长链非编码RNA H19抑制地塞米松致成骨细胞凋亡的作用

doi:10.12307/2023.500

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (28): 4513-4518.doi: 10.12307/2023.500

• 骨组织构建 bone tissue construction • 上一篇下一篇

长链非编码RNA H19抑制地塞米松致成骨细胞凋亡的作用

杨慧霞1，2，白志刚2，3，迟宏扬1，2，马天龙2，4，马胜超2，4，姜怡邓2，4

宁夏医科大学，1临床医学院，4基础医学院，宁夏回族自治区银川市 750004；2国家卫生健康委代谢性心血管疾病研究重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004；3宁夏回族自治区人民医院，宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2022-06-28 接受日期:2022-08-19 出版日期:2023-10-08 发布日期:2023-01-29
通讯作者: 姜怡邓，博士，教授，宁夏医科大学基础医学院，宁夏回族自治区银川市 750004；国家卫生健康委代谢性心血管疾病研究重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004 马胜超，博士，副教授，宁夏医科大学基础医学院，宁夏回族自治区银川市 750004；国家卫生健康委代谢性心血管疾病研究重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:杨慧霞，女，1996 年生，宁夏回族自治区彭阳县人，汉族，宁夏医科大学在读硕士，主要从事激素性股骨头坏死方面的研究。
基金资助:
宁夏回族自治区重点研发计划项目(2020BFH02001)，项目负责人：白志刚；国家自然科学基金(82060412)，项目负责人：白志刚；中国医学科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费项目(2019PT330002)，项目负责人：姜怡邓

Effects of long non-coding RNA H19 on apoptosis of osteoblasts induced by dexamethasone

Yang Huixia1, 2, Bai Zhigang2, 3, Chi Hongyang1, 2, Ma Tianlong2, 4, Ma Shengchao2, 4, Jiang Yideng2, 4

1Clinical School of Medicine, 4Basic School of Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2National Health Commission Key Laboratory of Metabolic Cardiovascular Disease Research, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 3Peoples Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2022-06-28 Accepted:2022-08-19 Online:2023-10-08 Published:2023-01-29
Contact: Jiang Yideng, MD, Professor, National Health Commission Key Laboratory of Metabolic Cardiovascular Disease Research, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Basic School of Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China Ma Shengchao, MD, Associate professor, National Health Commission Key Laboratory of Metabolic Cardiovascular Disease Research, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Basic School of Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Yang Huixia, Master candidate, Clinical School of Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2National Health Commission Key Laboratory of Metabolic Cardiovascular Disease Research, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
Key Research and Development Program Project of Ningxia Hui Autonomous Region, No. 2020BFH02001 (to BZG); National Natural Science Foundation of China, No. 82060412 (to BZG); the Fundamental Research Funds for Central-level Public Welfare Research Institutes of Chinese Academy of Medical Sciences, No. 2019PT330002 (to JYD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

凋亡：是一种程序性细胞死亡，其特征是进行性的核和细胞质收缩、染色质浓缩和凋亡小体形成。凋亡是半胱氨酸蛋白酶不可逆有限水解底物的级联反应过程，一旦激活可导致细胞死亡。最常见的凋亡指标为Bcl-2和Bax，Bcl-2降低，Bax增高，细胞凋亡增加。
长链非编码RNA(lncRNA)：是长度大于200 nt不编码蛋白的非编码RNA，其广泛参与生物进化、胚胎发育、物质代谢以及肿瘤发生等多种生命活动的调控，并在细胞生长、增殖、自噬及凋亡等生命活动中具有重要的调节作用。

背景：激素性股骨头坏死的发病机制尚不清楚，成骨细胞凋亡与其关系密切。
目的：探讨长链非编码RNA H19(long Non-Coding RNA H19，lncRNA H19)在地塞米松促进成骨细胞凋亡中的作用。
方法：培养小鼠成骨细胞MC3T3-E1，分为对照组(不处理)和地塞米松组(1 μmol/L 地塞米松处理24 h)，采用Western blot检测各组细胞Bax、Bcl-2和细胞外调节蛋白激酶(p-ERK1/2/ERK1/2)蛋白的表达，流式细胞术和细胞活力染色检测细胞凋亡情况，qRT-PCR检测lncRNA H19的表达。转染lncRNA H19阴性对照(ad-NC)和lncRNA H19过表达质粒(ad-lncRNA H19)并给予地塞米松干预24 h后，采用细胞活力染色、Western blot和流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡情况；使用MAPK-ERK通路抑制剂PD98059处理MC3T3-E1细胞24 h，Western blot检测各组细胞Bax和Bcl-2蛋白的表达。

