical College of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
About author:Zhang Jiahao, Master candidate, The First Clinical Medical College of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
Supported by:
Research and Development Program (Major Science and Technology Innovation Project) of Shandong Province, No. 2021CXGC010501 (to LG); Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2022LZY003 (to LJC)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
黄芪甲苷：是中药黄芪的主要活性成分之一，具有增强机体免疫功能、强心降压、降血糖、利尿、抗衰老、抗疲劳等作用。
细胞外信号调节激酶/腺苷酸激活蛋白激酶信号通路：细胞外信号调节激酶作为丝裂原活化蛋白激酶通路家族的一员，在细胞增殖、分化等方面发挥重要作用。腺苷酸激活蛋白激酶是生物能量代谢调节的关键分子，是研究糖尿病及其他代谢相关疾病的核心，它表达于各种代谢相关的器官中，能被机体各种刺激激活，包括细胞压力、运动和很多激素及能影响细胞代谢的物质。

背景：氧化应激是导致骨质疏松症的主要原因之一，减少氧化应激水平与增加抗氧化防御是治疗骨质疏松症的重要研究方向。研究证实黄芪甲苷具有抗骨质疏松作用，但其作用机制尚不明确。
目的：探讨黄芪甲苷对氧化应激条件下MC3T3-E1细胞成骨的作用。
方法：将MC3T3-E1细胞分4组培养：对照组加入完全培养基，模型组加入含过氧化氢的完全培养基干预24 h后更换为完全培养基，黄芪甲苷组加入含过氧化氢、黄芪甲苷的完全培养基干预24 h后更换为含黄芪甲苷的完全培养基，抑制剂组加入含过氧化氢、黄芪甲苷、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)抑制剂的完全培养基干预24 h后更换为含黄芪甲苷、ERK抑制剂的完全培养基。过氧化氢干预48 h后，通过丙二醛含量检测黄芪甲苷对MC3T3-E1细胞氧化应激的缓解作用；过氧化氢干预48 h后进行成骨诱导培养，通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色验证MC3T3-E1细胞成骨及矿化能力，通过RT-qPCR检测成骨相关基因的表达，Western blot检测成骨相关蛋白及ERK/腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)信号通路蛋白的表达。
结果与结论：①模型组细胞内碱性磷酸酶含量与矿化结节形成均少于对照组(P < 0.05)，黄芪甲苷组细胞内碱性磷酸酶含量与矿化结节形成均多于模型组(P < 0.05)。②与对照组比较，模型组细胞内丙二醛含量增加(P < 0.05)，骨钙素、RUNX2、Ⅰ型胶原蛋白的mRNA与蛋白表达均降低(P < 0.05)，AMPK mRNA与p-AMPK蛋白表达升高(P < 0.05)；与模型组比较，黄芪甲苷组细胞内丙二醛含量减少(P < 0.05)，骨钙素、RUNX2、Ⅰ型胶原蛋白的mRNA与蛋白表达均升高(P < 0.05)，ERK1/2、AMPK mRNA表达升高(P < 0.05)，p-AMPK、p-ERK1/2蛋白表达均升高(P < 0.05)；ERK抑制剂可部分抑制黄芪甲苷的上述作用。③结果表明，黄芪甲苷可通过激活ERK/AMPK信号通路促进氧化应激条件下MC3T3-E1细胞的成骨分化。
https://orcid.org/0009-0006-0208-7316(张加豪)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 黄芪甲苷, 骨质疏松症, MC3T3-E1细胞, 氧化应激, ERK/AMPK信号通路, 成骨, 工程化骨材料

Abstract: BACKGROUND: Oxidative stress is one of the main causes of osteoporosis, and reducing the level of oxidative stress with increasing antioxidant defense is an important research direction for the treatment of osteoporosis. Studies have confirmed that astragaloside IV has anti-osteoporosis effects, but its mechanism of action is not clear.
OBJECTIVE: To investigate the osteogenic effect of astragaloside IV in MC3T3-E1 cells under oxidative stress conditions.
METHODS: MC3T3-E1 cells were randomly divided into four groups: the control group was cultured in a complete medium; the model group was cultured in the complete medium containing hydrogen peroxide which was replaced with another complete medium after 24 hours of intervention; the astragaloside IV group was cultured with the complete medium containing hydrogen peroxide and astragaloside IV which was replaced with another complete medium containing astragaloside IV after 24 hours of intervention; and the inhibitor group was cultured in the complete medium containing hydrogen peroxide, astragaloside IV, and extracellular signal-regulated kinases (ERK) inhibitor which was replaced with complete medium containing hydrogen peroxide, astragaloside IV, and ERK inhibitor after 24 hours of intervention. After 48 hours of intervention with hydrogen peroxide, malondialdehyde content was detected to evaluate the mitigating effect of astragaloside IV on the oxidative stress in MC3T3-E1 cells. Osteogenic induction was performed after 48 hours of intervention with hydrogen peroxide, and the osteogenic and mineralizing ability of MC3T3-E1 cells was verified by alkaline phosphatase staining and alizarin red staining; the expression of osteogenesis-related genes was detected by RT-qPCR; and the expression of osteogenesis-related proteins and ERK/AMP-activated protein kinase (AMPK) signaling pathway proteins was detected by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: The intracellular alkaline phosphatase content and mineralized nodule formation were less in the model group than in the control group (P < 0.05), and were more in the astragaloside IV group than in the model group (P < 0.05). Compared with the control group, intracellular malondialdehyde content increased in the model group (P < 0.05), mRNA and protein expression of osteocalcin, RUNX2, and type I collagen decreased (P < 0.05), and AMPK mRNA and p-AMPK protein expressions were elevated (P < 0.05); compared with the model group, intracellular malondialdehyde content in the astragaloside IV group decreased (P < 0.05), the mRNA and protein expressions of osteocalcin, RUNX2, and type I collagen were elevated (P < 0.05), the mRNA expressions of ERK1/2 and AMPK were elevated (P < 0.05), and the protein expressions of p-AMPK and p-ERK1/2 were elevated (P < 0.05). Additionally, ERK inhibitors partially inhibited the above effects of astragaloside IV. To conclude, astragaloside IV can promote osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells by activating the ERK/AMPK pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: astragaloside IV, osteoporosis, MC3T3-E1 cells, oxidative stress, ERK/AMPK signaling pathway, osteogenesis, engineered bone materials

