隔药饼灸调节大鼠免疫抑制机制的转录组测序分析

doi:10.12307/2025.276

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (5): 978-988.doi: 10.12307/2025.276

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隔药饼灸调节大鼠免疫抑制机制的转录组测序分析

田岳凤1，熊罗节2，王慧芳1，翟春涛1，李玮1

1山西中医药大学第二临床学院，山西省晋中市 030619；2湖南中医药大学针灸推拿与康复学院，湖南省长沙市 410208

收稿日期:2024-02-06 接受日期:2024-03-04 出版日期:2025-02-18 发布日期:2024-06-03
通讯作者: 田岳凤，山西中医药大学第二临床学院，山西省晋中市 030619
作者简介:田岳凤，女，1963年生，山西省人，汉族，2000年湖南中医学院毕业，博士，山西中医药大学教授，博士生导师，主要从事艾灸防治疾病效应机制相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(82174504，81674062)，项目负责人：田岳凤；山西中医药大学基础研究项目(ZJJC2022005)，项目负责人：田岳凤

Mechanism of immunosuppression in rats by herb-partitioned moxibustion based on transcriptome sequencing technology

Tian Yuefeng1, Xiong Luojie2, Wang Huifang1, Zhai Chuntao1, Li Wei1

1The Second Clinical College of Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China; 2College of Acupuncture, Massage and Rehabilitation, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, Hunan Province, China

Received:2024-02-06 Accepted:2024-03-04 Online:2025-02-18 Published:2024-06-03
Contact: Tia Yuefeng, The Second Clinical College of Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China
About author:Tian Yuefeng, MD, Professor, Doctoral supervisor, The Second Clinical College of Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, Nos. 82174504 and 81674062 (both to TYF); Shanxi University of Chinese Medicine Basic Research Program, No. ZJJC2022005 (to TYF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
隔药饼灸：晋代著名医家葛洪所创立，是将艾灸、穴位与药物相结合的一类艾灸治疗方法，以温热效应为主，达到防治疾病的目的。
免疫抑制：是由恶性肿瘤、不孕症、脑血管疾病、艾滋病、衰老和其他疾病引起的一种不良状态，表现为患者的免疫功能减弱，免疫活性细胞数量减少、细胞因子表达和分泌异常以及免疫抑制因子活性增加。
转录组测序技术：以mRNA为主要研究对象，通过高通量生物学数据的分析、挖掘和解释，运用各种算法和工具对生物大数据进行处理和分析，以发现生物体内基因表达、蛋白质结构、代谢途径及信号转导等方面的规律。

背景：免疫抑制会导致机体免疫功能受损，加重病情。隔药饼灸能有效调节机体免疫功能，提高机体免疫力，但其调节机制目前仍不清楚。
目的：基于转录组学的生物信息学技术对隔药饼灸干预的免疫抑制模型大鼠进行测序，探究隔药饼灸调控免疫的机制。
方法：将24只SD大鼠随机分为空白组、模型组和隔药饼灸组，每组8只，模型组与隔药饼灸组采用腹腔注射环磷酰胺制备免疫抑制模型，35 mg/kg，连续3 d，造模结束后空白组与模型组不做干预，隔药饼灸组在大鼠中脘、神阙、关元及足三里穴位进行艾炷与药饼结合的隔药饼灸干预，连续10 d，1次/d，干预结束后次日取材。取各组大鼠外周血进行白细胞数量检测；采用Illumina测序平台进行RNA-seq，筛选差异基因，结合GO与KEGG数据库，对差异基因进行生物信息学相关分析。
结果与结论：①与空白组比较，模型组白细胞数量显著减少(P < 0.001)。②RNA-seq共筛选出模型组与空白组间差异基因3 026个，其中
1 565个上调、1 461个下调，隔药饼灸组与模型组间差异基因535个，其中280个上调、255个下调。③韦恩图分析获得模型组与空白组159个下调基因经隔药饼灸干预后上调，蛋白互作网络分析获得Oasl，Oas2，Isg15，Herc6，Mx2，Helz2，Mx1，Syk，Hspa1a及Ret等10个核心靶点；④GO与KEGG分析隔药饼灸调节机体的机制有免疫应答途径、病毒相关、血管新生和自身免疫系统等通路。⑤上述结果证实，实验筛选出隔药饼灸干预免疫抑制与Oasl，Oas2，Isg15，Herc6，Mx2，Helz2及Mx1靶点有明显关联，并且在免疫应答、病毒相关及血管新生等通路中发挥调控作用。
https://orcid.org/0009-0008-8929-4530(田岳凤)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 免疫抑制, 隔药饼灸, 转录组测序, 寡腺苷酸合成酶样蛋白, 寡腺苷酸合成酶2, 干扰素诱导基因15, E3泛素蛋白连接酶家族成员6, 抗黏病毒蛋白2, 锌指解旋酶2, 抗黏病毒蛋白1

