尿石素B对骨髓来源巨噬细胞向破骨细胞分化的调控机制

doi:10.12307/2025.368

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (11): 2201-2209.doi: 10.12307/2025.368

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尿石素B对骨髓来源巨噬细胞向破骨细胞分化的调控机制

罗晰，陈建权

苏州大学苏州医学院骨科研究所，江苏省苏州市 215000

收稿日期:2024-03-23 接受日期:2024-05-21 出版日期:2025-04-18 发布日期:2024-08-10
通讯作者: 陈建权，教授，博士生导师，苏州大学苏州医学院骨科研究所，江苏省苏州市 215000
作者简介:罗晰，女，1999年生，江西省赣州市人，汉族，苏州大学苏州医学院骨科研究所在读硕士，主要从事骨发育与再生研究。
基金资助:
江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)，项目参与人：陈建权

Regulatory mechanism of urolithin B in osteoclastic differentiation of bone marrow-derived macrophages

Luo Xi, Chen Jianquan

Institute of Orthopaedic Surgery, Suzhou Medical College, Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China

Received:2024-03-23 Accepted:2024-05-21 Online:2025-04-18 Published:2024-08-10
Contact: Chen Jianquan, Professor, Doctoral supervisor, Institute of Orthopaedic Surgery, Suzhou Medical College, Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China
About author:Luo Xi, Master candidate, Institute of Orthopaedic Surgery, Suzhou Medical College, Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPA) (to CJQ [project participant])

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
尿石素B：属于多酚类化合物，是鞣花单宁的肠道微生物代谢物之一，在多种植物性食品中含量丰富，具有抗炎和抗氧化等作用。
核因子κB配体受体活化因子配体：是破骨细胞形成和功能过程中的关键细胞因子，与其受体结合后会募集相关受体因子，随后激活调控破骨细胞生物学过程的信号通路，促进破骨细胞相关功能基因的转录表达，从而影响破骨细胞的分化及功能。

背景：尿石素B在机体免疫应答中起重要调节作用，具备抗炎、抗氧化和抗癌的特性，并能抑制Raw 264.7细胞向破骨细胞分化，但其对于骨髓来源的巨噬细胞向破骨细胞分化的具体作用及机制尚未阐明。系统性研究破骨细胞过度活化的调控机制，有助于探索新的治疗靶点，筛选研发更安全、有效的治疗药物，为阻断破骨细胞过度活化提供新思路。
目的：利用骨髓来源的巨噬细胞建立体外破骨细胞分化模型，探究尿石素B对核因子κB受体活化因子配体介导破骨细胞分化的影响，并系统性分析其作用机制。
方法：①采用CCK-8法筛选尿石素B干预骨髓来源巨噬细胞的安全工作浓度；②用不同浓度(0，12.5，25，50 μmol/L)尿石素B干预骨髓来源的巨噬细胞向破骨细胞分化，进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞的数目及面积大小；③不同浓度(0，12.5，25，50 μmol/L)尿石素B干预骨髓来源巨噬细胞的破骨分化，通过实时荧光定量PCR检测破骨特异性基因的相对表达水平；④蛋白印迹实验观察尿石素B对骨髓来源巨噬细胞P65、ERK信号通路的影响；⑤蛋白印迹实验检测尿石素B对骨髓来源巨噬细胞的破骨分化关键转录因子活化T细胞核因子1和c-Fos的影响。
结果与结论：①50 μmol/L及以下浓度的尿石素B对骨髓来源巨噬细胞的增殖无影响，能显著抑制骨髓来源巨噬细胞的破骨分化；②尿石素B主要在破骨形成前中期抑制骨髓来源巨噬细胞的破骨分化；③尿石素B可下调骨髓来源巨噬细胞中破骨特异性基因的相对表达水平；④50 μmol/L的尿石素B抑制骨髓来源巨噬细胞的P65和ERK磷酸化水平，进而抑制破骨细胞形成；⑤50 μmol/L的尿石素B抑制骨髓来源的巨噬细胞中破骨分化关键转录因子活化T细胞核因子1和c-Fos的表达；⑥提示尿石素B通过P65/ERK信号轴下调破骨关键转录因子活化T细胞核因子1、c-Fos的表达，抑制下游破骨特异性基因的表达，从而抑制骨髓来源的巨噬细胞向破骨细胞分化。
https://orcid.org/0009-0006-3593-4825(罗晰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 尿石素B, P65, ERK, 活化T细胞核因子1, c-Fos, 骨髓来源巨噬细胞, 破骨细胞分化