结果与结论：①与对照组相比，地塞米松组MC3T3-E1细胞凋亡率升高，lncRNA H19相对表达降低(P < 0.01)，MAPK/ERK信号通路被抑制；②上调MC3T3-E1细胞lncRNA H19后，细胞凋亡率降低(P < 0.01)，MAPK/ERK信号通路被激活；③与地塞米松+ad-lncRNA H19组相比，地塞米松+ad-lncRNA H19+PD98059组细胞Bax蛋白表达增加(P < 0.01)，Bcl-2蛋白表达降低(P < 0.01)；④提示过表达lncRNA H19通过激活MAPK-ERK信号通路抑制地塞米松诱导的MC3T3-E1细胞凋亡。

https://orcid.org/0000-0002-7572-544X(杨慧霞)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: lncRNA H19, MAPK/ERK信号通路, 地塞米松, MC3T3-E1细胞, 凋亡

Abstract: BACKGROUND: The pathogenesis of steroid-induced osteonecrosis of femoral head is still unclear, which is closely related to osteoblast apoptosis.
OBJECTIVE: To investigate the role of long non-coding RNA H19 (lncRNA H19) in dexamethasone-induced osteoblast apoptosis.
METHODS: Mouse osteoblasts (MC3T3-E1) were cultured and divided into control group (no treatment) and dexamethasone group (treated with 1 μmol/L dexamethasone for 24 hours). Western blot was used to detect the protein expression levels of Bax, Bcl-2, and p-ERK1/2/ERK1/2. Flow cytometry and cell viability staining were used to detected cell apoptosis. qRT-PCR was performed to detect the expression of lncRNA H19. lncRNA H19 negative control plasmid (ad-NC) and lncRNA H19 overexpression plasmid (ad-lncRNA H19) were transfected into MC3T3-E1 cells, followed by 24 hours of dexamethasone intervention. Cell apoptosis of MC3T3-E1 was detected using cell viability staining, western blot assay, and flow cytometry. MC3T3-E1 cells were treated with MAPK-ERK pathway inhibitor (PD98059) for 24 hours and western blot was used to detect the protein expression levels of Bax and Bcl-2.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the apoptotic rate of MC3T3-E1 cells was increased in the dexamethasone group (P < 0.01), while the expression of lncRNA H19 was decreased (P < 0.01) and the MAPK/ERK signaling pathway was inhibited. Up-regulation of lncRNA H19 in MC3T3-E1 cells reduced the apoptosis of cells (P < 0.01) and activated the MAPK/ERK signaling pathway. MC3T3-E1 cells treated with dexamethasone+ad-lncRNA H19+PD98059 showed an increase in the expression of Bax (P < 0.01) and a decrease in the expression of Bcl-2 (P < 0.01) compared with the cells treated with dexamethasone+ad-lncRNA H19. These findings indicate that overexpression of lncRNA H19 can inhibit dexamethasone-induced apoptosis in MC3T3-E1 cells by activating the MAPK-ERK signaling pathway.

Key words: lncRNA H19, MAPK/ERK signaling pathway, dexamethasone, MC3T3-E1 cell, apoptosis

中图分类号:

杨慧霞, 白志刚, 迟宏扬, 马天龙, 马胜超, 姜怡邓. 长链非编码RNA H19抑制地塞米松致成骨细胞凋亡的作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(28): 4513-4518.

Yang Huixia, Bai Zhigang, Chi Hongyang, Ma Tianlong, Ma Shengchao, Jiang Yideng. Effects of long non-coding RNA H19 on apoptosis of osteoblasts induced by dexamethasone[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(28): 4513-4518.

图/表（结果） 4

2.1 地塞米松对MC3T3-E1细胞凋亡的影响细胞活力染色结果显示，与对照组相比，地塞米松组红色荧光(死细胞)增多，绿色荧光(活细胞)减少，细胞凋亡增加；Western blot结果显示，与对照组相比，地塞米松组细胞Bax蛋白表达增加(P < 0.01)，Bcl-2蛋白表达降低(P < 0.01)；流式细胞术检测显示，与对照组相比，地塞米松组细胞凋亡率显著增加(P < 0.01)，见图1。