中图分类号:

张加豪, 李嘉程, 温明韬, 郭艳波, 骆帝, 李刚. 黄芪甲苷可缓解MC3T3-E1细胞氧化应激损伤并促进成骨[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(17): 3529-3536.

Zhang Jiahao, Li Jiacheng, Wen Mingtao, Guo Yanbo, Luo Di, Li Gang. Astragaloside IV alleviates oxidative stress injury and promotes osteogenesis in MC3T3-E1 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(17): 3529-3536.

图/表（结果） 6

2.1 不同浓度过氧化氢对MC3T3-E1细胞增殖活力的影响干预12 h后，0.4，0.6 mmol/L过氧化氢组细胞增殖率低于对照组；干预24 h后，0.1，0.2，0.4，0.6 mmol/L过氧化氢组细胞增殖率均低于对照组；干预48 h后，0.2，0.4，0.6 mmol/L过氧化氢组细胞增殖率均低于对照组，并且各组干预24 h的细胞增殖率较低，见图1A。后续实验选择0.2 mmol/L过氧化氢干预24 h作为氧化应激造模条件。
2.2 不同浓度黄芪甲苷组对MC3T3-E1细胞增殖活力的影响干预24 h后，25，50，100 μmol/L黄芪甲苷组细胞增殖率均高于对照组，200 μmol/L黄芪甲苷组细胞增殖率低于对照组；干预48 h后，25，50，100 μmol/L黄芪甲苷组细胞增殖率较干预24 h后升高，并且均高于对照组，200 μmol/L黄芪甲苷组细胞增殖率低于对照组；干预72 h后，25，50，100 μmol/L黄芪甲苷组细胞增殖率较干预48 h后降低，但仍高于对照组，200 μmol/L黄芪甲苷组细胞增殖率低于对照组，见图1B。说明100 μmol/L以内的黄芪甲苷对MC3T3-E1细胞无毒性作用。
2.3 黄芪甲苷对氧化应激条件下MC3T3-E1细胞增殖活力的影响在加入过氧化氢基础上，干预24 h后，25，50，100，200 μmol/L黄芪甲苷提高了MC3T3-E1细胞增殖率；干预48 h后，25，50，100 μmol/L黄芪甲苷提高了MC3T3-E1细胞增殖率，而200 μmol/L黄芪甲苷降低了MC3T3-E1细胞增殖率；干预72 h后，25，50，100 μmol/L黄芪甲苷提高了MC3T3-E1细胞增殖率，而200 μmol/L黄芪甲苷降低了MC3T3-E1细胞增殖率，见图1C。并且可见过氧化氢+100 μmol/L黄芪甲苷组干预48 h的细胞增殖率最高。
综合2.2、2.3实验结果，在保证MC3T3-E1细胞足够活性的条件下，选择100 μmol/L黄芪甲苷干预48 h进行实验。
2.4 黄芪甲苷可增强氧化应激条件下MC3T3-E1细胞的成骨与矿化能力
2.4.1 丙二醛含量检测结果模型组细胞内丙二醛含量高于对照组、黄芪甲苷组，抑制剂组细胞内丙二醛含量高于黄芪甲苷组，见图2。
2.4.2 碱性磷酸酶染色与茜素红染色结果模型组碱性磷酸酶染色较对照组浅，黄芪甲苷组碱性磷酸酶染色较模型组加深，表明黄芪甲苷可促进氧化应激条件下MC3T3-E1细胞的成骨分化；定量分析结果显示，模型组碱性磷酸酶含量低于对照组、黄芪甲苷组(P < 0.001，P < 0.05)，见图3。茜素红染色及定量分析结果显示，模型组成骨矿化结节形成少于对照组、黄芪甲苷组(P < 0.001，P < 0.05)，见图3。表明黄芪甲苷能够促进过氧化氢诱导MC3T3-E1细胞的成骨分化与矿化能力。
2.4.3 RT-qPCR检测结果模型组骨钙素、RUNX2、Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达均低于对照组(P < 0.01，P < 0.001)，黄芪甲苷组骨钙素、RUNX2、Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达均高于模型组(P < 0.01，P < 0.001)，抑制剂组骨钙素、RUNX2、Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达均低于黄芪甲苷组(P < 0.01)，见图4。表明黄芪甲苷可以明显提高氧化应激条件下MC3T3-E1细胞成骨相关基因mRNA的表达，并且ERK抑制剂可部分拮抗黄芪甲苷的作用。
模型组AMPK mRNA表达高于对照组(P < 0.01)，黄芪甲苷组ERK1/2、AMPK mRNA表达均高于模型组(P < 0.001)，抑制剂组ERK1/2、AMPK mRNA表达均低于黄芪甲苷组(P < 0.001，P < 0.01)，见图5。
2.4.4 Western blot检测结果模型组骨钙素、RUNX2、Ⅰ型胶原蛋白的蛋白表达均低于对照组(P < 0.01，P < 0.001)，黄芪甲苷组骨钙素、RUNX2、Ⅰ型胶原蛋白的蛋白表达均高于模型组(P < 0.05，P < 0.01)，抑制剂组骨钙素、RUNX2、Ⅰ型胶原蛋白的蛋白表达均低于黄芪甲苷组(P < 0.05)，见图6。
各组ERK1/2蛋白表达无差异，模型组、黄芪甲苷组、抑制剂组AMPK蛋白表达高于对照组(P < 0.05)，黄芪甲苷组p-AMPK、p-ERK1/2蛋白表达高于模型组(P < 0.05，P < 0.001)，抑制剂组p-AMPK、p-ERK1/2蛋白表达低于黄芪甲苷组(P < 0.01)，见图7。