Abstract: BACKGROUND: Urolithin B plays an important role in regulating the body’s immune response and has antioxidant, anti-cancer and anti-inflammatory properties. Notably, urolithin B has been reported to have inhibitory effects on osteoclast differentiation of Raw 264.7 cells. However, a more comprehensive understanding of its specific mechanism of action in the context of osteoclast differentiation in bone is worth exploring. Systematic research on the regulatory mechanisms of osteoclast overactivation can help to explore new therapeutic targets, screen and develop safer and more effective therapeutic drugs, and provide new ideas to block the overactivation of osteoclasts.
OBJECTIVE: By establishing an in vitro osteoclast differentiation model using bone marrow-derived macrophages, to investigate the effect of urolithin B on nuclear factor-κB receptor-activating factor ligand-mediated osteoclast differentiation and to systematically analyze its mechanism of action.
METHODS: (1) The safe working concentration of urolithin B was screened by cell counting kit-8 method. (2) Different concentrations of urolithin B (0, 12.5, 25, and 50 μmol/L) were used to intervene with the osteoclast differentiation of bone marrow-derived macrophages, and the number of osteoclasts and the size of osteocytes were observed using tartrate-resistant acid phosphatase staining. (3) Different concentrations of urolithin B (0, 12.5, 25, and 50 μmol/L) were used to intervene with the osteoclast differentiation of bone marrow-derived macrophages, and the relative expression levels of osteoclast-specific genes were detected using real-time fluorescence quantitative PCR. (4) The effect of urolithin B on the P65 and ERK signaling pathways of bone marrow-derived macrophages was observed by western blot. (5) The effect of urolithin B on the key transcription factors nuclear factor of activated T cells 1 and c-Fos in the osteoclastic differentiation of bone marrow-derived macrophages was detected by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: 50 μmol/L or lower concentration of urolithin B had no effect on the proliferation of bone marrow-derived macrophages but significantly inhibited osteoclastic differentiation of bone marrow-derived macrophages. Urolithin B mainly inhibited osteoclastic differentiation of bone marrow-derived macrophages in pre-medium term. Urolithin B down-regulated the relative expression levels of osteoclast specific genes in bone marrow-derived macrophages. 50 μmol/L urolithin B inhibited the phosphorylation levels of P65 and ERK in bone marrow-derived macrophages, which led to the inhibition of osteoclast formation. 50 μmol/L urolithin B inhibited the expression of key transcription factors nuclear factor of activated T cells 1 and c-Fos in bone marrow-derived macrophages into osteoclasts. To conclude, urolithin B inhibits bone marrow-derived macrophages from differentiating into osteoclasts by suppressing the expression of downstream osteoclastogenic-related signature genes and downregulating the expression of the important osteoclastogenic transcription factors, nuclear factor of activated T cells 1 and c-Fos, via the P65/ERK signaling axis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: urolithin B, P65, ERK, nuclear factor of activated T cells 1, c-Fos, bone marrow-derived macrophage, osteoclastic differentiation

中图分类号:

罗晰, 陈建权. 尿石素B对骨髓来源巨噬细胞向破骨细胞分化的调控机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(11): 2201-2209.

Luo Xi, Chen Jianquan. Regulatory mechanism of urolithin B in osteoclastic differentiation of bone marrow-derived macrophages[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(11): 2201-2209.

