1.1 设计 生物信息学分析结合动物实验验证，独立样本t检验。
1.2 时间及地点 于2023年5-9月在贵州医科大学附属医院临床研究中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 生物信息学数据库及数据分析工具 GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)、R软件(版本4.3.1)、Cytoscape软件(版本3.10.1)、String在线分析网站(https://cn.string-db.org/)及GraphPad Prism 9统计学软件。
1.3.2 实验动物 SPF级健康雄性8周龄SD大鼠12只，生产许可证：SCXK (粤)2022-0063，购自广东维通利华实验动物技术有限公司，饲养于贵州医科大学附属医院临床研究中心的 SPF 级动物房(大鼠饲养环境：室内温度为20-26 ℃；日温差≤4 ℃；相对湿度为40%-70%；换气次数为15-20
次/h；气流速度≤0.2 m/s；压强梯度为20-50 Pa；空气洁净度为7级；菌落数≤3个/皿；氨浓度≤14 mg/m3；噪声≤60 dB；最低工作照度≥200 lx；
动物照度：15-20 lx；昼夜明暗交替时间12/12 h)，实验开始前适应性喂养1周。该研究通过了贵州医科大学实验动物伦理委员会动物伦理审核，审批号：2100521，审批时间：2021-03-02。
1.3.3 实验试剂 液氮；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)；EDTA脱钙液(G1105，武汉塞维尔生物科技有限公司)；二甲苯(国药集团化学试剂有限公司)；通用型组织固定液(G1101，武汉塞维尔生物科技有限公司)；苏木精-伊红染色试剂盒(G1003，武汉塞维尔生物科技有限公司)；番红固绿(骨组织)染液套装(G1053，武汉塞维尔生物科技有限公司)；甲苯胺蓝染液(G1032，武汉塞维尔生物科技有限公司)；总RNA提取试剂盒(300111，北京宝日医生物技术有限公司)；反转录试剂盒(R233-01，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)；荧光定量试剂盒(Q511-01，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)；miRNA反转录/荧光定量检测试剂盒(PC6301，北京艾德莱公司)。
1.3.4 实验设备 小动物麻醉仪、脱水机(Donatello，意大利DIAPATH公司)；包埋机(JB-P5，武汉俊杰电子有限公司)；恒温摇床(ZHPW-250，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司)；组织摊片机(KD-P，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；冻台(JB-L5，武汉俊杰电子有限公司)；病理切片机(RM2016，上海徕卡仪器有限公司)；烤箱(GFL-230，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司)；正置光学显微镜(NIKON ECLIPSE E100，日本尼康公司)；普通PCR仪(Bio-Rad S1000，美国Bio-Rad公司)；冷冻离心机(Thermo ThermoCL-31R，美国赛默飞世尔科技公司)；荧光定量PCR仪(ABI Prism 7300，美国应用生物系统公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 筛选骨关节炎铁超载的关键基因 获取骨关节炎基因表达数据集：GEO数据库由美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)所管理和维护。这个数据库允许研究者访问全球研究社区收集的大规模表达数据，并进行数据的比对和分析。通过搜索关键词“osteoarthritis”在GEO数据库中得到一个名为GSE55235的骨关节炎基因芯片，其中包含了10例骨关节炎患者和10例健康人群的基因表达数据。为了确保筛选差异基因结果的显著性，使用R语言中的“limma”包，并且设定筛选条件为：差异表达基因的|logFC|≥1和P值≤0.05，进行差异表达基因的筛选。这将有助于识别出与骨关节炎相关的显著差异表达基因。
