对纳入梗死组的8周龄小鼠建立心梗模型，进行冠状动脉左前降支结扎，结扎后可见心脏左室前壁变白，心脏搏动减弱，心电图结果显示心梗术后ST段显著抬高，见图2B，提示心梗模型成功建立。



2.3   心梗小鼠心肌组织中TXNIP在蛋白水平表达的变化    心梗手术4 d后，Western blot检测心脏TXNIP的蛋白表达情况。结果见图3所示，与野生伪手术组相比，野生心梗组TXNIP的蛋白表达显著升高(P < 0.05)。TXNIP基因敲除鼠为TXNIP基因全身敲除鼠，故在其伪手术组和心梗组TXNIP的蛋白表达几乎都接近于零。



2.4   TXNIP基因敲除可改善心梗术后左心室功能障碍   术后1个月，使用小动物超声仪检测各组小鼠心脏左室功能，见图4及表2。结果可见，野生伪手术组与TXNIP基因敲除伪手术组相比，各超声指标均无显著差异(P > 0.05)，心脏超声图显示两组心脏左室前壁和后壁搏动情况接近，心脏大体照片也无明显差异。与各自伪手术组相比，野生心梗组和TXNIP基因敲除心梗组的左室射血分数和左室短轴缩短率显著降低，左心室收缩末期内径和左心室收缩末期容积显著升高(P < 0.05)；心脏大体照片可见到明显的梗死区域。与野生心梗组相比，TXNIP基因敲除心梗组左室射血分数和左室短轴缩短显著升高，左心室收缩末期内径和左心室收缩末期容积明显降低(P < 0.05)，同时超声心动图可见野生心梗组小鼠左室前壁搏动明显减弱甚至接近直线，而TXNIP基因敲除心梗组小鼠左室前壁搏动情况较好。心脏大体照片显示，野生心梗组心梗面积大于TXNIP基因敲除心梗组心肌的梗死面积。以上结果提示TXNIP基因敲除可减轻心梗术后造成的左室功能障碍。







2.5   TXNIP基因敲除可以改善心梗后心肌细胞凋亡   心梗手术4 d后，使用TUNEL法测定了心肌组织细胞凋亡情况，结果见图5A。野生伪手术组和TXNIP基因敲除伪手术组仅可见苏木精蓝染的细胞核，视野中几乎看不到呈棕黄色的凋亡阳性染色细胞核；野生心梗组和TXNIP基因敲除心梗组视野中可见到较多的棕黄色颗粒，但TXNIP基因敲除心梗组阳性细胞的数量较野生心梗组显著减少，心肌细胞凋亡指数明显降低(P < 0.05)。Western blot检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的表达，结果发现，与各自伪手术组相比，野生心梗组和TXNIP基因敲除心梗组cleaved caspase-3蛋白表达均明显增加(P < 0.05)；而与野生心梗组相比，TXNIP基因敲除心梗组cleaved caspase-3蛋白表达明显减少(P < 0.05)，见图5B。以上结果提示，心梗可引起显著的心肌细胞凋亡，而TXNIP基因敲除可减轻心梗后心肌细胞凋亡的发生。



2.6   TXNIP基因敲除抑制NLRP3、cleaved caspase-1、凋亡相关斑点样蛋白和活化白细胞介素1β的蛋白表达   心梗手术4 d后，取各组小鼠的心脏组织，使用Western blot方法检测NLRP3、cleaved caspase-1、凋亡相关斑点样蛋白和活化白细胞介素1β的蛋白表达水平，见图6。与野生伪手术组相比，TXNIP基因敲除伪手术组4种蛋白的表达均无明显变化(P > 0.05)；与各自伪手术组相比，野生心梗组和TXNIP基因敲除心梗组4种蛋白的表达均显著升高(P < 0.05)；与野生心梗组相比，TXNIP基因敲除心梗组4种蛋白的表达均降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。以上结果提示，TXNIP基因敲除可抑制NLRP3、cleaved caspase-1和凋亡相关斑点样蛋白的蛋白表达，并减少下游活化白细胞介素1β的蛋白表达，从而减轻心梗后小鼠心脏组织的炎症反应。