2.2 MC3T3-E1细胞中lncRNA H19的表达 qRT-PCR检测MC3T3-E1细胞中lncRNA H19相对表达。结果显示，与对照组相比，地塞米松组细胞lncRNA H19的表达降低(P < 0.01)；与对照组相比，在ad-NC组lncRNA H19的表达无显著变化(P > 0.05)；与ad-NC组相比，ad-lncRNA H19组lncRNA H19的表达增加(P < 0.01)。以上结果表明，与正常MC3T3-E1细胞相比，地塞米松组MC3T3-E1细胞中lncRNA H19呈低表达；lncRNA H19过表达体外构建成功，并能在MC3T3-E1细胞中稳定表达，见图2。

2.3 过表达lncRNA H19抑制地塞米松诱导的MC3T3-E1细胞的凋亡细胞活力染色结果显示，与地塞米松+ad-NC组相比，地塞米松+ad-lncRNA H19组细胞红色荧光(死细胞)减少，绿色荧光(活细胞)增多，MC3T3-E1细胞凋亡数明显降低；Western blot结果显示，与地塞米松+ad-NC组相比，地塞米松+ad-lncRNA H19组细胞Bax蛋白表达降低(P < 0.01)，Bcl-2蛋白表达增加(P < 0.01)；流式细胞术检测显示，与地塞米松+ad-NC组相比，地塞米松+ad-lncRNA H19组细胞凋亡率显著降低(P < 0.01)。表明过表达lncRNA H19可抑制地塞米松诱导的MC3T3-E1细胞凋亡，见图3。

2.4 过表达lncRNA H19通过激活MAPK/ERK信号通路抑制地塞米松诱导的MC3T3-E1细胞凋亡 Western blot结果显示，与对照组相比，地塞米松组细胞p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达降低(P < 0.01)；与地塞米松+ad-NC组相比，地塞米松+ad-lncRNA H19组细胞p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达增加(P < 0.01)；与地塞米松+ad-lncRNA H19组相比，地塞米松+ad-lncRNA H19+PD98059组细胞Bax蛋白表达增加(P < 0.01)，Bcl-2蛋白表达降低(P < 0.01)。表明过表达lncRNA H19可通过激活MAPK/ERK信号通路抑制地塞米松诱导的MC3T3-E1细胞凋亡，见图4。