图/表（结果） 6

2.1 尿石素B对骨髓来源巨噬细胞增殖的影响首先利用CCK-8法来评估不同浓度尿石素B(0，12.5，25，50，100和150 μmol/L)尿石素B对骨髓来源巨噬细胞增殖的影响。用不同浓度尿石素B处理24，48，72 h，CCK-8结果显示在尿石素B剂量在50 μmol/L及以内时，对骨髓来源巨噬细胞增殖无明显影响，高浓度尿石素B(100，150 μmol/L)与对照组(0 μmol/L)相比差异有显著性意义(P < 0.05)，对骨髓来源巨噬细胞增殖有抑制作用，具体结果见图1。因此在后续实验中，选取50 μmol/L及以下浓度探究尿石素B对骨髓来源巨噬细胞破骨分化的影响。
2.2 尿石素B抑制RANKL诱导骨髓来源巨噬细胞的破骨分化 CCK-8检测结果显示50 μmol/L及以下浓度的尿石素B对骨髓来源巨噬细胞增殖无明显抑制作用，为了进一步探究尿石素B对骨髓来源巨噬细胞破骨分化的影响，此次研究在体外细胞实验使用不同浓度(0，12.5，25和50 μmol/L)的尿石素B干预RANKL刺激骨髓来源巨噬细胞破骨分化过程。RANKL刺激5 d后，观察到RANKL阳性对照组出现较多密且大的多核破骨细胞。抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果显示，当尿石素B为12.5 μmol/L时骨髓来源巨噬细胞破骨分化受到明显抑制，破骨细胞数量及大小明显减少，增加到50 μmol/L几乎完全抑制了破骨细胞的生成，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图2。这一结果表明尿石素B能够抑制体外RANKL诱导的骨髓来源巨噬细胞破骨分化，并呈浓度依赖性。
2.3 尿石素B主要在骨髓来源巨噬细胞的破骨分化前中期产生抑制作用在RANKL诱导骨髓来源巨噬细胞过程中，诱导第二三天时，骨髓来源巨噬细胞会出现部分细胞逐渐有融合的趋势；诱导的第4天，出现小块细胞融合区域，破骨细胞开始形成，呈圆形或类圆形；到第5天出现大的边界清晰的呈煎饼状的成熟破骨细胞。为了检测尿石素B对RANKL诱导的破骨细胞形成的主要影响阶段，此次研究使用50 μmol/L尿石素B对RANKL诱导的骨髓来源巨噬细胞进行了不同时间段的干预。分别在RANKL刺激的早期(0-2 d)、中期(2-4 d)、晚期(4-5 d)、全程(0-5 d)分别给予50 μmol/L浓度的尿石素B干预骨髓来源巨噬细胞破骨分化过程。抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果表明，在破骨细胞形成前中期加入尿石素B较显著地减少了破骨细胞的数量和大小，见图3。
2.4 尿石素B抑制破骨细胞分化相关特征基因的mRNA表达为了进一步探讨尿石素B对破骨细胞分化的抑制作用，此次研究通过荧光定量PCR评估在体外其对Nfatc1、Oscar、Ctsk、Mmp9、Acp5和Atp6V0d2等破骨分化特征基因表达的影响。在mRNA水平上检测尿石素B对RANKL诱导5 d骨髓来源巨噬细胞后破骨分化特征基因的表达情况，以18s表达量为标准对照。实时定量荧光PCR结果显示：经尿石素B干预上述破骨分化特征基因表达均有所下降，50 μmol/L浓度的尿石素B处理组与对照组相比，破骨分化基因表达差异有显著性意义(P < 0.01)，见图4。这说明尿石素B通过下调破骨分化特征基因的转录激活与表达，抑制了破骨细胞的形成与成熟。
2.5 尿石素B抑制RANKL介导的P65、ERK信号通路激活此次研究采用抑制作用最强的浓度50 μmol/L来研究尿石素B对RANKL诱导的骨髓来源巨噬细胞中核因子κB(P65)、MAPK(ERK)信号通路的影响。用RANKL在0，5，15，30，60 min不同时间梯度来刺激骨髓来源巨噬细胞。结果表明，RANKL刺激显著提高了p-P65、p-ERK的表达水平，呈现出先升高后降低的趋势，p-P65、p-ERK在5 min达到峰值。与RANKL阳性对照组对比，尿石素B处理组主要在5 min降低了磷酸化ERK相对于其总蛋白的表达水平，在各时间点均抑制了磷酸化P65相对于其总蛋白的表达水平。这表明尿石素B抑制了RANKL诱导的P65和ERK信号通路的磷酸化情况，从而干预破骨细胞分化，见图5。
2.6 骨髓来源巨噬细胞破骨分化过程中NFATc1、c-Fos表达变化及尿石素B对其的抑制作用此次研究采用抑制作用最强的浓度50 μmol/L来研究尿石素B对骨髓来源巨噬细胞破骨分化过程中破骨关键转录因子NFATc1、c-Fos表达的影响。在RANKL诱导0，1，3或5 d，收集了阳性对照组和尿石素B干预组的骨髓来源巨噬细胞。通过蛋白印迹实验发现，在RANKL处理骨髓来源巨噬细胞破骨分化过程中，NFATc1和c-Fos蛋白表达水平逐渐上升，在第5天达到峰值。在50 μmol/L浓度尿石素B处理后这些蛋白表达水平受到明显抑制，尤其是第3，5天。由此可知，尿石素B抑制了NFATc1和c-Fos的活性，从而影响RANKL诱导的骨髓来源巨噬细胞破骨分化过程，见图6。