急性心肌梗死(简称心梗)是全球性的健康问题，严重威胁着人类健康[1-2]，由于心脏缺乏自体修复和再生能力，任何原因导致的心肌细胞数量不足都会对心脏产生不可逆的影响[3]。众所周知，心梗后心肌细胞死亡的方式包含坏死和凋亡，而凋亡是一种主动性的死亡，是可以被调节的细胞死亡过程[4]，减少心肌细胞凋亡可以减轻缺氧缺血对心肌造成的损伤[5-7]。因此，阐明心肌缺血梗死中影响心肌细胞凋亡的关键蛋白和关键通路，对于减轻心肌缺血性损伤，改善心脏功能具有重要的理论意义和临床价值。

硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredxoin-interacting protein，TXNIP)又名维生素D3上调蛋白Ⅰ或硫氧还蛋白结合蛋白2，属于含有抑制素结构域的蛋白超家族成员。TXNIP不仅参与增殖、分化、凋亡等细胞过程，还与代谢、基因表达、氧化还原反应等密切相关[8-10]，提示其可作为良好的治疗靶点。近年来有研究发现，在心梗小鼠的心肌组织中，TXNIP表达升高[11-12]；使用特异的核酸酶分解TXNIP的mRNA减少其表达后，心肌胶原蛋白沉积减少，心肌重构改善。但是在心梗模型中，TXNIP表达的升高对心肌细胞凋亡的影响及机制尚不明确。

当前，炎症反应在心梗损伤机制中的重要性受到越来越多的关注。有研究表明，使用特定的抗炎策略可以显著减少梗死面积，减轻缺血带来的心脏损伤。核苷酸结合寡聚化域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain-like receptor containing pyrin domain 3，NLRP3)炎症小体是由 NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1，caspase-1)前体及凋亡相关斑点样蛋白组成的复合体，当受到刺激时炎症小体组装并触发caspase-1前体的自切割和活化，活化caspase-1(Cleaved caspase-1)可以引起白细胞介素1β和白细胞介素18的生成，促进细胞凋亡的发生[13-15]。TXNIP是NLRP3炎性小体的内源性激活物，那么，TXNIP是否通过激活炎症小体参与心梗的病理过程目前尚不清楚。因而，此次研究拟使用TXNIP基因敲除小鼠建立心梗模型，探讨TXNIP对心梗后心肌细胞凋亡、NLRP3炎症小体活性以及对梗死后心脏功能的影响，从而为临床急性心梗的治疗提供新的靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物体内实验、体外分子实验及切片染色实验，组间分析采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。
1.2   时间及地点   实验于2020年7月至2021年9月在山西医科大学生理实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   动物   C57BL/6J背景下的TXNIP基因敲除杂合小鼠，由中国江苏集萃药康生物科技股份有限公司协助构建。TXNIP基因敲除杂合小鼠敲除的外显子为外显子1-8(exon1-exon8)，见图1。实验动物均饲养于SPF级实验动物环境设施中，标准室温(22±2) ℃，自由摄取水和食物。实验方案经山西医科大学动物实验伦理委员会批准，批准号：SYDL2022002。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。

1.3.2   试剂及仪器   TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒购于中国上海碧云天生物技术有限公司；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶制备试剂盒购于美国伯乐公司；全蛋白提取试剂盒和BCA蛋白含量检测试剂盒购于中国江苏凯基生物技术股份有限公司；超敏ECL化学发光检测试剂盒购于中国北京赛文创新生物科技有限公司；PCR引物购于日本TaKaRa公司，具体序列见表1；总RNA提取试剂(M5100)购于中国苏州新赛美生物科技有限公司；反转录和扩增试剂盒购于日本TaKaRa公司；TXNIP抗体(货号：ab188865，兔来源)购于英国Abcam公司；NLRP3抗体(货号：WL02635，兔来源)、cleaved caspase-1抗体(货号：WL03450，兔来源)、凋亡相关斑点样蛋白抗体(货号：02462，兔来源)和活化白细胞介素1β抗体(货号：WL00891，兔来源)购于中国沈阳万类生物科技有限公司，Cleaved caspase-3抗体(货号：9664s，兔来源)和caspase-3抗体(货号：9662s，兔来源)购于美国Cell Signaling Technology(CST)公司；β-肌动蛋白抗体(货号：AP0060，兔来源)购于中国南京Bioworld公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.4   实验方法   
1.4.1   动物分组及心梗模型建立   对TXNIP基因敲除杂合小鼠交配饲养，以获得其纯合子小鼠。对子代小鼠常规剪取鼠尾进行PCR基因鉴定，得到TXNIP基因敲除纯合子和同窝野生C57BL/6J小鼠，分笼饲养。