参考文献

[1] Yang F, Zhang X Song T, et al. Huogu injection alleviates SONFH by regulating adipogenic differentiation of BMSCs via targeting the miR-34c-5p/MDM4 pathway. Gene. 2022;838:146705.
[2] Liang XZ, Luo D, Chen YR, et al. Identification of potential autophagy-related genes in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head via bioinformatics analysis and experimental verification. J Orthop Surg Res. 2022;17(1):86.
[3] 魏治文, 宋红梅. 中西医治疗激素性股骨头坏死的研究进展[J]. 按摩与康复医学,2021,12(11):51-53+58.
[4] Fan ZQ, Bai SC, Xu Q, et al. Oxidative Stress Induced Osteocyte Apoptosis in Steroid‐Induced Femoral Head Necrosis. Orthop Surg. 2021;13(7):2145-2152.
[5] Wang B, Gong S, Shao W, et al. Comprehensive analysis of pivotal biomarkers, immune cell infiltration and therapeutic drugs for steroid-induced osteonecrosis of the femoral head. Bioengineered. 2021; 12(1):5971-5984.
[6] WEINSTEIN RS, NICHOLAS RW, MANOLAGAS SC. Apoptosis of osteocytes in glucocorticoid-induced osteonecrosis of the hip. J Clin Endocrinol Metab. 2000;85(8):2907-2912.
[7] Wang G, Zhang L, Yan C, et al. Upregulation of microRNA-576-5p protects from steroid-induced avascular necrosis of the femoral head by suppressing ANXA2. Cell Cycle. 2021;21(1):49-62.
[8] Zheng Yl, Song G, Guo Jb, et al. Interactions Among lncRNA/circRNA, miRNA, and mRNA in Musculoskeletal Degenerative Diseases. 2021;9:753931.
[9] Peng S, Cao L, He S, et al. An Overview of Long Noncoding RNAs Involved in Bone Regeneration from Mesenchymal Stem Cells. 2018; 2018:8273648.
[10] Silva Am, Moura Sr, Teixeira Jh, et al. Long noncoding RNAs: a missing link in osteoporosis. 2019;7:10.
[11] Li X, Li Q, Jin X, et al. Long non-coding RNA H19 knockdown inhibits the cell viability and promotes apoptosis of thyroid cancer cells through regulating the PI3K/AKT pathway. 2019;18(3):1863-1869.
[12] 孔劲松, 陈滔, 郑鑫, 等丹参素对地塞米松诱导MC3T3-E1成骨细胞损伤的保护作用 [J]. 江苏医药,2022,48(5):436-440.
[13] Ronchetti S, Ayroldi E, Ricci E, et al. A Glance at the Use of Glucocorticoids in Rare Inflammatory and Autoimmune Diseases: Still an Indispensable Pharmacological Tool? Front Immunol. 2021;11: 613435.
[14] Buttgereit F, Palmowski A. How to taper glucocorticoids in inflammatory rheumatic diseases? A narrative review of novel evidence in rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, and giant cell arteritis. Joint Bone Spine. 2022;89(1):105285.
[15] 胡兆林, 常峰. 激素性股骨头坏死发病机制及相关信号通路研究进展[J]. 医学综述,2022,28(3):466-470.
[16] Peng CH, Lin WY, Yeh KT, et al. The molecular etiology and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis. Tzu Chi Medical J. 2021;33(3): 212-223.
[17] Kar R, Riquelme MA, Hua R, et al. Glucocorticoid-Induced Autophagy Protects Osteocytes Against Oxidative Stress Through Activation of MAPK/ERK Signaling. JBMR Plus. 2018;3(4):e10077.
[18] Yu Y, Wang S, Zhou Z. Cartilage Homeostasis Affects Femoral Head Necrosis Induced by Methylprednisolone in Broilers. Int J Mol Sci. 2020;21(14):4841.
[19] Li J, Xu X, Wei C, et al. Long noncoding RNA NORAD regulates lung cancer cell proliferation, apoptosis, migration, and invasion by the miR-30a-5p/ADAM19 axis. 2020;13(1):1-13.
[20] Zhu X, Bu F, Tan T, et al. Long noncoding RNA RP11-757G1.5 sponges miR-139-5p and upregulates YAP1 thereby promoting the proliferation and liver, spleen metastasis of colorectal cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2020;39(1):207.
[21] Li L, Wang H, Li H, et al. Long noncoding RNA BACE1-antisense transcript plays a critical role in Parkinson’s disease via microRNA-214-3p/Cell death-inducing p53-target protein 1 axis. Bioengineered. 2022; 13(4):10889-10901.
[22] Fico A, Fiorenzano A, Pascale E, et al. Long non-coding RNA in stem cell pluripotency and lineage commitment: functions and evolutionary conservation. Cell Mol Life Sci. 2019;76(8):1459-1471.
[23] Chen J, Ao L, Yang J. Long non-coding RNAs in diseases related to inflammation and immunity. Ann Transl Med. 2019;7(18):494.
[24] Li T, Jiang H, Li Y, et al. Estrogen promotes lncRNA H19 expression to regulate osteogenic differentiation of BMSCs and reduce osteoporosis via miR-532-3p/SIRT1 axis. Mol Cell Endocrinol. 2021;527:111171.
[25] Chen S, Liu D, Zhou Z, et al. Role of long non-coding RNA H19 in the development of osteoporosis. Mol Med. 2021;27(1):122.
[26] Li T, Xu Y, Wang Y, et al. Differential expression profiles of long noncoding RNAs and mRNAs in human bone marrow mesenchymal stem cells after exposure to a high dosage of dexamethasone. Stem Cell Res Ther. 2021;12(1):9.
[27] Wang H, Wei P, Zhang Y, et al. LncRNA TCONS_00023297 Regulates the Balance of Osteogenic and Adipogenic Differentiation in Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and the Coupling Process of Osteogenesis and Angiogenesis. Front Cell Dev Biol. 2021;9:697858.
[28] Huang G, Zhao G, Xia J, et al. FGF2 and FAM201A affect the development of osteonecrosis of the femoral head after femoral neck fracture. Gene. 2018;652:39-47.
[29] Chen X, Li J, Liang D, et al. LncRNA AWPPH participates in the development of non‑traumatic osteonecrosis of femoral head by upregulating Runx2. Exp Ther Med. 2020;19(1):153-159.
[30] 杨剑云, 周宇. 长链非编码RNA HOXD-AS1在疾病中作用机制研究进展[J]. 新医学,2021,52(1):1-4.
[31] 张向阳. LncRNA EPIC1保护成骨细胞免受地塞米松损伤[D]. 苏州: 苏州大学,2019.
[32] KIM B, LEE KY, PARK B. Icariin abrogates osteoclast formation through the regulation of the RANKL-mediated TRAF6/NF-κB/ERK signaling pathway in Raw264.7 cells. Phytomedicine. 2018;51:181-190.
[33] Klomp Je, Klomp Ja, Der Cj. The ERK mitogen-activated protein kinase signaling network: the final frontier in RAS signal transduction. Biochem Soc Trans. 2021;49(1):253-267.