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引言

骨稳态是骨形成和骨吸收之间的动态调节[1]，在骨骼发育过程中，成骨细胞和破骨细胞的动态平衡对各种生理过程至关重要，包括骨骼生长、骨折愈合以及钙和磷代
谢[2]。破骨细胞是由单核巨噬细胞形成的大型多核细胞，负责骨质吸收和降解[3]，其活性的任何异常都可能导致骨骼结构的显著改变使疾病症状恶化，如导致佩吉特氏骨病、假体周围骨溶解、骨肿瘤和骨质疏松症等各种骨骼疾病[4-5]。目前已经开发了靶向破骨细胞用于治疗此类疾病的药物，如双膦酸盐是用于治疗骨质疏松症和骨转移癌的临床药物，能够抑制破骨细胞的骨吸收，但会引起胃肠道刺激、颌骨坏死等不良反应[6-7]。地诺单抗是核因子κB配体受体活化因子单克隆抗体，能抑制破骨细胞的分化和功能，然而一旦停药会引起患者骨密度的快速降低并增加其椎体骨折风险[8-9]。罗莫单抗是一种抗硬骨素单克隆抗体，可刺激骨形成并抑制骨吸收，但可能增加心血管损伤的风险[10-11]。因此，亟需开发新的安全的治疗方法，深入研究阐明破骨细胞过度活化的机制，有助于筛选更安全的潜在治疗靶点，为许多此类骨骼疾病提供更多理论依据。
巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，MCSF)和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)对刺激破骨细胞的分化和活化起着重要作用，是破骨细胞形成和功能过程中的关键细胞因子[12-13]。MCSF促进破骨细胞的前体细胞(单核细胞/巨噬细胞前体)向成熟的破骨细胞分化，使得破骨细胞的前体细胞能够分化为多核破骨细胞[14]。RANKL诱导的信号级联是成熟破骨细胞形成的关键，RANKL通过与核因子κB受体结合并激活，随后招募肿瘤坏死因子受体相关因子6，并激活一系列细胞内分子事件，涉及活化B细胞的核因子κB，促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和Ca2+途径[15-17]。这些通路会进一步刺激破骨细胞相关下游因子的表达如活化T细胞核因子1(nuclear factor of activated T cells 1，NFATc1)，NFATc1与其他转录伴侣协同激活破骨细胞特异性基因的表达，如Acp5、Oscar、Ctsk和Mmp9，最终促进破骨细胞的成熟和功能的增强，进而影响骨组织的代谢和重塑[18]。所以针对于RANKL诱导的骨髓来源的巨噬细胞破骨分化的机制研究有助于骨代谢疾病预防和治疗。鞣花单宁被分解成鞣花酸，其吸收很低，经肠道微生物群代谢后形成尿石素A，B，C或D[19-20]。尿石素B是鞣花单宁中最具生物活性的肠道微生物代谢物之一，是多酚类化合物，在石榴、浆果、核桃、热带水果等多种植物食品中含量丰富[20-21]。先前研究表明，尿石素B具有抗氧化和抗炎特性[22-23]，也在许多疾病研究中具有积极作用，如糖尿病、骨关节炎、癌症、心血管病[20，24-26]，但在破骨细胞过度活化相关疾病中的作用研究还较少。目前有研究证明尿石素B在100 μmol/L浓度下对Raw264.7细胞增殖无影响，并可以通过MAPK、AKT和核因子B信号通路干预Raw264.7细胞向破骨分化过程[27]。此次研究旨在研究尿石素B对骨髓来源巨噬细胞向破骨细胞分化的相关信号通路的调控机制。
在此次研究中，探究了尿石素B对经RANKL诱导的骨髓来源巨噬细胞破骨细胞形成的影响，并阐明了其潜在的分子机制。此次研究发现尿石素B呈浓度梯度依赖性抑制骨髓来源巨噬细胞的破骨分化，且抑制主要在发生在破骨分化前中期；尿石素B下调RANKL诱导破骨分化相关特征基因的mRNA表达水平；尿石素B通过P65/ERK信号通路抑制破骨形成与分化；在蛋白水平上，破骨分化关键转录因子NFATc1和c-Fos在骨髓来源巨噬细胞经RANKL诱导过程中表达增高，尿石素B的干预会抑制其表达。综上所述，尿石素B通过调节ERK/P65/NFATc1通路来减弱破骨细胞的形成。因此，尿石素B可能是治疗骨质疏松症等破骨细胞过度活化相关疾病一种新的候选药物。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学基础实验，采用one-way(单个变量)或two-way(多个变量)ANOVA分析。