Abstract: BACKGROUND: Immunosuppression leads to impaired body immune function and aggravates the disease. Herb-partitioned moxibustion can effectively regulate immune function and improve immunity in the body, but its regulatory mechanism has not been elucidated.
OBJECTIVE: To sequence immunosuppressed model rats treated with herb-partitioned moxibustion using bioinformatics techniques based on transcriptomics and to explore the mechanisms by which it regulates immunity.
METHODS: Twenty-four Sprague-Dawley rats were randomly assigned to three groups: control, model, and herb-partitioned moxibustion groups, with eight rats in each group. The model and herb-partitioned moxibustion groups were subjected to establishment of an immune suppression model by intraperitoneal injection of cyclophosphamide at a dose of 35 mg/kg for 3 consecutive days. No interventions were administered to the control and model groups after modeling. In contrast, the herb-partitioned moxibustion group received moxibustion treatment at Zhongwan, Shenque, Guanyuan, and Zusanli acupoints using a combination of moxa and herbal cakes, once a day, for 10 consecutive days, with samples being collected the day after the end of the intervention. Peripheral blood was collected from all groups of rats to measure their white blood cell count. RNA-seq was performed on the Illumina sequencing platform, and differentially expressed genes were selected for bioinformatics analysis using the GO and KEGG databases.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the model group exhibited a significant decrease in white blood cell count (P < 0.001). RNA-seq analysis identified 3 026 differentially expressed genes between the model and control groups, with 1 565 upregulated and 1 461 downregulated. There were 535 differentially expressed genes identified between the herb-partitioned moxibustion group and the model group, with 280 upregulated and 255 downregulated. The Venn diagram analysis revealed that 159 genes were downregulated in the model group compared with the control group. However, after moxibustion with herbal cakes, these genes were upregulated. Protein-protein interaction network analysis identified 10 core targets, including Oasl, Oas2, Isg15, Herc6, Mx2, Helz2, Mx1, Syk, Hspa1a, and Ret. According to GO and KEGG analyses, moxibustion with herbal cakes regulated the body through pathways related to immune response, viruses, angiogenesis, and the autoimmune system. To conclude, there is a significant association between herbal cake-separated moxibustion intervention and immune suppression targets, including Oasl, Oas2, Isg15, Herc6, Mx2, Helz2, and Mx1. The intervention exhibits regulatory effects in the pathways related to immune responses, viral activities, and angiogenesis.

Key words:

immunosuppression, herb-partitioned moxibustion, RNA-sequencing, oligoadenylate synthase-like protein, oligoadenylate synthase 2, interferon inducible gene 15, E3 ubiquitin protein ligase family member 6, antimyxoviral protein 2, zinc finger deconjugase 2, antimyxoviral protein 1

中图分类号:

田岳凤, 熊罗节, 王慧芳, 翟春涛, 李玮. 隔药饼灸调节大鼠免疫抑制机制的转录组测序分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(5): 978-988.

Tian Yuefeng, Xiong Luojie, Wang Huifang, Zhai Chuntao, Li Wei. Mechanism of immunosuppression in rats by herb-partitioned moxibustion based on transcriptome sequencing technology[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(5): 978-988.