选取雄性8周龄TXNIP基因敲除纯合子小鼠和同窝野生C57BL/6J小鼠各30只，体质量22-24 g，2种小鼠用简单的随机抽样方法(随机序列由计算机随机顺序生成器生成)随机分入伪手术组和心梗组，每组15只。心梗组小鼠经异氟烷气体吸入麻醉后，行气管插管，使用小动物呼吸机进行辅助呼吸，连接心电图，乙醇消毒，剪开皮肤，充分暴露心脏，用7-0手术线结扎左冠状动脉前降支，结扎成功后可见左心室前壁及心尖部缺血变白，心脏搏动减弱，心电图显示ST段抬高，指示心梗模型建立成功，随后关闭胸腔，5-0手术线缝合皮肤，常规小鼠腿部肌注青霉素预防感染。伪手术组小鼠只暴露心脏并用7-0手术线穿过而不结扎左前降支，其余步骤同前。

手术完成后，常规饲养。于术后4 d 每组选取10只小鼠处死(麻醉后颈椎脱臼法处死小鼠，动物尸体交由山西医科大学动物中心处理)，留取完整心脏组织，分别用于石蜡切片(n=5)和Western blot检测(n=5)。术后1个月对其余小鼠(n=5)进行超声心动图检查，后麻醉处死小鼠，留取心脏组织，以备后续实验。 
1.4.2   TUNEL法检测心肌细胞凋亡水平   取小鼠完整心脏组织，多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、5 μm连续切片，根据TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书进行检测[16]，Olympus BX51正置显微镜(日本Olympus公司)400倍镜下获取图像。每组选取5只小鼠，由心尖往上每间隔1 mm选取1张切片，共5张，每张切片在梗死区周边随机取 5-7个视野，计算各组心梗区附近心肌细胞凋亡率。心肌细胞凋亡率= 凋亡心肌细胞核数/心肌细胞核总数×100%。
1.4.3   Western blot法检测蛋白水平   取0.03 g心梗周围组织，加300 μL裂解液、3 μL蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟和3 μL磷酸酶抑制剂，得到蛋白溶液。二喹啉甲酸法(BCA法)测蛋白浓度[17]，98 ℃金属浴加热5 min使蛋白变性，并统一上样量为25 μg，SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭，一抗分别为TXNIP(1∶2 000)、NLRP3(1∶2 000)、cleaved caspase-1 (1∶1 000)、凋亡相关斑点样蛋白(1∶500)、活化白细胞介素1β(1∶500)和cleaved caspase-3 (1∶1 000) /caspase-3 (1∶1 000)，孵育12 h，随后辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000)孵育1 h，使用化学发光检测法(ECL显色法)进行曝光。Image J软件用于分析曝光条带灰度值，β-actin作为内参进行分析。
1.4.4   小动物超声检测心脏结构和功能变化   建模1个月后，各组小鼠经异氟烷吸入麻醉，用脱毛膏脱去左侧前胸的毛发。GE Vivid 7-Dimension Ultrasound超声仪进行超声心动图检查，取短轴切面。用左心室收缩末期内径、左心室收缩末期容积作为反映心脏结构的指标；用左心室射血分数和短轴缩短率作为反映心脏功能的指标。连续测量3次后取平均值。
1.5   主要观察指标   ①术后4 d，TUNEL染色法观察小鼠心肌细胞凋亡水平；Western blot检测TXNIP、NLRP3、cleaved caspase-1、凋亡相关斑点样蛋白、活化白细胞介素1β和cleaved caspase-3蛋白的表达情况；②术后1个月，小动物超声观察小鼠心脏结构和功能。
1.6   统计学分析   文章统计学方法已经山西医科大学医院生物统计学专家审核。用GraphPad Prism 6软件统计分析，数据均以均数±标准误表示，组间分析采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，以P < 0.05为差异有显著性意义。

心梗是由心脏冠脉血管血流受阻导致一部分心肌因急性缺血缺氧发生死亡的严重疾病，常因继发的心力衰竭、心律失常而导致死亡，是临床常见病和多发病[1-2]，减少心肌细胞凋亡和减轻心梗后炎症反应都是改善缺血心肌功能和预后的有效手段[6，16]。