1.2 时间及地点实验于2023年12月至2024年3月在苏州大学骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选择6-8周龄的野生型C57BL/6小鼠，雄性，体质量20 g左右，购于杭州子源实验动物科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK(浙)2019-0004。实验方案获苏州大学伦理委员会批准(批号：SUDA 20240307A01)，整个实验过程严格按照标准操作流程进行。
1.3.2 主要试剂及仪器尿石素B(MCE公司，美国)，胎牛血清(AusgeneX有限公司，美国)，α-MEM培养基(上海源培生物有限公司，上海)，MCSF(近岸蛋白生物有限公司，中国)，胰酶、BCA检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，中国)，DSMO(北京索莱宝食物有限公司，中国)，彩色蛋白marker、双抗(苏州NCM生物科技有限公司，中国)，DPBS、β-actin抗体(赛维尔生物科技有限公司，中国)，RANKL因子(PeproTech公司，美国)，ERK抗体、p-ERK抗体、P65抗体(Cell Signaling Technology公司，美国)，p-P65抗体(SAB公司，美国)，NFATc1抗体、c-Fos抗体(Abcam公司，英国)，RNA isolater Total RNA试剂盒、HiScriptⅡQ RTSuperMix、SYBR Green 预混qPCR试剂盒(南京诺维赞生物有限公司，中国)，PCR仪、离心机(Thermo Fisher，美国)，荧光实时定量PCR仪(Bio-rad，美国)，显影仪(杭州申花科技公司，中国)，酶标仪(Bio-tek，美国)。
1.4 方法
1.4.1 骨髓来源巨噬细胞的提取、培养及诱导
(1)骨髓来源巨噬细胞的提取：准备实验取材相关器械置于超净台中，用一次性无菌针头将0.6 mL离心管戳孔，置放入1.5 mL离心管中，同时取出三四个无菌细菌培养皿，每皿均倒入适量无菌DPBS，紫外照射上述实验用具15-20 min。注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉小鼠，随后分离小鼠股骨和胫骨，剃净骨表面残留的结缔组织；在超净工作台内剪下股骨和胫骨部分骨组织，使骨髓腔暴露开口朝下放入已戳洞的0.6 mL离心管内，将0.6 mL离心管放入1.5 mL EP管中，13 000 r/min离心1 min，骨髓内细胞被离心至1.5 mL EP管内。
(2)骨髓来源巨噬细胞的培养：用α-MEM完全培养基(体积分数10%胎牛血清、1%双抗的α-MEM培养基)来重悬细胞，种在10 cm细胞培养皿(细胞数约4×106/皿)，置于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养；第2天收集细胞悬液，进行离心，1 000 r/min离心4 min，用含15 ng/mL MCSF因子的α-MEM完全培养基重悬细胞后，转移至新的无菌10 cm细胞培养皿继续培养，24 h后可观察到贴壁细胞，这些细胞被认为是骨髓来源巨噬细胞。骨髓来源巨噬细胞融合度达到80%-90%后，用0.25%胰蛋白酶对骨髓来源巨噬细胞进行消化用于后续实验。
(3)骨髓来源巨噬细胞的破骨分化诱导：根据实验目的将适宜数目的骨髓来源巨噬细胞种在6或24孔板中(24孔板1×105/孔，6孔板4×105/孔)，用含15 ng/mL MCSF因子的α-MEM完全培养基继续培养。待第2天多数细胞贴壁后，用破骨诱导培养基(30 ng/mL MCSF因子、50 ng/mLRANKL因子、体积分数10%血清和1%双抗的α-MEM培养基)进行破骨细胞诱导分化。隔天换液，在诱导第三四天观察到细胞融合，培养5 d后，可观察到边界清晰成熟的破骨细胞。