图/表（结果） 22

2.1 实验动物数量分析纳入大鼠24只，均进入结果分析，无死亡和感染，无补充，无脱失值。
2.2 各组大鼠外周血白细胞数量变化血常规结果显示，与空白组比较，模型组白细胞显著减少(P < 0.001)，白细胞数量约1.78×109 L-1，提示免疫抑制模型制备成功；与模型组比较，隔药饼灸组白细胞数量显著升高
(P < 0.001)，详见图2。
2.3 测序数据质量控制结果实验采用illumina Novaseq 6000测序平台获取空白组、模型组及隔药饼灸组共计9个样本数据，对原始数据质量控制显示，原始序列条数(Raw reads)分析结果为(3.3-5.2)×107，原始数据总碱基数(Raw bases)为(4.9-7.9)×109。样品测序序列中质量值≥
20%、30%碱基所占百分比> 96.4%和92.1%。转录组样本满足建库要求，可进行后续分析，详见表1。

2.4 差异表达基因分析结果经过连续10 d的隔药饼灸干预后，比较模型组与空白组，隔药饼灸组与模型组的基因表达情况。火山图可以比较以散点方式呈现的不同表达的基因或蛋白。采用DESeq2软件对不同样本之间进行差异基因的筛选，结果显示，与空白组比较，模型组共有差异基因3 062个，见图3A，其中1 565个基因表达上调，1 461个基因表达下调(满足|log2FC|≥1和P≤0.05)。与模型组比较，隔药饼灸组共有差异基因535个，见图4A，其中280个基因表达上调，255个基因表达下调。
聚类热图可以比较不同样本基因及蛋白表达量，结果表明，在散点图中，空白组样本间基因表达差异表达模式接近，无显著性差异，见图3B，模型组与隔药饼灸组样本存在明显的分离，颜色变化差异显著，组内各样本基因的表达模式也存在差异，见图4B。
韦恩图显示，在模型组与空白组比较中，有110个显著上调基因经隔药饼灸干预后下调(Defa7，Folr2，Osm，Ldhc，Adamts15，Gfra1，Postn，Mt2A，Rprm和Mpo等)，有159个显著下调基因经干预后上调(Ddx3，Eif2s3y，Kdm5d，Art2b，Lair1，Ifi44，Btla，Ifi44l，Mx1和Eaf2等)，见图5。
2.5 GO功能富集分析结果为了解隔药饼灸调节免疫抑制的功能，对之前筛选出的差异基因进行GO富集分析。其中模型组与空白组之间的3 025个差异基因结果显示，该干预主要生物学过程集中在对免疫应答、免疫进程的调节、对外刺激反应、生物过程的正调控等，在细胞定位以及分子功能中多集中在细胞外空间、质膜外、蛋白结合与离子结合等分类，详见表2。

隔药饼灸与模型组比较的535个差异基因结果，在生物学过程中也集中在免疫进程以及生物质量调节中，在细胞定位中多集中在核小体及染色体上，对应的分子功能多为离子及金属离子的结合，详见表3。
2.6 KEGG功能富集分析结果为了确定隔药饼灸对免疫抑制调节的生物通路信息，对不同组基因进行KEGG富集显示模型组与空白组共富集到57条信号通路(P < 0.05)，结果显示，两组间富集通路多集中核转录因子kB信号通路、造血细胞图谱、癌症中的转录失调、铁死亡、矿质吸收和原发性免疫缺陷等方向，显著富集详见图6A。