参考文献

[1] ENSRUD KE, CRANDALL CJ. Osteoporosis. Ann Intern Med. 2017;167(3): ITC17-ITC32.
[2] LANGDAHL BL. Overview of treatment approaches to osteoporosis. Br J Pharmacol. 2021;178(9):1891-1906.
[3] 中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会.原发性骨质疏松症诊疗指南(2022)[J].中国全科医学,2023,26(14):1671-1691.
[4] KIMBALL JS, JOHNSON JP, CARLSON DA. Oxidative Stress and Osteoporosis. J Bone Joint Surg. 2021;103(15):1451-1461.
[5] ZHANG C, LI H, LI J, et al. Oxidative stress: A common pathological state in a high-risk population for osteoporosis. Biomed Pharmacother. 2023; 163:114834.
[6] RIEGGER J, SCHOPPA A, RUTHS L, et al. Oxidative stress as a key modulator of cell fate decision in osteoarthritis and osteoporosis: a narrative review. Cell Mol Biol Lett. 2023;28(1): 76.
[7] 曹志威,武晓蓉,邵国,等.MC3T3-E1细胞成骨模型的应用及研究进展[J].生物骨科材料与临床研究,2023,20(5):86-89,93.
[8] 蒋微,蒋式骊,刘平.黄芪甲苷的药理作用研究进展[J].中华中医药学刊,2019,37(9):2121-2124.
[9] 王嵩,黄思捷,郤庆.含黄芪中药复方制剂中黄芪甲苷含量测定的研究进展[J].上海医药,2021,42(5): 64-68.
[10] SUN NY, LIU XL, GAO J, et al. Astragaloside-IV modulates NGF-induced osteoblast differentiation via the GSK3β/β-catenin signalling pathway. Mol Med Rep. 2021;23(1):19.
[11] WANG F, QIAN H, KONG L, et al. Accelerated Bone Regeneration by Astragaloside IV through Stimulating the Coupling of Osteogenesis and Angiogenesis. Int J Biol Sci. 2021;17(7):1821-1836.
[12] SUGIURA R, SATOH R, TAKASAKI T. ERK: A Double-Edged Sword in Cancer. ERK-Dependent Apoptosis as a Potential Therapeutic Strategy for Cancer. Cells. 2021;10(10):2509.
[13] KIM JM, YANG YS, PARK KH, et al. The ERK MAPK Pathway Is Essential for Skeletal Development and Homeostasis. Int J Mol Sci. 2019;20(8):1803.
[14] LIU X, ZHANG J, WANG S, et al. Astragaloside IV attenuates the H2O2-induced apoptosis of neuronal cells by inhibiting α-synuclein expression via the p38 MAPK pathway. Int J Mol Med. 2017;40(6):1772-1780.
[15] LIU Y, CHONG L, LI X, et al. Astragaloside IV rescues MPP+-induced mitochondrial dysfunction through upregulation of methionine sulfoxide reductase A. Exp Ther Med. 2017;14(3):2650-2656.
[16] 刘海萌,付冠.黄芪甲苷增强骨髓间充质干细胞修复大鼠脑缺血再灌注损伤的实验研究[J].中国免疫学杂志,2020,36(11):1313-1317.
[17] JIN H, DU J, REN H, et al. Astragaloside IV protects against iron loading-induced abnormal differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). FEBS Open Bio. 2021;11(4):1223-1236.
[18] BLAKE JF, BURKARD M, CHAN J, et al. Discovery of (S)-1-(1-(4-Chloro-3-fluorophenyl)-2-hydroxyethyl)-4-(2-((1-methyl-1H-pyrazol-5-yl)amino)pyrimidin-4-yl)pyridin-2(1H)-one (GDC-0994), an Extracellular Signal-Regulated Kinase 1/2 (ERK1/2) Inhibitor in Early Clinical Development. J Med Chem. 2016;59(12):5650-5660.
[19] ROSKOSKI R. Targeting ERK1/2 protein-serine/threonine kinases in human cancers. Pharmacol Res. 2019;142:151-168.
[20] FILAIRE E, TOUMI H. Reactive oxygen species and exercise on bone metabolism: friend or enemy? Joint Bone Spine. 2012;79(4):341-346.
[21] YANG K, CAO F, QIU S, et al. Metformin Promotes Differentiation and Attenuates H2O2-Induced Oxidative Damage of Osteoblasts via the PI3K/AKT/Nrf2/HO-1 Pathway. Front Pharmacol. 2022;13:829830.
[22] ZHAO X, LIN S, LI H, et al. Myeloperoxidase Controls Bone Turnover by Suppressing Osteoclast Differentiation Through Modulating Reactive Oxygen Species Level. J Bone Miner Res. 2021;36(3):591-603.
[23] DOMAZETOVIC V, MARCUCCI G, FALSETTI I, et al. Blueberry Juice Antioxidants Protect Osteogenic Activity against Oxidative Stress and Improve Long-Term Activation of the Mineralization Process in Human Osteoblast-Like SaOS-2 Cells: Involvement of SIRT1. Antioxidants (Basel). 2020;9(2):125.