硫氧还蛋白是细胞内高表达的抗自由基蛋白，此外还有促细胞生长、抗凋亡、免疫功能调节等作用，在心血管疾病、心力衰竭、卒中、代谢综合征以及肿瘤等疾病的发病过程中扮演着重要的角色[9-10]。近年来，作为目前发现的唯一的硫氧还蛋白内源性抑制蛋白， TXNIP引起很大关注。TXNIP是一种α抑制蛋白家族的成员，分子质量为50 kD，它在心脏、肺、胸腺、脾、肾和骨骼肌等各种器官组织中普遍表达，不仅可以结合抑制硫氧还蛋白而削弱其抗自由基和抗凋亡作用，还参与细胞糖脂代谢和免疫功能的调节[8]。有研究表明，在急性心梗大鼠的左室梗死区附近注射合适剂量的 DNA 酶降解TXNIP mRNA后，发现胶原沉积减少，心肌瘢痕形成减少，左室扩张和收缩功能显著改善[10]，提示TXNIP对急性心梗后心脏功能恢复和心肌重构具有重要的调节作用[12]，有望成为治疗急性心梗的靶标蛋白。此次研究发现，心梗术后心肌TXNIP蛋白表达水平升高，与前人在减压室中发现低压缺氧小鼠心脏TXNIP基因表达增加的结论一致，提示TXNIP在缺血心肌的功能障碍中可能起一定作用。此次研究使用TXNIP基因敲除小鼠发现，敲除小鼠心梗后左室射血分数和短轴缩短率与野生型对照相比明显升高，左室收缩末期内径和收缩末期容积降低，且从心脏大体照片看出心梗面积明显减少，提示TXNIP基因敲除减轻了心梗所致的左心室功能损伤。

凋亡是细胞的主动自杀方式，在生理状态下细胞凋亡是机体生长发育以及维持自身稳态的一种重要方式。但在疾病情况下，凋亡信号通路若被异常激活又常可以引起更多的细胞死亡，造成额外损伤以及器官组织的功能障碍[17-18]。心肌细胞凋亡贯穿于心梗疾病发展的整个过程中，是心梗后心功能下降的主要的因素之一[5-7，18]。TXNIP与凋亡密切相关，体外细胞实验证实，发育及DNA损伤反应调节蛋白1是细胞凋亡过程中发挥重要作用的蛋白，但它不是独自完成了这项工作，而是与TXNIP结合形成复合体，从而增强促凋亡的功能，证实TXNIP在凋亡通路中发挥不可或缺的作用[19]。在一项细胞实验中发现，沉默TXNIP可显著抑制细胞的凋亡[20]。在氧化应激过程中，TXNIP便从细胞核转移到线粒体，与硫氧还蛋白结合并释放凋亡信号调节激酶1，激活p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路，从而导致细胞凋亡[21]。以往研究证实心梗可提高机体氧化应激的水平，那么心梗后心脏功能的下降是否与氧化应激过程中TXNIP诱导的心肌细胞凋亡增加有关？此次实验使用TUNEL法检测心肌细胞凋亡率，Western blot检测Cleaved caspase-3的表达水平，均发现心梗后心肌细胞凋亡增加；而与野生心梗小鼠相比，TXNIP基因敲除心梗小鼠心肌细胞凋亡显著减少，cleaved caspase-3表达降低，证明TXNIP是引起caspase-3的活化、促进缺血心肌细胞凋亡的关键分子。