在隔药饼灸组与模型组共富集到43条信号通路(P < 0.05)，结果显示，经隔药饼灸干预后，调节通路多集中在造血细胞谱系、癌症中的转录失调、蛋白质消化吸收、细胞黏附因子以及肠道免疫在IgA生产中的应用等方向，显著富集详见图6B。
2.7 PPI网络分析结果根据上述差异及聚类分析结果，利用STRING平台将关联的核心基因进行筛选并构建PPI可视化网络图，明确重要调控蛋白的作用关系，见图7A，B。结果显示模型组与空白组PPI网络中心区域前10位的蛋白分别是Mapk12，Mapk13，Lrrk2，Cdk1，Lck，Rhoh，Rps6ka6，Rhobtb2，Rhof及Itk，见图7C。
隔药饼灸组与模型组PPI网络中心区域前10的蛋白分别是Oasl，Oas2，Isg15，Herc6，Mx2，Helz2，Mx1，Syk，Hspa1a及Ret，见图7D。
2.8 代谢通路富集分析结果通过Reactome数据库对差异基因进行代谢通路分析，结果显示模型组与空白组间比较，共有90条重要通路途径。其中上调通路有Emi1磷酸化途径、血红素生物合成以及铁的吸收和运输途径等，下调通路有程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1，PD-1)信号传导、CD22调控通路、抗原激活B细胞受体途径、磷脂在吞噬作用、Fc受体的激活和互补级联反应的调节等，详见表4，图8A。
隔药饼灸组与模型组比较，共有50条重要通路。其中上调通路有C3和C5的激活以及ISG15抗病毒机制等，下调通路有脂多糖CD14转移途径、细胞外基质、非整合素膜-细胞外基质相互作用、BID与线粒体、NCAM1相互作用以及血小板源生长因子(platelet-Derived Growth Factor，PDGF)信号转导等，详见表5，图8B。
2.9 疾病注释功能分析结果为建立不同组相关调控基因与疾病的联系，使用DisGeNet疾病数据库进行疾病
(Disease)注释和归类。结果显示，模型组与空白组之间，

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引言

免疫系统作为一个复杂的体系，是抵抗细菌和病毒等多重感染侵害的重要防线。人体自身免疫力的降低与亢进会导致一系列疾病，如细菌感染、类风湿性疾病和肿瘤等，危害人体健康[1-3]。免疫抑制是指机体免疫系统的防御机制受到破坏后引起免疫功能低下，进而诱发多种不同疾病。
伴随新一代测序技术的涌现和各类生物信息学工具的进步，基于RNA测序(RNA-sequencing，RNA-seq)的转录组分析方法正在逐步成熟。RNA-seq技术为基因组的研究、免疫与发育基因的识别以及数字基因的表达分析提供了坚实的基础，也是组学领域分析差异表达基因以及揭示各种复杂疾病背后机制的关键工具[4]。有研究通过转录组测序的手段，研究致病基因与靶向治疗点在疾病治疗过程中具体的作用机制，并提示未来可能需要结合转录组测序来检测靶向结合点为临床免疫治疗提供切入点[5-6]。
此课题组前期针对隔药饼灸干预免疫抑制展开了生物学与分子层面的研究，并证实隔药饼灸干预环磷酰胺所致免疫抑制模型效果显著，并能正向调节免疫器官功能及免疫因子，恢复机体免疫，但尚缺少对基因层面具体变化的观察以及隔药饼灸干预具体机制的进一步探究。因此，文章采用前沿高通量RNA-seq测序技术为分析隔药饼灸干预免疫抑制多组分、多靶点及多通路的作用机制进行筛选，拟通过高通量大数据对隔药饼灸的作用机制进行探究。这种对细胞和分子层面调控机制的深入研究在组织工程学领域也十分重要，隔药饼灸对免疫抑制大鼠转录组的影响研究，可以为组织工程学中的细胞疗法和生物材料的设计提供思路，以便更有效地激活或抑制免疫反应，促进受损组织的修复和再生，为未来免疫相关疾病的治疗及增强组织工程学应用提供了新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，单因素方差分析和LSD-t事后检验。
1.2 时间及地点实验于2022年7月至8月在山西中医药大学科研实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康24只SPF级SD大鼠，雌雄各半，体质量(216±21) g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2019-0010。按随机数字表分笼后饲养于山西中医药大学实验动物中心SPF级动物实验室，温度控制在20-25 ℃，湿度控制在30%-50%。
实验各阶段对动物的处理均严格遵循中国科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[7]，并于2021-03-04获得山西中医药大学动物伦理委员会批准，伦理编号：2021DW036。
1.3.2 艾绒与药饼制备六味地黄组方药粉包括山药、熟地、山茱萸肉、泽泻、牡丹皮和茯苓，组方所需药物均购自山西中医药大学附属医院。组方药物打碎成粉后过90目筛，并采用1∶1比例将药粉与赋形剂混匀后调和成泥，使用规格相同的模具，制备底径约0.8 cm，高0.2 cm，质量为(0.12±0.03) g的药饼，表面刺5个小孔备用。
艾绒由北京同仁堂中药饮片有限责任公司提供，批号：180826。采用统一规格模具制备艾炷，约为底径0.5 cm及高0.7 cm的圆锥形，质量(0.052±0.015) g，保存备用。
1.3.3 主要仪器及试剂注射用环磷酰胺(批号：22011925)，江苏恒瑞医药股份有限公司；艾绒(批号：180826)，北京同仁堂中药饮片有限责任公司；氨基甲酸乙酯(批号：18221559910)，阜阳曼林生物技术有限公司；PARIS总RNA提取试剂盒及Qubit定量，美国Thermo公司；Oligo(dT)磁珠及Illumina Novaseq6000，武汉赛维尔生物技术有限公司；血细胞分析仪(F580)，四川迈克生物科技股份有限公司。
1.4 实验方法