[24] AUSTERMANN K, BAECKER N, STEHLE P, et al. Putative Effects of Nutritive Polyphenols on Bone Metabolism In Vivo-Evidence from Human Studies. Nutrients. 2019;11(4):871.
[25] MARCUCCI G, DOMAZETOVIC V, NEDIANI C, et al. Oxidative Stress and Natural Antioxidants in Osteoporosis: Novel Preventive and Therapeutic Approaches. Antioxidants (Basel). 2023;12(2):373.
[26] FONTANI F, MARCUCCI G, IANTOMASI T, et al. Glutathione, N-acetylcysteine and lipoic acid down-regulate starvation-induced apoptosis, RANKL/OPG ratio and sclerostin in osteocytes: involvement of JNK and ERK1/2 signalling. Calcif Tissue Int. 2015;96(4):335-346.
[27] LEÓN-REYES G, ARGOTY-PANTOJA AD, BECERRA-CERVERA A, et al. Oxidative-Stress-Related Genes in Osteoporosis: A Systematic Review. Antioxidants (Basel). 2023;12(4):915.
[28] LIU Y, YU X, HUANG A, et al. INTS7-ABCD3 Interaction Stimulates the Proliferation and Osteoblastic Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells by Suppressing Oxidative Stress. Front. Physiol. 2021;12:758607.
[29] SHEN Y, WANG H, XIE H, et al. l-arginine promotes angio-osteogenesis to enhance oxidative stress-inhibited bone formation by ameliorating mitophagy. J Orthop Translat. 2024;46:53-64.
[30] 梁伟乔,钟诚,李宇明.骨质疏松症的中医病因病机认识与治疗进展[J].中国骨质疏松杂志,2020, 26(1):135-139.
[31] 闵甦,关永林,周广超,等.基于气血理论探讨补气补血中药防治骨质疏松症的研究进展[J].中医临床研究,2021,13(9):118-121,139.
[32] 刘路,李凯,胡阳,等.黄芪有效成分抗骨质疏松症作用机制的研究进展[J].中草药,2023,54(4): 1321-1328.
[33] ZOU Y, LI S, CHEN T, et al. Astragaloside IV ameliorates peripheral immunosuppression induced by cerebral ischemia through inhibiting HPA axis. Int Immunopharmacol. 2022;105:108569.
[34] YANG K, XIE Q, TANG T, et al. Astragaloside IV as a novel CXCR4 antagonist alleviates osteoarthritis in the knee of monosodium iodoacetate-induced rats. Phytomedicine. 2023;108:154506.
[35] ZHUANG Z, WANG ZH, DENG LH, et al. Astragaloside IV Exerts Cardioprotection in Animal Models of Viral Myocarditis: A Preclinical Systematic Review and Meta-Analysis. Front Pharmacol. 2019;10:1388.
[36] CAI B, ZHANG AG, ZHANG X, et al. Promoting Effects on Proliferation and Chondrogenic Differentiation of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells by Four “Kidney-Tonifying” Traditional Chinese Herbs. Biomed Res Int. 2015;2015:792161.
[37] ESSAWY AE, ABD ELKADER HAE, KHAMISS OA, et al. Therapeutic effects of astragaloside IV and Astragalus spinosus saponins against bisphenol A-induced neurotoxicity and DNA damage in rats. PeerJ. 2021;9:e11930.
[38] 邵帅,鲁美丽,高秀秋,等.黄芪甲苷对脂多糖诱导的巨噬细胞炎症反应及核因子κB受体活化因子配体/骨保护素系统表达的影响[J].中国医科大学学报,2022,51(4):294-300.
[39] 成鹏,白银亮,胡彩莉,等.黄芪甲苷通过调控FoxO3a/Wnt2/β-catenin通路抑制去卵巢大鼠骨质疏松的作用[J].中国实验方剂学杂志,2018,24(15):161-166.
[40] ROSKOSKI R. ERK1/2 MAP kinases: structure, function, and regulation. Pharmacol Res. 2012;66(2):105-143.
[41] LEE DW, KIM KM, PARK S, et al. Eucalyptol induces osteoblast differentiation through ERK phosphorylation in vitro and in vivo. J Mol Med. 2023;101(9): 1083-1095.
[42] YUH D Y, MAEKAWA T, LI X, et al. The secreted protein DEL-1 activates a β3 integrin-FAK-ERK1/2-RUNX2 pathway and promotes osteogenic differentiation and bone regeneration. J Biol Chem. 2020;295(21):7261-7273.
[43] CHUNXIA R, XINQING H, LU W, et al. Metformin Carbon Dots for Promoting Periodontal Bone Regeneration via Activation of ERK/AMPK Pathway. Adv Healthcare Mater. 2021;10(12):e2100196.
[44] YUE H, LENG Z, BO Y, et al. Novel Peptides from Sea Cucumber Intestinal Enzyme Hydrolysates Promote Osteogenic Differentiation of Bone Mesenchymal Stem Cells via Phosphorylation of PPARγ at Serine 112. Mol Nutr Food Res. 2023;67(9):e2200451.