越来越多的研究证实，炎症也在心梗后的心脏损伤中扮演重要角色[22-23]。NLRP3炎性小体位于TXNIP下游，激活后可以分解caspase-1前体并生成有活性的caspase-1，有活性的caspase-1分解白细胞介素1β前体和白细胞介素18前体，促进炎性因子白细胞介素1β和白细胞介素18生成，促进组织炎症[14-15]。NLRP3炎症小体的激活需要2个信号，启动信号和激活信号。启动信号由微生物成分或内源性细胞因子诱导；激活信号是由一系列刺激引起，包括许多分子或细胞过程，TXNIP属于NLRP3的激活信号之一[24-25]。在基础状态下，TXNIP与硫氧还蛋白结合，抑制硫氧还蛋白的抗氧化活性。当TXNIP受到NLRP3激活物的刺激后，TNXIP便与硫氧还蛋白分离，然后与NLRP3结合为TXNIP/NLRP3复合体，进而激活炎症小体，激发组织炎症[26-27]。此次实验用Western blot方法，发现心梗上调了NLRP3、cleaved caspase-1、凋亡相关斑点样蛋白和活化白细胞介素1β的蛋白表达水平，但与野生心梗小鼠相比，TXNIP基因敲除心梗小鼠上述蛋白的表达均显著降低，证明TXNIP基因敲除可抑制NLRP3、cleaved caspase-1、凋亡相关斑点样蛋白和活化白细胞介素1β的蛋白表达，从而减轻心梗后小鼠心脏组织的炎症反应。有研究者在NLRP3基因敲除小鼠基础上建立缺血再灌注模型，发现NLRP3基因敲除小鼠心肌细胞凋亡明显减少。也有研究者用特异性抑制剂MCC950选择性抑制了心脏NLRP3炎症小体的活化，可减少心肌细胞的凋亡，减小梗死面积，有效改善左室功能[28]。以上证实NLRP3炎性小体激活可增加心肌细胞凋亡，加重心肌损伤。

细胞焦亡是一种程序性的细胞炎性坏死，表现为细胞膜破裂、细胞内容物的释放，属于机体的一种天然免疫反应，在抗击感染中发挥重要作用，同时具有坏死和凋亡的特征[13， 29]。在受损心肌中，NLRP3炎性小体参与心肌成纤维细胞及心肌细胞的焦亡，此过程与有活性的caspase-1有关[30-31]，已被很多研究证实。有研究者报道，磷酸化的腺苷5’-单磷酸活化蛋白激酶可以导致TXNIP发生变性，进而促进NLRP3炎性小体诱导的焦亡，当阻断腺苷5’-单磷酸活化蛋白激酶激活后，TXNIP表达水平降低，焦亡减少[32]。在此次实验中，TXNIP基因敲除对心梗后左室功能障碍的减轻，除了与心肌细胞凋亡减少、NLRP3表达减少等有关外，还可能与心肌细胞及心肌成纤维细胞的焦亡减少有关，后续可开展相关实验进行验证。

综上所述，此次研究证实，心梗后TXNIP表达增加，其可通过上调NLRP3和cleaved caspase-1的蛋白表达，促进白细胞介素1β的蛋白表达，促进心肌细胞凋亡，最终导致心梗后心功能降低。但是调控心梗后炎症反应和心肌细胞凋亡的机制错综复杂，此次研究可能只阐明其中的一部分机制，更加深入的机制有待进一步探索。
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文题释义：
硫氧还蛋白相互作用蛋白：是α抑制蛋白家族的成员，在包括心脏、肺、胸腺、脾、肾和骨骼肌在内的各种器官组织中普遍表达，不仅可以结合抑制硫氧还蛋白而削弱其抗自由基和抗凋亡作用，还参与细胞糖脂代谢和免疫功能的调节，有望成为新的治疗靶点。
心肌细胞凋亡：心肌梗死后心肌细胞死亡的方式包含坏死和凋亡，而凋亡是一种主动性的死亡，是可以被调节的细胞死亡过程。心肌细胞凋亡贯穿于心肌梗死疾病发展的整个过程中，是心肌梗死后心功能下降的主要的因素之一，减少心肌细胞凋亡即可以减轻缺氧缺血对心肌造成的损伤。

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硫氧还蛋白相互作用蛋白作为支架蛋白，在凋亡、氧化应激和炎症等过程中发挥多种作用，是细胞信号转导中的重要蛋白，预测其可作为良好的治疗靶点。近年来有研究发现，在心梗小鼠的心肌组织中，硫氧还蛋白相互作用蛋白表达升高；使用特异的核酸酶分解硫氧还蛋白相互作用蛋白的mRNA减少其表达后，心肌胶原蛋白沉积减少，心肌重构改善。但是在心梗模型中，硫氧还蛋白相互作用蛋白表达的升高对心肌细胞凋亡的影响及机制尚不明确。此文在建立硫氧还蛋白相互作用蛋白基因敲除鼠模型的基础上构建了心肌梗死模型，观察各组小鼠心脏功能、心肌细胞凋亡水平及炎症水平的变化，探索硫氧还蛋白相互作用蛋白对心肌梗死的影响及机制，为临床心肌梗死的治疗提供新的方向。

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