1.4.1 分组及建模将大鼠称质量后适应性喂养7 d后，随机分为空白组、模型组和隔药饼灸组，每组8只。参照以往文献方法进行免疫抑制模型制备[8]，通过观察免疫功能低下状态以及动物死亡情况，采用生理盐水配置环磷酰胺溶液。模型组与隔药饼灸组大鼠腹腔注射环磷酰胺(35 mg/kg，连续3 d)制备免疫抑制模型；空白组大鼠每日腹腔注射等量生理盐水。模型组干预结束后腹主动脉采血，行血常规检测，以白细胞数量(1.5-2.9)×109 L-1作为造模成功标准[9]。造模结束后空白组与模型组不做干预，隔药饼灸组在大鼠中脘、神阙、关元及足三里穴位进行艾炷与药饼结合的隔药饼灸干预，连续10 d，1次/d，干预结束后次日取材。

1.4.2 干预方法造模后次日进行干预，选取“神阙”“关元”“中脘”“足三里(双)”施灸。穴位定位参照《实验针灸学》中动物穴位定位图谱、《实验动物常用穴位名称与定位第2部分：大鼠》以及拟人比照法[10-11]。“神阙”位于脐正中央，剑突与耻骨联合上缘的连线下三等分点[12]；“关元”穴位于脐下约25 mm，第4对乳头连线与前正中线交点下2分处[13]；中脘位于脐上约20 mm，脐与剑突连线取中点；足三里位于膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处，左右各一穴。穴位示意图见图1。
1.4.3 取材干预后次日进行取材，首先将体积分数20%氨基甲酸乙脂溶液按200 mg/kg剂量腹腔注射麻醉大鼠，然后迅速腹主动脉取血2.5 mL于EDTA抗凝管中，混匀后冰上保存，待后续血常规检测。迅速摘取脾脏组织，生理盐水清洗至无血迹，滤纸吸干水分后将脾脏3等分，中段1/3液氮速冻后置于-80 ℃保存，后续转录组测序检测由武汉赛维尔生物科技有限公司完成。
1.5 主要观察指标
1.5.1 血常规检测血细胞分析仪检测外周血白细胞数量。
1.5.2 总RNA抽提及质检采用PARIS试剂盒提取脾脏总RNA。利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性(28S:18S≥1.5)，检验合格后进行建库及质检，随后使用qubit定量文库，选用Illumina Novaseq6000仪器，对最终配对的150 bp的末端数据进行后续分析。数据库构建及测序都交由武汉赛维尔生物技术有限公司完成。
1.5.3 筛选差异表达基因根据测序公司提供矩阵数据导入至DESeq2软件对不同样本组之间筛选差异表达基因，满足|log2FC|≥1和P≤0.05差异表达范围筛选两组之间的差异基因。利用仙桃学术(https://www.xiantaozi.com)对矩阵数据模型组与空白组及隔药饼灸组与模型组的差异基因进行火山图、热图及韦恩图的绘制。
1.5.4 分析GO及KEGG功能富集采用TopGO (http://geneontology.org ) 对全部差异基因、上调差异基因、下调差异基因分别作为目的基因集进行GO功能富集分析。操作方法为将全部基因作为背景列表，目的基因列表作为从背景列表中筛选出来的候选列表，利用Fisher精确检验计算代表GO功能集在目的基因列表中是否显著富集的P值，再对P值经Benjamini & Hochberg多重检验纠正后得到FDR，随后对生物学过程(biological process，BP)、细胞定位(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)进行分析。利用KEGG数据库(http://www.kegg.jp) 进行KEGG富集分析。
1.5.5 构建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络从STRING 蛋白质相互作用网络数据库(http://string-db.org)中查询和下载该物种的蛋白质相互作用网络，从而构建差异表达基因蛋白质相互作用网络，采用Blastx或者Blastp将基因与近源物种的蛋白质序列库进行同源比对，通过将基因序列编号映射于近源物种的蛋白质相互作用网络，从而构建差异基因蛋白质相互作用网络。随后选用cytoscape软件将差异基因进行网络可视化。
1.5.6 分析DisGeNET及Reactome功能富集利用DisGeNET
疾病数据库(https://www.disgenet.org/)对筛选基因相关疾病类型的功能进行注释和归类。利用Reactome数据库(https://reactome.org/)对相关代谢通路注释和归类。操作方法均与GO功能富集相同。
1.6 统计学分析实验结果采用SPSS 24.0统计软件进行分析。计量资料均以x±s表示，将满足正态分布的计量资料采用单因素方差分析，不满足正态分布结果采用非参数检验分析。单因素方差分析结果根据是否满足方差齐性，事后比较中，满足方差齐性采用LSD-t检验，不满足方差齐性采用Dunnett’s检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