引言

激素性股骨头坏死(steroid-induced osteonecrosis of femoral head，SONFH)是长期应用激素类药物导致股骨头血液供应受损、成骨细胞死亡、股骨头承重区骨小梁断裂及股骨头塌陷的一种常见和多发病[1-2]，影响治疗效果的因素主有贻诊和晚期治疗[3]。目前认为其主要机制是由于激素在体内长期蓄积导致血管内皮细胞损伤、脂肪代谢紊乱、细胞凋亡和血管内凝血[4-5]。然而，激素性股骨头缺血坏死的确切机制仍不清楚。自从2000年WEINSTEIN等[6]报道了人类股骨头坏死中的骨细胞凋亡以来，细胞凋亡的理论得到了广泛的研究。WANG等[7]也证明了糖皮质激素可诱导成骨细胞凋亡，是导致SONFH发生的重要致病因素。长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是近年来发现的一类由不同种类的RNA分子组成的不编码或翻译任何蛋白质的长度大于200个核苷酸的功能性RNA分子，在表观遗传、转录和转录后水平调控细胞凋亡、坏死和自噬等多种生物学过程[8]。研究表明，lncRNAs可以调节骨骼的发育和再生，并在不同骨科疾病的发病机制中起作用，如骨质疏松症、骨关节炎、骨肉瘤和椎间盘退行性变[8-10]。LI等[11]的研究也发现，沉默lncRNA H19抑制了细胞活力，促进了FTC-133和TPC-1 TC细胞的凋亡，伴随着Bax和caspase 3的表达增加，并且抑制了Bcl-2的表达。但关于lncRNA H19是否在地塞米松诱导的SONFH患者MC3T3-E1细胞的凋亡过程中发挥作用仍需进一步探索。因而，此次研究以MC3T3-E1细胞为研究对象，旨在探讨lncRNA H19在地塞米松致MC3T3-E1细胞凋亡过程中的作用，为激素性股骨头坏死疾病发生机制的研究提供新的理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，两组样本比较采用独立样本t检验，多个样本之间比较采用Oneway ANOVA检验。
1.2 时间及地点实验于2021年8月至2022年7月在宁夏医科大学国家卫生健康委代谢性心血管疾病研究重点实验室完成。
1.3 材料 MC3T3-E1小鼠成骨细胞株、α-MEM基础培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司；MAPK/ERK信号通路抑制剂(PD98059)、地塞米松购自上海MedChemExpress；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自上海Best bio公司；青霉素-链霉素和胰蛋白酶-EDTA消化液购自北京Solarbio公司；Bax抗体、Bcl-2抗体购自英国Abcam公司；β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京金桥有限公司；总RNA提取试剂盒购自北京天根生物技术有限公司；反转录和荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara公司；lncRNA H19引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；lncRNA H19过表达质粒(ad-lncRNA H19) 及阴性对照(ad-NC)购自上海吉玛制药有限公司。荧光定量PCR仪器购自耶拿分析仪器股份公司；电泳仪购自美Rio-Rad公式；激光共聚焦显微镜购自德国Zeiss公司。