交集得到骨关节炎铁超载基因：GeneCards数据库是一个综合性数据库，包含了基因注释、预测和研究的多维度信息，由以色列的魏茨曼科学研究所(Weizmann Institute of Science)所创建。此数据库聚合和整合了来自约150个不同来源的基因中心数据，涵盖了基因组学、转录组学、蛋白质组学、遗传学、临床及功能信息等方面。以关键词“iron overload”在GeneCards数据库中进行检索，找到了与铁超载相关的基因。随后使用R软件的“VennDiagram”包进行交集分析，将铁超载相关基因和之前筛选出的骨关节炎差异表达基因进行交集。这一分析的目的在于找到同时在骨关节炎和铁超载中表达的基因，即骨关节炎铁超载相关基因。通过这一分析，将有助于揭示可能在骨关节炎和铁超载之间共享的分子机制和生物学过程。
GO与KEGG途径富集分析：富集分析是研究基因功能和生物过程的一种方法。常用的基因富集方法有GO和KEGG，它们可以帮助研究者们更好地理解基因的功能和生物过程的调节机制。在疾病研究中，富集方法能够阐述疾病分子层面的机制，帮助研究者们深入了解疾病的发生发展机理。使用R语言的clusterProfiler、DOSE和pathview包处理骨关节炎铁超载相关基因，富集出与骨关节炎铁超载相关的生物过程及通路。最后，对富集结果进行可视化。
构建骨关节炎铁超载基因 PPI 网络：为了研究骨关节炎铁超载相关基因之间的相互作用，使用String数据库进行蛋白质相互作用网络的构建。在构建过程中，设定综合得分≥0.4分作为筛选条件，用以鉴定骨关节炎铁超载关键基因。
筛选骨关节炎铁过载Hub基因：Cytoscape是一款用于网络分析和可视化的强大工具。拓扑分析是网络分析的一部分，可以帮助研究者们理解基因网络中的重要节点和模式。在Cytoscape中，可以使用CytoHubba插件提供的多种计算方法，包括Betweenness，BottleNeck，Closeness，Stress和Degree等。通过这些计算方法可以确定在基因网络中具有重要影响力的基因。采用这些方法筛选出两组排名前10的基因，并相互取交集，最终得到的Hub基因被认为是骨关节炎和铁超载的关键基因。
1.4.2 动物造模实验验证筛选出的Hub基因
骨关节炎SD大鼠造模：使用改良Hulth方法来建立膝骨关节炎大鼠模型[9]。选择12只雄性SD大鼠，随机分为对照组和骨关节炎组，每组6只。在适应性饲养了1周后，对骨关节炎组大鼠进行手术操作。手术步骤包括异氟烷吸入麻醉、剃除毛发、消毒、切开大鼠左膝关节髌骨内侧皮肤和关节囊，然后切断前交叉韧带并切除内侧半月板。为了确认前交叉韧带完全断裂，进行了“前抽屉实验”。而对照组大鼠则没有接受任何处理。通过该实验设计和操作过程，课题组能够模拟出膝骨关节炎的病理状态，并为后续研究奠定基础。随后，再经过8周的饲养后，取出大鼠左后肢完整的膝关节样本，分别进行病理学染色和PCR检测，以便后续进行相应的实验分析和数据处理。
大鼠膝关节的固定、脱钙及石蜡包埋切片：造模后8周，将SD大鼠异氟烷吸入麻醉后颈椎脱臼法处死，将取下的SD大鼠膝关节放入多聚甲醛溶液中固定48 h。随后，取出膝关节并修整多余的软组织。接下来，膝关节将被置于含有EDTA的脱钙液中，并通过放入恒温摇床进行脱钙处理。脱钙液将每隔两三天更换1次，保持温度在25-30 ℃，恒温摇床的速率调整在110-120 r/min。每隔2 d观察1次脱钙程度，如能够使用针扎进膝关节骨骼，则使用刀片沿矢状面将其剖开，以加快软化速度。软化好的膝关节组织经过流水冲洗后，在脱水吊篮中装入待处理组织，然后将其置于脱水机中，根据逐步增加的乙醇浓度进行脱水处理，依次使用以下乙醇浓度和时间：体积分数75%乙醇(2 h)、85%乙醇(2 h)、90%乙醇(1.5 h)、95%乙醇(2 h)、无水乙醇Ⅰ(2 h)、无水乙醇Ⅱ(2 h)、醇苯(40 min)、二甲苯Ⅰ(40 min)、二甲苯Ⅱ(40 min)、65 ℃熔化石蜡Ⅰ(0.5 h)、65 ℃熔化石蜡Ⅱ(1 h)、65 ℃熔化石蜡Ⅲ(2 h，45 min)。
然后，将膝关节组织从石蜡浸泡中取出，放入包埋机中进行包埋。首先，在包埋框中放入已熔化的石蜡，然后从脱水盒中取出组织，根据包埋表面的要求，将其放入包埋框中，并贴上相应的标签。完成后，将包埋好的石蜡块放入冷冻台中，冷却至-20 ℃，使石蜡凝固。然后取出石蜡块并进行修整。将修整好的石蜡块放入石蜡切片机中，并进行切割，以获得厚度为4 μm的切片。随后将这些切片浸泡在40 ℃温水中，以展平组织，并用玻片将组织抬起，以确保切片的平整和完整性。然后，将切片放入60 ℃的烘箱中，进行加热固化处理，以使切片固化并保持稳定。最后取出经过烤干处理的切片，并在常温下保存，以备后续的实验使用。
苏木精-伊红染色：首先，按照顺序将切片放入环保型脱蜡液Ⅰ中浸泡20 min，然后移入环保型脱蜡液Ⅱ中浸泡20 min。接下来，依次将切片放入无水乙醇Ⅰ 5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min和体积分数75%的乙醇溶55 min中浸泡，然后用自来水洗，以去除切片中的蜡质和其他杂质。接着，将切片放入苏木素染液中染色3-