1.4.2 CCK-8细胞毒性实验采用CCK-8法评估尿石素B对骨髓来源巨噬细胞的增殖毒性，将细胞状态正常的骨髓来源巨噬细胞(5×103/孔)种于96孔板中，用包含15 ng/mLMCSF因子的α-MEM完全培养基进行培养；第2天在显微镜下观察细胞，确定细胞状态正常且基本贴壁进行下一步实验。加药组培养基是包含不同浓度的尿石素B(0，12.5，25，50，100，150 μmol/L)、15 ng/mL MCSF因子的α-MEM完全培养基；对照组加入包含等量溶剂DMSO的15 ng/mL MCSF因子的α-MEM完全培养基，共3板，分别处理24，48，72 h；到达设定的时间，将培养基更换为含有10% CCK-8检测试剂的培养基，在37 ℃下避光孵育2 h后，用酶标仪在450 nm下测量吸光度(A)。
1.4.3 抗酒石酸酸性磷酸酶染色将细胞状态正常的骨髓来源巨噬细胞以1×105/孔的密度接种于24孔板中，待第2天细胞基本贴壁，用破骨诱导培养基进行破骨诱导分化培养5 d；同时加药组加入不同浓度的尿石素B(12.5，25，50 μmol/L)；阳性对照组加入含等量溶剂DMSO的培养基，每2 d换液1次，至对照组形成边界清晰的成熟破骨细胞即停止细胞培养。弃去培养基，用DPBS冲洗3次洗去残留培养基，使用40 g/L多聚甲醛固定细胞，随后用DPBS冲洗3次，加入抗酒石酸酸性磷酸酶染色液，避光在37 ℃摇床孵育30-45 min，去离子水冲洗残余染料，在显微镜下进行观察及拍照，有3个以上胞核的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞被认为是成熟破骨细胞，并用Image J软件破骨细胞数量和大小进行统计。

1.4.4 反转录及荧光实时定量PCR 将骨髓来源巨噬细胞(4×105/孔)接种于6孔板，第2天观察细胞贴壁情况，随后破骨诱导培养基诱导骨髓来源巨噬细胞向破骨细胞分化，加药组分别用尿石素B(12.5，25，50 μmol/L)处理；对照组加入等量溶剂DMSO。使用Trizol法提取细胞总RNA，用反转录试剂将500 ng总RNA反转录为cDNA，采用SYBR Green qPCR预混试剂通过实时荧光定量PCR仪检测目标基因表达量。靶基因的表达量以18S为标准对照，使用2-ΔΔCt方法计算不同基因的相对表达量和误差。引物序列见表1。