1.4 实验方法
1.4.1 MC3T3-E1细胞培养及分组 MC3T3-E1小鼠成骨细胞，用含体积分数10%胎牛血清、1%双抗(青霉素-链霉素)的α-MEM培养基，于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养。当细胞融合度增长至70%时，分别以浓度为0 μmol/L和1 μmol/L的地塞米松干预[12]，其中0 μmol/L 地塞米松为对照组，1 μmol/L 地塞米松为地塞米松组，干预24 h后收集细胞用于后续实验。
1.4.2 细胞转染将MC3T3-E1细胞按3×105密度接种到6孔板，细胞融合度达70%左右，严格按照LipofectamineTM 2000试剂盒操作说明书进行转染操作，分别将2.5 μg lncRNA H19阴性对照和lncRNA H19过表达质粒加入125 μL无血清培养基中；2.5 μL LipofectamineTM2000脂质体与125 μL纯α-MEM培养基混匀，室温放置5 min后，将两者混匀，静置20 min。α-MEM纯培养基定容至2 mL，放入培养箱继续培养，转染6 h后，弃去旧的培养基，更换新的培养基继续培养。
1.4.3 细胞活力染色检测MC3T3-E1细胞活力将5×105个MC3T3-E1细胞接种于共聚焦培养皿中，待细胞融合至70%时，设置设置对照组(不做处理)、地塞米松组(地塞米松干预24 h)、地塞米松+ad-NC组(转染lncRNA H19阴性对照6 h后，换含地塞米松的α-MEM培养基继续培养24 h)和ad-lncRNA H19组(转染lncRNA H19过表达质粒6 h后，换含地塞米松的α-MEM培养基继续培养24 h)。弃去培养基，用PBS清洗3次，在15 mL离心管中加入2.5 mL PBS、2.5 μL Nuclei Dye、12.5 μL Dead Dye、1.5 μL Viable Dye，混合后，每个皿加入200 μL混合染料，于37 ℃孵育30 min，用PBS清洗3次，激光共聚焦显微镜观察细胞活力，红色(Cy3)表示死细胞；绿色(FITC)表示活细胞；蓝色(DAPI)表示细胞核。
1.4.4 流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡水平将2.5×106个MC3T3-E1细胞接种于入T25培养瓶中，待细胞融合至70%时，设置对照组(不做处理)、地塞米松组(地塞米松干预24 h)、地塞米松+ad-NC组(转染lncRNA H19阴性对照6 h后，换含地塞米松的α-MEM培养基继续培养24 h)和地塞米松+ad-lncRNA H19组(转染lncRNA H19过表达质粒6 h后，换含地塞米松的α-MEM培养基继续培养24 h)。弃去培养基，用PBS清洗2次，使用不含EDTA、不含酚红的胰酶消化MC3T3-E1细胞转入1.5 mL离心管中，1 000 r/min、4 ℃离心5 min，弃去上清，重复上述步骤2次。在避光条件下加100 μL结合液重悬细胞，再依次分别加入5 μL 7-AAD，5 μL PE，轻拨混匀后，避光静置15 min后，加入400 μL结合液，轻拨混匀后用滤膜过滤后，立即置于流式细胞仪检测细胞凋亡率改变。
1.4.5 qRT-qPCR检测MC3T3-E1细胞lncRNA H19的表达情况将2.5×106个MC3T3-E1细胞接种于入T25培养瓶中，待细胞融合至70%时，分别设置：对照组(不做处理)、地塞米松组(地塞米松干预24 h)、ad-NC组(转染lncRNA H19阴性对照6 h后，换正常α-MEM培养基继续培养24 h)和ad-lncRNA H19组(转染lncRNA H19过表达质粒6 h后，换正常α-MEM培养基继续培养24 h)。提取各组MC3T3-E1细胞的总RNA后反转录成cDNA后进行qRT-PCR的检测，扩增条件：预变性：95 ℃ 30 s；变性：95 ℃5 s；退火及延伸：55.8 ℃34 s；循环数40；以GAPDH作为内参，按照公式2-ΔΔCt分析lncRNA H19的表达水平。

公式如下：ΔΔCt=[Ct (目的基因) (待测样本)-Ct (GAPDH) (待测样本) ]-[Ct (目的基因) (校正样本) Ct (GAPDH) (校正样本) ]。基因引物序列见表1。

1.4.6 Western blot检测 MC3T3-E1细胞中Bax、Bcl-2和p-ERK1/2/ERK1/2蛋白的表达取MC3T3-E1细胞，分别设置：对照组(不做处理)、地塞米松组(地塞米松干预24 h)、地塞米松+ad-NC组(转染lncRNA H19阴性对照6 h后，换含地塞米松的α-MEM培养基继续培养24 h)、地塞米松+ad-lncRNA H19组(转染lncRNA H19过表达质粒6 h后，换含地塞米松的α-MEM培养基继续培养24 h)、地塞米松+ad-lncRNA H19+PD98059组(转染lncRNA H19过表达质粒6 h后，换含地塞米松和PD98059的α-MEM培养基继续培养24 h)，用来检测Bax、Bcl-2和p-ERK1/2/ERK1/2蛋白的表达。提取全蛋白后，BCA法进行蛋白浓度测定及定量，加入5X蛋白上样缓冲液于金属浴中99 ℃煮沸变性5 min，上样进行SDS-PAGE凝胶电泳后，0.3 A恒流电转2 h至PVDF膜，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，PBST洗涤3次，分别加入Bax、Bcl-2和p-ERK1/2ERK1/2一抗(稀释比例1∶1 000)4 ℃孵育过夜，PBST洗膜3次，使用辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释比例1∶5 000)37 ℃孵育2 h，PBST洗膜3次。最后在凝胶成像分析仪上成像分析，以β-actin或GAPDH为内参，采用Image J软件进行灰度分析，计算目的蛋白的相对表达。
1.5 主要观察指标 ①Western blot检测Bax、Bcl-2和p-ERK1/2/ERK1/2蛋白；②流式细胞术和细胞活力染色检测细胞凋亡水平；③qRT-PCR检测lncRNA H19 mRNA表达。
1.6 统计学分析采用Graphpad Prism 6.0统计软件对实验数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以x±s表示，两样本均数间结果的比较采取Student’s t检验，多个样本之间比较采用Oneway ANOVA检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经由宁夏医科大学统计学专家审核。