引言

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨质变薄、骨骼脆弱易骨折为特征的常见慢性代谢性骨病[1]。随着全球人口老龄化趋势的加剧，骨质疏松症的发病率也逐年增加[2-3]。虽然目前临床已有许多治疗骨质疏松症的药物，但大多集中于防止骨量丢失，对于促进成骨增殖分化来增加骨量的药物开发甚少[2]。因此，寻找新的针对性药物成为当前研究的迫切需求。
氧化应激是导致骨质疏松症的主要原因之一，其可以通过骨代谢途径影响骨密度[4]。氧化应激诱导破骨细胞过度增殖分化，同时减少骨祖细胞向成骨细胞分化，导致骨形成与骨丢失之间的动态平衡被打破[5-6]。降低氧化应激水平与增强抗氧化防御是治疗骨质疏松症的重要研究方向。成骨细胞的数量和活性决定了骨的形成和发育，提高成骨细胞活性与分化能力能够预防或缓解骨质疏松症状。MC3T3-E1细胞作为成骨前体细胞在生物学功能上与原代培养的成骨细胞接近，并且具有较强的增殖与成骨矿化能力[7]，可用于研究成骨分化的整个过程。
黄芪甲苷是中药黄芪的主要活性成分之一[8-9]，具有促进细胞增殖和成骨样细胞分化的作用[10-11]。细胞外信号调节激酶/腺苷酸激活蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinases/AMP-activated protein kinase，ERK/AMPK)信号通路在细胞增殖、分化、衰老等方面发挥重要作用[12-13]，可在细胞处于能量不足或氧化应激状态时被激活，调节细胞的代谢和生存[14-15]。黄芪甲苷可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[16-17]，但黄芪甲苷对MC3T3-E1细胞成骨分化及ERK/AMPK信号通路的作用仍在探索阶段。此次实验利用过氧化氢体外诱导MC3T3-E1细胞氧化应激模型，探索黄芪甲苷对氧化应激状态下MC3T3-E1细胞成骨的作用及可能的机制，为靶向治疗骨质疏松症提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学和分子生物学实验，数据两两比较采用t检验，多组间比较采用ANOVA-One Way检验。
1.2 时间及地点实验于2023年9月至2024年5月在山东省药学科学院博士后工作站实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞 MC3T3-E1细胞(CL-0378，武汉普诺赛生命科技有限公司，中国)，后续实验所用细胞均为生长状态良好的5-10代细胞。细胞在培养过程中呈成纤维状贴壁生长，形态稳定，具有良好的成骨分化潜力。
1.3.2 实验药品和试剂黄芪甲苷(S30401，源叶，中国)；体积分数3%过氧化氢溶液(Sigma，美国)；ERK抑制剂(Ravoxertinib，Rav，MCE，美国)；二甲基亚砜(D8371，Solarbio，中国)；胎牛血清(FSP500，Excell，中国)；α-MEM 基础培养基(C12571500BT，Gibco，美国)；PBS(BL302A，Biosharp，中国)；胰蛋白酶(ES0014，奕杉生物，中国)；青-链霉素(KGY0023，南京凯基，中国)；CCK-8试剂盒(GK10001，Glpbio，中国)；MC3T3-E1细胞成骨诱导分化试剂盒(MUXMT-90021，赛业，中国)；碱性磷酸酶染色试剂盒(G1480，Solarbio，中国)；成骨细胞矿化结节染色试剂盒、BCA试剂盒、RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟、磷酸酶抑制剂、一抗稀释液、二抗稀释液(C0148S，P0012S，P0013B，ST2573，P1045，P0256，P0258，Beyotime，中国)；SPARKeasy 组织/细胞RNA快速提取试剂盒、SPARK
script Ⅱ RT Plus Kit(AC0202，AG0305，Spark Jade，中国)，PCR 引物(生工，中国 )；PVDF膜(C3117，Millipore，美国)；无血清蛋白封闭液、SDS-PAGE 凝胶快速配制试剂盒(PS108，PG112，雅酶，中国)；骨钙素、RUNX2、Ⅰ型胶原、ERK1/2、AMPK、p-ERK1/2、p-AMPK、β-actin抗体(A20800，A11753，A22090，A4782，A1229，AP0974，AP1002，AC026，ABColnal，中国)；辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体(ZB2301，中杉金桥，中国)。
1.3.3 主要仪器 Heracell 240i细胞恒温培养箱(Thermo Fisher，美国)；Sorvall Lynx 6000落地式高速低温离心机(Eppendorf，德国)；Sorvall ST1 Plus台式高速冷冻离心机(Thermo，美国)；Infinite M200PRO多功能酶标仪(TECAN，瑞士)；6325XQ601089梯度PCR仪(Eppendorf，德国)；QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪(Thermo，美国)；ProXima 280化学发光成像系统(Bio-Rad，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 MC3T3-E1细胞的培养复苏冻存的MC3T3-E1细胞，每个细胞培养皿内加入6 mL完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%青-链霉素的α-MEM培养基)，置于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中培养，每2 d换液1次。当细胞融合度达80%-90%且细胞贴壁生长状态良好时，使用PBS清洗，加入2 mL胰蛋白酶消化细胞2 min，加入4 mL完全培养基混合后收集细胞，1 000 r/min离心5 min后弃上清，重悬细胞沉淀后以1∶3进行传代。