5 min，随后进行自来水洗、分化处理，并使用返蓝液进行返蓝。然后，将切片放入体积分数85%和95%梯度乙醇中各5 min进行脱水处理，接着放入伊红染液中染色。最后，将切片放入无水乙醇Ⅰ5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min、无水乙醇Ⅲ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min和二甲苯Ⅱ 5 min透明化处理，最终使用中性树脂进行封固。完成上述步骤后，将进行显微镜观察，并采集和分析图像。
番红O-固绿染色：按照次序，先将切片放入环保型脱蜡透明液Ⅰ中浸泡20 min，接着放入环保型脱蜡透明液Ⅱ中再浸泡20 min。然后将切片依次放入无水乙醇Ⅰ中浸泡5 min，接着放入无水乙醇Ⅱ中浸泡5 min，最后放入体积分数75%乙醇浸泡5 min，然后进行自来水洗。接下来，将切片放入骨组织固绿染色液中，染色时间为1-5 min，去除多余染液后，直至软骨呈无色。将切片浸泡在1%盐酸乙醇中10 s，之后用自来水稍微洗涤。然后，将切片快速浸入骨组织番红染色液中1-5 s，按顺序将其置于四缸无水乙醇中进行迅速脱水，各持续5 s，2 s，10 s，最后在第4个缸进行镜检。切片经干净的二甲苯透明处理5 min后，使用中性树脂进行封片。完成上述步骤后，将进行显微镜镜检，采集和分析图像。
甲苯胺蓝染色：首先，按顺序将切片放入环保型脱蜡透明液Ⅰ(20 min)、环保型脱蜡透明液Ⅱ(20 min)、无水乙醇Ⅰ(5 min)、无水乙醇Ⅱ(5 min)和体积分数75%乙醇(5 min)，然后进行自来水洗。接着，将切片放入染液中浸泡5 min，然后进行水洗。若染色过深，在显微镜下控制染色程度后使用体积分数95%乙醇进行分化，接着使用无水乙醇和二甲苯进行快速脱水并透明化。最后，将切片放入干净的二甲苯中透明化5 min，再使用中性树脂进行封固。完成上述步骤后，将进行显微镜镜检，并采集和分析图像。
OARSI评分：使用国际骨关节炎研究学会(OARSI)的“软骨病理评价系统”，对每只大鼠膝关节的病理切片进行评价[10]。评分标准：软骨基质着色程度(-6分)、潮线是否完整(-1分)、关节软骨结构变形程度(-8分)、软骨细胞分布及数量(-3分)、及有无骨赘形成(-3分)，按此6项评估出各项得分后，相加得到总分，总分越高提示骨关节炎进展程度越重。
实时荧光定量PCR检测大鼠膝关节软骨组织Hub基因表达：首先，在液氮中将软骨组织研磨成细粉，然后使用Trizol裂解组织细粉并进行匀浆处理。接下来，加入0.2 mL氯仿，充分混匀，并静置3-5 min；在室温下以12 000 r/min离心10 min；小心地将上层水相转移到一个新的1.5 mL离心管中，避免取到中间层和下层溶液；加入等体积的异丙醇，混匀后在-20 ℃静置20 min；然后再次以12 000 r/min
离心10 min，将上清液丢弃；使用1 mL体积分数75%乙醇洗涤沉淀，以12 000 r/min离心5 min；丢弃上清液，将沉淀风干3-5 min，然后溶解于50 mL的DEPC水中；在-80 ℃保存待用。根据反转录试剂盒说明书进行反转录操作以获得cRNA。接着，利用荧光PCR仪进行荧光定量PCR (采用荧光染料法)，使用AceQ® qPCR SYBR Green qPCR master mix进行实验步骤，以GAPDH作为内参。通过观察熔解曲线和扩增曲线来衡量结果，并使用ABI的DataAssist™ v3.0软件，使用2-ΔΔCt方法进行结果分析。其中，ΔΔCt=骨关节炎组(Ct目的基因-Ct管家基因)-对照组(Ct目的基因-Ct管家基因)。相关基因引物序列见表1。
1.5 主要观察指标 骨性关节炎铁超载关键基因细胞间黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、肿瘤坏死因子配体超家族成员11(tumor necrosis factor superfamily member 11，TNFSF11)、骨髓瘤细胞癌基因(myelocytomatosis oncogene，MYC)、Janus激酶2(janus kinase 2，JAK2)及白细胞介素6的表达变化。
1.6 统计学分析 使用GraphPad Prism 9软件进行数据分析，计量资料以x±s的形式呈现。采用独立样本t检验对两组间的定量数据进行比较，P < 0.05为差异有显著性意义。该文章统计学方法已由贵州医科大学生物统计学专家审核。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程