讨论

糖皮质激素常用于治疗严重急性呼吸综合征、器官移植、急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等疾病[13-15]。一般认为，糖皮质激素在生理条件下调节成骨细胞分化是正常骨发育所必需的，但过量的糖皮质激素会诱导成骨细胞和骨细胞凋亡[16]，从而造成骨形成减少、骨重建和修复不充分[17]。最近的一项研究表明，激素通过调节凋亡基因表达促进了肉鸡软骨细胞的凋亡，并诱导了股骨头坏死[18]，但地塞米松通过何种机制导致MC3T3-E1细胞凋亡目前尚未阐明。此次研究通过细胞活力染色、Western blot和流式细胞术等结果显示，与对照组相比，地塞米松组细胞凋亡水平明显增加，表明地塞米松可以促进MC3T3-E1细胞凋亡，提示抑制MC3T3-E1细胞凋亡对早期防治激素性股骨头坏死的发生具有重要价值。
LncRNAs是近年来发现的一类长度超过200个核苷酸的非蛋白编码调控RNA[19]，可通过多种方式对基因表达进行调控，影响编码基因的表达、稳定性及亚细胞定位，且lncRNA具有组织特异性。现在越来越多的证据支持lncRNA在多种生理和病理过程中发挥重要作用，包括细胞增殖[20]、细胞死亡[21]、干细胞多能性[22]、炎症和免疫[23]。新出现的研究还表明，lncRNA可以调节骨骼的发育和再生，并在不同骨科疾病的发病机制中起作用，如骨质疏松症、骨关节炎、骨肉瘤和椎间盘退行性变[24]。有研究表明下调lncRNA H19通过激活miR-185-5p/AKT轴抑制MC3T3-E1细胞增殖，从而使骨折预后不良。CHEN等[25]发现雌激素通过lncRNA H19介导的miR-532-3p/SIRT1轴调节骨髓间充质干细胞成骨分化，并缓解卵巢切除大鼠的骨质疏松症。近年来lncRNA在股骨头坏死中的作用逐渐受到关注。长期使用地塞米松诱导人骨髓间充质干细胞凋亡，细胞周期阻滞，抑制成骨分化，促进成脂分化，并呈剂量、时间依赖性[26-27]。HUANG等[28]在非创伤性股骨头坏死组织中发现lncRNA FAM201A表达显著低于股骨颈骨折组织，进行蛋白调控网络分析后发现成纤维细胞生长因子2、胰岛素样生长因子1和Ⅱ型胶原蛋白A1等表达升高，并证实成纤维细胞生长因子2是FAM201A的靶基因。CHEN等[29]研究表明LncRNA AWPPH可能通过上调Runx2参与非创伤性股骨头坏死的发生发展，可作为诊断非创伤性股骨头坏死的敏感指标。在此次研究中发现，与对照组相比，地塞米松组MC3T3-E1细胞lncRNA H19的表达水平降低，提示lncRNA H19参与了地塞米松诱导的MC3T3-E1细胞凋亡的过程并可能发挥负性调控作用。为了进一步明确lncRNA H19在地塞米松致MC3T3-E1细胞凋亡中的作用，作者将lncRNA H19过表达质粒转染至MC3T3-E1细胞中，细胞活力染色、Western Blot和流式细胞术结果显示，lncRNA H19过表达能够抑制地塞米松诱导的MC3T3-E1细胞凋亡，但为何lncRNA H19会抑制激素诱导的MC3T3-E1细胞凋亡的具体机制尚未清楚。
lncRNA 可通过多种信号通路影响成骨细胞增殖、分化和凋亡[30]，如lncRNA EIPCI通过Myc信号通路诱导成骨细胞增殖[31]；LINC00473通过Akt/Bad/B-2信号通路诱导成骨细胞凋亡[32]。MAPK信号通路在细胞增殖、分化和凋亡中发挥重要作用，其中ERK是MAPK细胞信号转导通路终末位置的一种蛋白激酶，也将信号从表面受体传导至细胞核的关键，与其磷酸化产物p-ERK共同参与细胞生长、发育、分化及凋亡等多种生理过程[33]。此次研究发现地塞米松组MC3T3-E1细胞p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达水平降低；过表达lncRNA H19后，p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达水平增加，表明过表达lncRNA H19可激活MC3T3-E1细胞MAPK-ERK信号通路；MAPK-ERK信号通路抑制剂(PD98059)处理MC3T3-E1细胞后，与地塞米松+ad-lncRNA H19组相比，地塞米松+ad-lncRNA H19+PD98059组MC3T3-E1细胞Bax蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达降低，结果表明过表达lncRNA H19可通过激活MAPK-ERK信号通路从而抑制地塞米松诱导的MC3T3-E1细胞凋亡。
综上所述，此次研究通过细胞活力、RT-qPCR、流式细胞术以及Western blot等手段得出过表达lncRNA H19能够通过激活MAPK-ERK信号通路抑制地塞米松引起的MC3T3-E1细胞凋亡。后续将通过建立动物模型，进一步明确lncRNA H19在激素性股骨头坏死中的具体作用机制，最终将其应用于激素性股骨头坏死疾病的临床治疗。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