环磷酰胺作为烷化剂类抗肿瘤药物，能诱导免疫抑制的发生，抑制细胞与体液免疫，并造成DNA结构损伤，因此常被应用于构建卵巢早衰[14-15]、再生障碍性贫血等多种免疫抑制相关疾病模型[16-17]。该实验血常规结果表明，在崔瑾等[9]研究基础上，通过环磷酰胺构建免疫抑制模型，模型组白细胞数量控制在2.05×109 L-1，提示模型制备成功。

隔药饼灸作为艾灸治疗手段之一，能够有效调整脏腑功能，具有益气补虚、温经散寒的功效。课题组前期的多项研究表明隔药饼灸干预环磷酰胺所致免疫抑制模型有效[18-21]，隔药饼灸能够通过对直接干预PD-1，以及通过FBXO38抑制PD-1泛素化途径，调控免疫检查点分子PD-1；通过对共刺激分子CD28及共抑制分子细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)的竞争性途径，共同调控T细胞的活性，还能通过抑制共抑制分子T细胞免疫球蛋白和黏蛋白域4 (T-cell immunoglobulin and mucin domain 4，TIM-4)，促进巨噬细胞途径等，调节多种免疫胞的活性，进而改善免疫抑制状态。为了更全面地认识隔药饼灸作用的机制，将正常大鼠、免疫抑制模型组及隔药饼灸组大鼠进行了RNA-seq的转录组测序分析，通过高通量筛选出差异表达的基因和蛋白，以便更好地认识隔药饼灸治疗的生物机制途径。
将通过质量控制的样本进行测序后，对不同组基因进行筛选，确定差异性的表达。聚类热图的结果显示，空白组基因序列无明显分离，但是模型组及隔药饼灸组差异显著，说明两组样本的基因在模型制备及干预后有了较大的变化。火山图分析可见，在模型制备及干预后，有大量的基因差异性表达。通过DESeq2分析不同样本组之间差异表达基因，有1 461个差异基因在免疫抑制模型制备后下调，经隔药饼灸干预后，又有159个基因上调。对上述结果有交集的基因进行PPI网络分析，发现Oasl，Oas2，Isg15，Herc6，Mx2，Helz2及Mx1等在隔药饼灸干预的网络核心区域，因此可作为隔药饼灸机制研究的关键靶点。
课题组前期的研究已经表明，隔药饼灸的一个调节途径就是针对免疫反应及相关的免疫细胞，其中对免疫检查点的共抑制分子PD-1，CTLA-4及TIM-4等有明显作用。在文章中，通过对GO富集分析可知，在主要生物学过程中，免疫抑制模型就是以免疫应答及免疫进程的调节为主，隔药饼灸的干预也能够在免疫进程发挥重要的调节作用，印证了课题组之前研究的方向。同时，KEGG富集分析筛选结果也提供了新的思路，即隔药饼灸的调节还有对免疫球蛋白IgA的肠道免疫以及肾功能的影响途径。
结合前期基础与文献检索，对文章筛选的Oasl，Oas2，Isg15，Herc6，Mx2，Helz2及Mx1等基因进行分析，发现上述基因与抗病毒感染、炎症反应以之间有密切的联系，上述基因仅Mx2有与艾灸之间的研究报道[22]，该报道显示，与正常大鼠相比，吸入一定量艾烟的大鼠Mx2含量升高，RNA-seq测序结果与qRT-PRC结果相同。因此，后续可以通过更多的研究，验证相关基因是否能作为隔药饼灸的特异性治疗的方向。