1.4.2 构建氧化应激细胞模型将生长状态良好的MC3T3-E1细胞接种于96孔板中，细胞密度为5 000个/孔，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养 24 h。观察贴壁后弃去上层培养基，每孔分别加入含0(对照组)，0.1，0.2，0.4，0.6 mmol/L过氧化氢的完全培养基，同时设置空白组(仅加入完全培养基无细胞)。干预12，24，48 h后，每孔加入10 µL CCK-8溶液，放于培养箱中避光孵育1 h，使用酶标仪检测450 nm处的吸光度值，计算细胞增殖率。细胞增殖率=(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%。通过细胞增殖率筛选最佳的过氧化氢干预浓度。
1.4.3 黄芪甲苷对MC3T3-E1细胞的毒性测试将生长状态良好的MC3T3-E1细胞接种于96孔板中，细胞密度为5 000个/孔，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养 24 h。观察贴壁后弃去上层培养基，分别加入含0(对照组)，25，50，100，200 µmol/L黄芪甲苷的完全培养基，同时设置空白组(仅加入完全培养基无细胞)。干预24，48，72 h后，采用CCK-8法检测450 nm处的吸光度值，计算细胞增殖率。
1.4.4 黄芪甲苷对氧化应激条件下MC3T3-E1细胞的最佳干预时间及浓度将生长状态良好的MC3T3-E1细胞接种于96孔板中，细胞密度为5 000个/孔，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养 24 h。观察细胞贴壁后弃去上层培养基，对照组加入完全培养基，模型组加入含0.2 mmol/L过氧化氢的完全培养基24 h后更换为完全培养基，各实验组加入含0.2 mmol/L过氧化氢与不同浓度(0，25，50，100，200 µmol/L)黄芪甲苷的完全培养基24 h后更换为含对应浓度黄芪甲苷的完全培养基。过氧化氢干预24，48，72 h后，采用CCK-8法检测450 nm处的吸光度值，计算细胞增殖率。通过细胞增殖率筛选黄芪甲苷最佳干预时间及浓度。
1.4.5 黄芪甲苷对氧化应激条件下MC3T3-E1细胞成骨分化的影响
实验分组：将生长状态良好的MC3T3-E1细胞接种于孔板中，待细胞贴壁后弃去培养基，分4组培养：对照组加入完全培养基，模型组加入含0.2 mmol/L过氧化氢的完全培养基24 h后更换为完全培养基，黄芪甲苷组加入含0.2 mmol/L过氧化氢、100 µmol/L黄芪甲苷的完全培养基24 h后更换为含100 µmol/L黄芪甲苷的完全培养基，抑制剂组加入含0.2 mmol/L过氧化氢、100 µmol/L黄芪甲苷、6.1 nmol/L ERK抑制剂的完全培养基24 h后更换为含100 µmol/L黄芪甲苷、6.1 nmol/L ERK抑制剂的的完全培养基[18-19]。
丙二醛含量检测：将生长状态良好的MC3T3-E1细胞接种于6孔板中，细胞密度为1×105个/cm2，待细胞贴壁后弃去培养基，按照实验分组干预。过氧化氢干预48 h后，使用RIPA裂解液对对照组、模型组、黄芪甲苷组、抑制剂组细胞进行裂解，收集裂解液于EP管中，将标准品按照浓度梯度配制完成后，将空白对照组、标准品及实验样品各100 µL加入EP管中，再加入200 µL丙二醛检测工作液，沸水浴加热15 min，待样品冷却至室温后1 000×g离心10 min，取200 µL上清加入96孔板中，使用酶标仪在532 nm处测定吸光度值。将对照组的结果定量化为1，计算其他组与对照组的比值。
碱性磷酸酶染色：将生长状态良好的MC3T3-E1细胞接种于24孔板中，细胞密度为4×104/孔，待细胞贴壁后弃去培养基，按照实验分组干预。过氧化氢干预48 h后进行成骨诱导培养，每2 d换液1次。成骨诱导培养第7天，弃对照组、模型组、黄芪甲苷组培养基，用PBS清洗，使用预冷的碱性磷酸酶固定液固定20 min，用蒸馏水清洗；加入碱性磷酸酶孵育液37 ℃恒温孵育20 min，用蒸馏水再次清洗；加入核固红染色复染5 min，用蒸馏水清洗，置于显微镜下观察并拍照，使用Image J软件分析染色阳性区域，将对照组的结果定量化为1，计算其他组与对照组的比值。
茜素红染色：将生长状态良好的MC3T3-E1细胞接种于24孔板中，细胞密度为4×104/孔，待细胞贴壁后弃去培养基，按照实验分组干预。过氧化氢干预48 h后进行成骨诱导培养，每2 d换液1次。成骨诱导第21天，弃对照组、模型组、黄芪甲苷组培养基，用PBS清洗，加入40g/L多聚甲醛固定15 min；用PBS清洗3次，加入茜素红染色液室温孵育30 min；用PBS清洗掉多余染液，置于显微镜下观察并拍照，使用Image J软件分析染色阳性区域，将对照组的结果定量化为1，计算其他组与对照组的比值。
RT-qPCR检测：将生长状态良好的MC3T3-E1细胞接种于6孔板中，细胞密度为1×105个/cm2，待细胞贴壁后弃去培养基，按照实验分组干预。过氧化氢干预48 h后，使用SPARKeasy Improved Tissue/Cell RNA Kit提取对照组、模型组、黄芪甲苷组、抑制剂组细胞总RNA并检测浓度，将各组RNA浓度统一后使用SPARKscript Ⅱ RT Plus Kit将RNA反转录为cDNA，使用 SPARK SYBR Green qRT-PCR试剂盒处理cDNA 并进行实时荧光定量PCR检测，反应条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性 5 s，60 ℃退火30 s，共 40 次循环。以 β-actin 为内参，以2-ΔΔCt 法统计分析。目的基因引物序列见表1。