1.4.5 细胞蛋白提取及蛋白免疫印迹法
(1)长时间段梯度蛋白免疫印迹实验：RANKL/RANK相互作用与MCSF一起触发多个下游的激活破骨细胞形成所必需的信号通路，为了评定尿石素B在破骨细胞诱导过程中对破骨关键性信号通路蛋白的影响，使用RIPA(含有1×蛋白酶抑制剂和1×磷酸酶抑制剂)收集DMSO或尿石素B(50 μmol/L)、30 ng/mL MCSF和50 ng/mL RANKL共同处理0，1，3，5 d的骨髓来源巨噬细胞的细胞总蛋白。
将收集的蛋白进行20 min冰上裂解后离心提取蛋白，取等量的总蛋白加入1/4体积的蛋白上样缓冲液，100 ℃煮样5 min。使用10% SDS-PAGE分离蛋白后转移到NC膜上，用TBST配制的5%脱脂奶粉室温封闭2 h，4 ℃过夜孵育一抗NFATc1、c-Fos及内参β-actin(稀释比例为1∶2 000)，第2天使用相应二抗(稀释比例为1∶4 000)室温孵育1 h后，再用1×TBST缓冲液洗膜3次，使用ECL发光液通过凝胶成像仪器使蛋白条带可视化，随后用Image J软件对图像条带进行灰度值定量。
(2)短时间段梯度蛋白免疫印迹实验：将骨髓来源巨噬细胞以6×105/孔的密度接种于6孔板，每个浓度设置3个重复，用含15 ng/mL MCSF的α-MEM完全培养基培养，定期观察细胞状态，待细胞基本贴壁开始下一步操作。为了检测RANKL刺激不同时间下的P65和ERK各通道表达情况，加DMSO或尿石素B(50 μmol/L)预先干预4 h后，对照组和加药组同时用50 ng/mL RANKL刺激一定时间(0，5，15，30或60 min)，用RIPA(含有1X蛋白酶抑制剂和1X磷酸酶抑制剂)提取总蛋白。后续蛋白提取、分离、封闭、转膜及显影步骤同“长时间段梯度蛋白免疫印迹实验”，目标蛋白为p-ERK、ERK、p-P65和P65(抗体稀释比例1∶2 000)。
1.5 主要观察指标 ①筛选尿石素B作用于骨髓来源巨噬细胞的安全浓度范围；②观察不同浓度尿石素B作用下RANKL诱导的骨髓来源巨噬细胞破骨细胞的形态大小及数目；③观察尿石素B对骨髓来源巨噬细胞破骨分化作用的主要时间段；④检测尿石素B抑制骨髓来源巨噬细胞破骨分化及功能相关基因的表达情况；⑤尿石素B对骨髓来源巨噬细胞破骨分化P65、ERK信号通道磷酸化水平的影响；⑥尿石素B干预对骨髓来源巨噬细胞破骨分化关键转录因子NFATc1、c-Fos蛋白表达水平的影响。
1.6 统计学分析实验数据以x±s表示，采用one-way(单个变量)或two-way(多个变量)ANOVA分析。显著差异度表现为P值，P < 0.05认为差异有显著性意义，使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析及绘图。文章统计学方法由苏州大学生物统计学专家审核。

讨论

破骨细胞数量和活性的增加会导致溶骨性疾病，如骨质疏松症、类风湿关节炎和溶骨性骨转移，抑制破骨细胞的分化及功能、减轻其过度激活是治疗骨丢失疾病的一种有效方法[28-29]。目前抗骨吸收的药物主要有双膦酸盐类、地诺单抗和特立帕肽，但许多不良反应已被报道[30]。因此，探索替代天然药物来改善骨溶解治疗迫在眉睫。
RANK/RANKL信号轴调控破骨分化下游信号，使单核细胞/巨噬细胞前体细胞向破骨细胞谱系的分化。RANKL与其受体结合通过招募肿瘤坏死因子受体相关因子6激活核因子κB、c-Jun和MAPK，活化的c-Jun和c-Fos进一步促进激活蛋白1的表达，并最终促进NFATc1的表达，MCSF及其受体通过激活MAPK级联促进破骨细胞生成[31-33]。活化的NFATc1会调控破骨细胞分化及功能相关基因的转录表达，从而调控破骨细胞的形成及骨吸收功能[34-35]。此次研究使用了具有破骨分化潜力的骨髓来源巨噬细胞，经RANKL诱导后能形成较大的成熟破骨细胞。