长链非编码RNA H19抑制地塞米松致成骨细胞凋亡的作用

Effects of long non-coding RNA H19 on apoptosis of osteoblasts induced by dexamethasone

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	方兴艳, 田侦丽, 赵哲仪, 文平, 谢婷婷. 亚砷酸钠对人脐静脉内皮细胞损伤及鞘氨醇激酶1/1-磷酸鞘氨醇信号轴的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-7.
[2]	聂晨晨, 苏凯奇, 高静, 凡勇福, 阮晓迪, 袁洁, 段昭远, 冯晓东. 环状RNA调控脑缺血发病的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1286-1291.
[3]	崔连旭, 江文康, 陆大鸿, 许峻荣, 刘小翠, 王丙云. 临床级人脐带间充质干细胞对创伤性脑损伤大鼠神经功能的改善作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 835-839.
[4]	李启程, 邓进, 付小洋, 韩娜. 骨髓间充质干细胞来源外泌体对成肌细胞缺氧状态的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 853-859.
[5]	张晴, 高春兰, 于飞飞, 张正皓, 马芳, 高源, 李桂忠, 姜怡邓, 马胜超. 同型半胱氨酸致胰岛β细胞凋亡中肝配蛋白A型受体2 DNA甲基化升高[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 714-719.
[6]	李龙, 李光第, 石豪, 邓柯淇. 环状RNA作为内源性竞争RNA参与调控骨性关节炎的发生[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 751-757.
[7]	李志超, 谭国庆, 苏辉, 徐展望, 薛海鹏. 非编码RNAs作为潜在治疗靶点在脊髓损伤中的调控效应[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 758-764.
[8]	袁长深, 官岩兵, 李哲, 容伟明, 廖书宁, 陈乐伟, 梅其杰, 段戡. 骨关节炎坏死性凋亡关键基因的筛选与验证[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 695-700.
[9]	赵思琦, 杜鹃, 屈海峰, 李建民, 张宇新, 刘俊杰. 丰富环境联合褪黑素对SAMP8小鼠学习记忆功能及脑神经细胞凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 701-706.
[10]	魏琴, 阿曼古丽·如则, 陈冰心, 赵翎, 赵帮豪, 姜涛, 张春, 李志强, 高晓明, 段明军. 松弛素保护心肌微血管内皮细胞缺氧复氧损伤的机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(28): 4519-4524.
[11]	刘星余, 刘日光, 李光第, 汪健, 李龙, 石豪, 邓柯淇. 内源性竞争RNA调控骨性关节炎的发生[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(28): 4559-4565.
[12]	卢晓君, 熊波涵, 杨腾云, 王旭, 张瑶璋, 钟瑞颖, 李彦林. 骨关节炎软骨细胞的新型程序性死亡[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(28): 4571-4576.
[13]	陈佳丽, 高航, 赵子莹, 王光义. 中药热敷颈椎病模型兔椎间盘自噬及凋亡相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(26): 4181-4186.
[14]	郭超, 李启义, 崔敬虹, 王辉, 倘艳锋. 益气活血通络汤干预膝骨关节炎大鼠关节滑膜细胞凋亡及ADAMTS-5蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(26): 4193-4199.
[15]	方兴艳, 田侦丽, 赵哲仪, 文平, 谢婷婷. 亚砷酸钠对人脐静脉内皮细胞损伤及鞘氨醇激酶1/1-磷酸鞘氨醇信号轴的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(26): 4161-4167.