Western Blot检测：将生长状态良好的MC3T3-E1细胞接种于6孔板中，细胞密度为1×105个/cm2，待细胞贴壁后弃去培养基，按照实验分组干预。过氧化氢干预48 h后，用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解对照组、模型组、黄芪甲苷组、抑制剂组细胞30 min，4 ℃下12 000×g离心10 min后取上清，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各组蛋白浓度并进行浓度归一化。将各组样品等量等体积加入SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白后，将蛋白转移至PVDF膜上，用无血清快速封闭液室温封闭20 min，用TBST清洗3次，每次10 min；用适当稀释度的一抗在 4 ℃下过夜孵育 PVDF膜，一抗主要包括骨钙素(稀释比1∶2 000)、RUNX2(稀释比1∶500)、Ⅰ型胶原蛋白(稀释比1∶4 000)、ERK1/2(稀释比1∶1 000)、AMPK(稀释比1∶2 000)、p-ERK1/2(稀释比1∶1 000)、p-AMPK(稀释比1∶2 000)，内参为β-actin(稀释比1∶100 000)，隔天回收一抗并标记使用次数，用TBST清洗PVDF膜3次，每次10 min；室温下用山羊抗兔二抗(稀释比1∶10 000)孵育1.5 h，用TBST 清洗3次，每次10 min，使用ECL化学发光法显影。使用Image J软件对各条带灰度值进行半定量分析，最终结果以目的蛋白与内参的灰度值比值表示。
1.5 主要观察指标各组MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶染色与茜素红染色结果、成骨相关基因的mRNA与蛋白表达以及ERK/AMPK信号通路蛋白表达。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 8软件处理实验数据。所有实验均重复3次，实验数据以x±s表示，两两比较采用t检验，多组间比较采用ANOVA-One Way检验。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过山东中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

骨质疏松症的发病机制为骨吸收与骨形成之间的平衡被打破，骨吸收多于骨形成，导致骨量减少、骨密度降低，最终造成骨质疏松。氧化应激在骨吸收与骨形成的动态平衡中起到重要作用[20-21]。正常情况下，成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收之间的平衡受到严格调控，这种氧化平衡状态主要受活性氧和抗氧化酶系统的调节[5]，当处于氧化应激状态时，体内活性氧水平升高而抗氧化酶的活性降低，从而影响骨祖细胞向成骨细胞分化的过程，同时活性氧还会提高核因子κB配体受体激活物水平[22]，
增加破骨细胞生成。体外研究表明，抗氧化剂通过维持骨细胞活性、激活成骨细胞分化与矿化过程来缓解或预防活性氧对骨组织产生的负面影响[23-24]。
氧化应激所产生的活性氧在骨重塑中起关键作用[25]，显著影响成骨细胞和破骨细胞的增殖、分化。在正常状态下，低活性氧水平能够刺激血管再生，在骨折愈合中起重要作用，在成骨分化过程中，活性氧可通过细胞外信号调节激酶和p38信号通路诱导细胞矿化[26]。然而，过量的活性氧会对成骨细胞的活性与成骨矿化产生负面影响，促进破骨细胞的分化，导致骨重塑过程发生异常[27]。另外，活性氧还可引起骨髓间充质干细胞成脂化，阻碍成骨细胞的成骨矿化[28]。线粒体是细胞内能量的主要来源，参与细胞的代谢和分化等生命过程。氧化应激损伤会影响线粒体功能，导致三磷酸腺苷合成受损、线粒体膜电位降低和钙稳态的改变，从而影响细胞的成骨分化过程，进而减弱成骨能力。有研究显示，缓解细胞氧化应激水平后线粒体功能得到恢复，从而促进了细胞的成骨分化[29]。
骨质疏松症在祖国医学中属于“骨痿”“骨蚀”等范畴，病因病机与肝脾肾三脏失调关系密切[30]。肾虚为本，脾虚为因，肝失疏泄为关键。中医理论认为：肾主骨生髓；肝主筋，主疏泄；脾主四肢，久病伤精耗气，气虚导致血运失调，血无力不行则血瘀，从而影响骨小梁的微循环，使得骨骼失养，最终发展为骨质疏松症[31]。《医林改错》中提到“治痿当益气活血”“气充则血行”，强调了补气的重要性。
黄芪作为“补气之圣药”，具有补气升阳、生津养血、行滞通痹等功效，常用来治疗表虚自汗、气血两虚、气虚血滞等证，在临床治疗中发挥温补脾气作用的同时还可兼顾补肾阳虚，达到治疗骨质疏松症的作用[32]。黄芪甲苷为羊毛酯醇形的四环三萜皂苷，是来源于中药黄芪的主要活性成分之一，对骨关节炎、病毒性心肌炎、脑缺血再灌注损伤等疾病模型具有良好的治疗效果[33-35]。黄芪甲苷已被证实具有促细胞增殖和保护造血功能等作用，在成骨方向的研究主要集中于缓解成骨细胞损伤及抗细胞凋亡作用，其对骨质疏松症的治疗效果也逐渐被揭示。
黄芪甲苷可通过转化生长因子β/Smad通路促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[36]，可通过激活蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β/β-连环蛋白信号通路增强血小板衍生生长因子诱导的血管生成，促进骨髓间充质干细胞的细胞活力、成骨分化和血管生成基因的表达[10]。在改善激素水平缓解骨质疏松症状方面，黄芪甲苷能够与雌激素受体相结合发挥雌激素样作用[37]。在炎性调控方面，黄芪甲苷能够通过核因子κB信号通路下调巨噬细胞中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α水平，并上调骨保护素水平，从而发挥调节骨代谢作用[38]。体内动物实验显示，黄芪甲苷可抑制FoxO3a蛋白表达、提高Wnt2、β-连环蛋白等水平，从而缓解去卵巢大鼠骨质疏松症状[39]。这些研究表明黄芪甲苷可促进成骨样细胞成骨分化，在治疗骨质疏松症方面具有积极作用。ERK作为MAPK信号通路家族的一员，在细胞增殖、分化等方面发挥重要作用[40]。LEE等[41]发现桉树醇可通过刺激ERK信号通路活化诱导MC3T3-E1细胞的成骨分化，促进新骨形成[42]。近年来，AMPK作为ERK的下游信号在促进骨形成和骨分化方面发挥着重要作用[43]。ERK/AMPK信号通路参与调控骨髓间充质干细胞成骨分化进程[44]，但该信号通路对MC3T3-E1细胞的调控作用仍未被揭示。此次实验结果证实，黄芪甲苷可通过缓解氧化应激水平促进MC3T3-E1细胞的成骨分化，该作用可能与激活ERK/AMPK信号通路有关。
综上所述，此次实验证实黄芪甲苷可缓解氧化应激损伤并促进MC3T3-E1细胞的成骨分化，并且成骨过程受到ERK/AMPK信号通路的参与调控。实验在细胞层面上验证了相关假设，但未来的研究应进一步扩展到体内实验，以全面了解黄芪甲苷的作用和潜在临床价值。此外，实验侧重于成骨相关指标的检测，对骨吸收和成脂分化等相关表型的研究仍未深入探索，未来的实验应在此基础上深入探讨其他表型的分子机制，通过体内实验验证黄芪甲苷在骨质疏松症动物模型中的具体作用机制，以期为骨质疏松症的治疗提供更为全面的科学依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