研究表明鞣花素和鞣花酸可以抑制破骨细胞分化，会显著抑制RANKL诱导的通路包括核因子κB、JNK和ERK通路[36-37]。尿石素B是鞣花素和鞣花酸的代谢产物，已显示出多种有益的药理活性，包括抗破骨细胞作用[38]。但是，尿石素B抑制RANKL诱导的骨髓来源巨噬细胞破骨分化的分子机制仍有待阐明。此次研究通过体外细胞实验探究尿石素B对RANKL诱导的骨髓来源巨噬细胞破骨分化的影响及其机制。
此次研究通过CCK-8法筛选尿石素B作用于骨髓来源巨噬细胞的安全工作浓度，发现在50 μmol/L内对骨髓来源巨噬细胞无明显细胞毒性。在安全浓度内评估尿石素B对骨髓来源巨噬细胞向破骨细胞分化的影响，首先用不同浓度(0，12.5，25和50 μmol/L)尿石素B干预RANKL诱导的骨髓来源巨噬细胞破骨分化过程，通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞数目和大小，结果表明尿石素B以浓度依赖性方式抑制骨髓来源巨噬细胞破骨分化，且抑制主要在诱导前中期。随后此次研究通过实时荧光定量PCR检测发现尿石素B干预骨髓来源巨噬细胞破骨分化5 d后，破骨分化标志物基因的mRNA表达水平均显著下调，包括Nfatc1、Oscar、Ctsk、Mmp9、Acp5和Atp6v0d2，初步证明尿石素B对骨髓来源巨噬细胞向破骨细胞分化具有抑制作用，接下来分析尿石素B对破骨细胞的具体机制。RANKL介导的MAPK和核因子κB信号通路是破骨细胞发生中被充分研究，其重要性已被药理研究强调[39-43]。NFATc1、c-Fos的表达与破骨细胞生成和活化的每个阶段都有关联，能够促进破骨形成与分化相关基因的表达[34，44]。在此次研究中发现，RANKL在短时间梯度内刺激骨髓来源巨噬细胞，可观察到P65和ERK磷酸化水平呈先上升再下降趋势，50 μmol/L浓度尿石素B干预后P65和ERK磷酸化水平均被显著抑制。同时在RANKL诱导骨髓来源巨噬细胞破骨分化过程中，检测尿石素B对NFATc1和c-Fos蛋白表达的影响，蛋白印迹结果表明破骨关键转录因子NFATc1和c-Fos蛋白表达是随RANKL诱导时间上升的，而尿石素B的干预会抑制NFATc1和c-Fos的蛋白表达水平。这些结果表明尿石素B通过抑制RANKL介导ERK/P65/NFATc1信号通路，从而影响骨髓来源巨噬细胞向破骨细胞分化。
先前的研究结果表明，尿石素B可通过ERK/核因子κB通路抑制RANKL诱导的Raw264.7细胞向破骨细胞分化[33]。此次研究同样支持尿石素B可通过介导P65/ERK通路抑制破骨细胞活性，同时，此次研究补充了尿石素B对骨髓来源巨噬细胞破骨分化抑制作用的主要影响阶段，尿石素B对骨髓来源巨噬细胞破骨分化的破骨分化特征基因相对表达水平的影响，对骨髓来源巨噬细胞的P65、ERK蛋白磷酸化水平的影响，以及尿石素B在长时间梯度内干预RANKL诱导骨髓来源巨噬细胞破骨分化后破骨分化关键转录因子NFATc1和c-Fos蛋白表达的变化。此次研究为阻断破骨细胞过度活化的候选药物提供了新思路，未来的研究需要进一步探索尿石素B对体内骨质疏松和假体骨溶解的影响。
结论：综上所述，此次研究构建体外RANKL介导的破骨细胞分化模型，发现尿石素B通过P65/ERK信号轴下调破骨分化关键因子的表达，抑制骨髓来源巨噬细胞向破骨细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

尿石素B对骨髓来源巨噬细胞向破骨细胞分化的调控机制

Regulatory mechanism of urolithin B in osteoclastic differentiation of bone marrow-derived macrophages

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