寡腺苷酸合成酶样蛋白(oligoadenylate synthetase ubiquitin-like，Oasl)基因编码OAS蛋白的酶，OAS蛋白是先天免疫系统中的重要组成部分，参与病毒感染的防御。OAS蛋白通过与病毒RNA结合，启动病毒RNA的降解，从而阻止病毒的复制[23]。同时Oasl与多种病毒感染有关，如HIV和甲型H1N1流感等。目前关于艾灸抗病毒的相关报道不多，张焕霞等[24]研究表明艾灸能够辅助提高HIV/AIDS患者的血清CD4+水平。
寡腺苷酸合成酶2(oligoadenylate synthase 2，Oas2)与Oasl类似，也是干扰素的调节因子，Oas2可以促进ISGFs的表达，进而增强干扰素α/β的抗病毒活性[25]。今后是否可以将艾灸作为抗病毒的辅助治疗手段进行选择，可将Oasl及Oas2作为切入点进行研究。
抗黏病毒蛋白1(major histocompatibility complex class Ⅰ，Mx1)和抗黏病毒蛋白2(major histocompatibility complex classⅡ，Mx2)均编码白细胞介素诱导的肌细胞蛋白X，同时Mx蛋白是干扰素α/β的效应因子，能够有效抑制病毒的复制。Mx1和Mx2能够阻止病毒复制并增强对RNA病毒的清除[26]。它们能够被Ⅰ型和Ⅱ型干扰素等激活表达，是广谱抗RNA病毒效应分子，在病毒感染后快速被激活，发挥直接的抗病毒活性，是自然免疫的重要组成部分。XU等[22]的研究也表明，在一定浓度艾烟刺激下，会提高肺部组织Mx2的含量。
锌指解旋酶2(Helicase With Zinc Finger 2，Helz2)是一种属于核蛋白家族的转录因子，它的表达是由干扰素处理引起，并且在包括RNA处理、基因表达调控、发育、病毒感染中起重要作用[27]。Helz2是脂质代谢中关键的转录调控因子[28]，同时可以通过对线粒体的调控，影响在与昼夜相关的BMAL1调控通路[29-30]。
干扰素诱导基因15(interferon-stimulated gene 15，ISG15)是一种重要的抗病毒蛋白基因，属于泛素类似物(ubiquitin-like modifier)家族。它可以被Ⅰ型干扰素等诱导表达。ISG15在流感病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒等多种病毒感染中发挥抗病毒作用[31]。ISG15基因敲除小鼠对病毒更易感[32]。ISG15具有抗病毒活性的关键在于它可以通过ISGylation抑制病毒蛋白合成，降解病毒蛋白，从而直接抑制病毒复制，并激活抗病毒相关蛋白如PKR、RIG-I等。同时ISG15还能通过其他机制参与抗病毒，如自噬、应激颗粒腐蚀病毒等[33]。
HECT和RLD结构域含有E3泛素蛋白连接酶家族成员6(HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase family member 6，Herc6)是重要的抗病毒基因，编码的蛋白质是Herpes病毒抑制因子，可以抑制疱疹病毒的复制[34]。同时Herc6与炎症和肿瘤等有关[35]，可以调节炎症因子的表达，并抑制肿瘤细胞的生长。