黄芪甲苷可缓解MC3T3-E1细胞氧化应激损伤并促进成骨

Astragaloside IV alleviates oxidative stress injury and promotes osteogenesis in MC3T3-E1 cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 6

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	韩海慧, 冉磊, 孟晓辉, 辛鹏飞, 向峥, 边艳琴, 施杞, 肖涟波. 靶向成纤维细胞生长因子受体1信号改善类风湿关节炎的骨破坏[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(9): 1905-1912.
[2]	赵济宇, 王少伟. 叉头框转录因子O1信号通路与骨代谢[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(9): 1923-1930.
[3]	朱汉民, 王松, 肖文琳, 张文静, 周茜, 何烨, 李微, . 线粒体自噬调控骨代谢[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1676-1683.
[4]	艾克帕尔·艾尔肯, 陈晓涛, 吾凡别克·巴合提. 成骨诱导人牙周膜干细胞来源外泌体促进炎症微环境下人牙周膜干细胞成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1388-1394.
[5]	章镇宇, 梁秋健, 杨军, 韦相宇, 蒋捷, 黄林科, 谭桢. 新橙皮苷治疗骨质疏松症的靶点及对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1437-1447.
[6]	孙玉婷, 吴家媛, 张剑. 影响牙髓干细胞成骨及成牙本质分化的相关物理因素及作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1531-1540.
[7]	贺光辉, 原杰, 柯燕琴, 丘小婷, 张晓玲. Hemin调控小鼠软骨细胞氧化应激的线粒体途径[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(6): 1183-1191.
[8]	黄小彬, 葛继荣, 李生强, 谢丽华, 黄景文, 何艳艳, 薛立鹏. 不同滋阴补肾法干预去势大鼠破骨通路的机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(6): 1214-1219.
[9]	何波, 陈文, 马岁录, 何志军, 宋渊, 李金鹏, 刘涛, 魏晓涛, 王威威, 谢婧. 皮瓣缺血再灌注损伤的发病机制及治疗进展[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(6): 1230-1238.
[10]	钱琨, 李子卿, 孙水. 内质网应激与常见退行性骨骼疾病的发生与发展[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(6): 1285-1295.
[11]	朗么磋, 张义林, 汪莉. miR-338-3p靶向核因子κB受体活化因子配体影响牙槽骨成骨细胞增殖及凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(5): 899-907.
[12]	逯冉冉, 周旭, 张利杰, 杨新玲. 富马酸二甲酯减轻帕金森病模型鼠神经损伤的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(5): 989-994.
[13]	肖放, 黄雷, 王琳. 磁性纳米材料与磁场效应加速骨损伤修复[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(4): 827-838.
[14]	李明哲, 叶翔凌, 王冰, 余翔. 负载纳米钽的液晶显示光固化聚乳酸支架制备及促成骨性能[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(4): 670-677.
[15]	赵增波, 李晨曦, 窦晨雷, 马娜, 周冠军. 壳聚糖/甘油磷酸钠/海藻酸钠/益母草碱水凝胶的抗炎与促成骨作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(4): 678-685.