上述7个基因均在抗病毒中发挥着重要的作用，不过目前对于艾灸的抗病毒相关研究报道并不多见，但是自古中国就有用艾烟等手段在“时病温疫”中驱赶病邪的记载，《肘后备急方》便记有“断瘟病令不相染，密以艾灸病人床四角，各一壮，佳也”。因此，艾灸是否在今后能更多的应用于抗病毒相关的疾病的治疗中，还有待更多的研究证实，而Oasl，Oas2，Mx1，Mx2，Helz2，Isg15及Herc6等基因可以作为目标靶点之一。
由上述结果可知，隔药饼灸作为一种干预手段，可能对多个不同的途径进行影响，从而对机体进行调节，发挥治疗作用。因此，进一步对隔药饼灸可能影响的代谢途径及疾病相关分析结果分析，隔药饼灸影响的代谢途径主要以中性粒细胞脱颗粒、CD14相关通路、PDGF信号转导通路、淋巴细胞和非淋巴细胞之间的免疫调节相互作用途径、补体级联的调节途径还有FCGR激活途径等有关。课题组前期研究证实了隔药饼灸确实能通过淋巴细胞免疫调节途径、补体级联的调节途径等发挥作用。中性粒细胞脱颗粒途径是先天免疫反应和炎症过程中重要的调控，可以通过释放炎性递质、趋化因子等参与炎症反应，也可以通过释放生长因子等促进组织修复，还能释放凋亡小体传递抗原信号[36]。CD14参与的主要通路有Toll样受体通路，能够激活下游MyD88信号通路，诱导炎症细胞因子的表达[37]，还能激活RhoGTP酶，影响细胞滑膜迁移[38]。PDFG信号通路主要参与血管平滑肌细胞的重塑，促进新生血管的生成，PDGF信号的失调会导致肿瘤、动脉粥样硬化等疾病的发生[39]。Fc受体主要介导免疫球蛋白G依赖性效应，主要表达在巨噬细胞和中性粒细胞表面，发挥吞噬作用，也能引起肥大细胞及中性粒细胞释放炎性因子[40]，还可以在B细胞表面参与B细胞受体传导及激活[41]。疾病注释分析也显示，隔药饼灸能够在白血病、类风湿性关节炎、哮喘等免疫系统疾病中有一定的调节作用。
综上所述，隔药饼灸干预免疫抑制的RNA-seq结果预测出多个相关的核心调控基因或蛋白。此外GO及KEGG富集分析不仅为课题组前期研究提供了高通量结果的数据支持，更是在病毒研究、心血管研究以及更多的免疫细胞相关研究的方向，提供了新的思路，也有待更丰富的基础研究的验证及探索。
文章也存在一定的不足之处，其中实验未能对免疫调节的全面效果进行报道，根据造模及治疗条件，对中长期免疫抑制的隔药饼灸效果也需要更多的研究探索，同时，文章是在课题组既往对免疫检查点研究的基础上展开的延伸，因此是通过高通量测序技术筛选更多的与隔药饼灸调控的潜在基因以及相关的调控机制，但是较为遗憾的是，文章并未对预测的基因进行功能的验证，因为课题组计划在后续的研究中，将从优化实验模型和条件、扩展实验周期入手，重点对转录组预测结果的基因功能和对免疫抑制的具体调控进行详细的验证，完善系列研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

隔药饼灸调节大鼠免疫抑制机制的转录组测序分析

Mechanism of immunosuppression in rats by herb-partitioned moxibustion based on transcriptome sequencing technology

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