1.1 设计 体外细胞实验。收集人增生性瘢痕标本,提取增生性瘢痕成纤维细胞用于后续实验,获得的实验数据组间比较采用两样本均数t检验。
1.2 时间及地点 实验于2020年9月至2022年6月在宁夏医科大学国家卫生健康委代谢性心血管疾病研究重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 标本来源 宁夏医科大学总医院烧伤整形外科提供的增生性瘢痕和同一个体正常皮肤。3例患者一般资料见表1。
纳入标准:①有典型的增生性瘢痕的病理特征,例如瘢痕突出皮肤平面但不会超出原损伤面积持续生长;②没有其他重大疾病且近期没接受过激素、放疗和化疗等治疗;③镜下胶原纤维排列整齐。
排除标准:①严格区分其他类型的瘢痕,例如瘢痕疙瘩,萎缩性瘢痕、浅表性瘢痕等;②镜下胶原纤维排列紊乱。该研究的实施符合宁夏医科大学总医院的相关伦理要求,伦理批件号2018-087。患者都签署了知情同意书。
1.3.2 主要试剂及仪器 PCNA、p27引物(生工,上海);CCK-8试剂盒(APExBIO,美国);EdU试剂盒(锐博,广州);蛋白提取试剂盒(凯基,江苏);苏木精-伊红染色试剂盒(Solarbio公司,中国);Anti-Vimentin、PCNA、p27抗体(Abcam,英国);β-actin抗体(ABclonal,中国);Goat Anti-Rabbit
IgG(H+L)HRP(Affinity,中国);铁离子比色法检测试剂盒(普利莱,中国);丙二醛含量检测试剂盒(Solarbio公司,中国);铁死亡诱导剂Erastin(MCE,美国);铁死亡抑制剂Ferrostatin-
1(MCE,美国);DMEM-F12培养基(Hyclone,中国);胎牛血清(BI,以色列);PBS(G-CLONE,中国);胶原Ⅰ型蛋白
(Solarbio,中国);40 g/L多聚甲醛(Biotopped,北京);Triton
X-100(Biotopped,北京);Ablumin Bovine V(BSA)(Servicebio,中国);电泳槽、电泳仪、电转仪及凝胶成像仪(BIO-RAD,美国);Biotek酶标仪Epoch(北京德泉兴业商贸有限公司,中国)。
1.4 方法
1.4.1 苏木精-伊红染色 将增生性瘢痕组织放入OCT冰冻切片包埋剂包埋,冰冻后切片,-80 ℃保存。冰冻组织切片苏木素溶液浸泡4 min,蒸馏水流动冲洗干净后分化液分化2 min,普通水洗后放入伊红溶液中染色30 s;脱水:体积分数分别为70%,80%,90%,100%的乙醇各涮5下,二甲苯浸泡2 min,封固后光镜下观察。
1.4.2 增生性瘢痕成纤维细胞分离及培养 将增生性瘢痕剪成组织小块(1 mm×1 mm×1 mm),放入含双抗和庆大霉素的PBS混合液中清洗3次,每次10 min;放入0.125%TE消化酶
(5 mL 0.25%胰蛋白酶和5 mL DPBS配置而成)中4℃摇床中过夜;将去除表皮组织的组织小块剪碎成肉糜样后加入CoA胶原酶(胶原Ⅰ型蛋白)进行消化,37 ℃摇床中过夜;向培养皿中加入2 mL PBS反复轻柔的吹吸组织块,将组织和剩余液体过100目筛网;收集过筛后的组织悬液离心弃上清;加入含1%青链霉素和15%胎牛血清DMED-F12培养基5 mL转入T25培养瓶中。
1.4.3 免疫荧光检测 将第3代增生性瘢痕成纤维细胞接种于共聚焦小皿中,当细胞密度达70%时用于实验;依次加入40 g/L多聚甲醛室温孵育20 min、0.3%Tritonx-100孵育
10 min、5%BSA孵育30 min、抗波形蛋白抗体孵育过夜,次日加入二抗孵育1 h,最后加入DAPI孵育10 min,封固后观察波形蛋白的显影情况。
1.4.4 药物干预细胞 将5×103个增生性瘢痕成纤维细胞接种于96孔板中,每组实验孔6孔,分为空白组(只有培养基)、对照组(有细胞和培养基)和1,5,10,20,50 μmol/L
铁死亡诱导剂Erastin组,各组细胞在培养箱中培养24 h,每孔加入10 μL CCK-8溶液,放入培养箱中孵育1 h;用酶标仪检测波长为450 nm的吸光度值;通过公式计算抑制率(%)=
[(对照孔吸光度-实验孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%,寻找抑制率为50%的Erastin浓度用于后续实验。其中20 μmol/L铁死亡诱导剂Erastin对增生性瘢痕成纤维细胞的抑制率接近于50%,进一步进行细胞分组:对照组增生性瘢痕成纤维细胞不做处理,铁死亡诱导剂组用
20 μmol/L铁死亡诱导剂Erastin干预增生性瘢痕成纤维细胞24 h,铁死亡诱导剂+铁死亡抑制剂组用20 μmol/L铁死亡诱导剂Erastin和20 μmol/L铁死亡抑制剂Ferrostatin-1同时干预增生性瘢痕成纤维细胞24 h。细胞接种详情见表2。
1.4.5 qRT-PCR检测PCNA和p27表达水平 收集对照组、铁死亡诱导剂组、铁死亡诱导剂+铁死亡抑制剂组的增生性瘢痕成纤维细胞(25T培养瓶),按照RNA提取试剂盒中的说明书提取各组的总RNA后将RNA反转录成cDNA,运用
qRT-PCR来检测PCNA和p27的表达水平。采用2-ΔΔCt计算法进行统计。基因引物序列和产物长度见表3,扩增条件见表4。
1.4.6 Western blot检测铁蛋白(Ferritin)、PCNA和p27蛋白表达水平 ①收集对照组和铁死亡诱导剂组的增生性瘢痕成纤维细胞(25T培养瓶),检测铁蛋白(Ferritin)的表达水平。②收集对照组、铁死亡诱导剂组和铁死亡诱导剂+铁死亡抑制剂组的增生性瘢痕成纤维细胞(25T培养瓶),检测PCNA和p27的表达水平。提取蛋白后定量,电泳设置80 V,电转设置0.3 A,牛奶封闭2 h,加入对应的铁蛋白(Ferritin)(1∶
1 000)、PCNA(1∶1 000)及p27(1∶1 000)一抗过夜,以β-actin为内参(1∶10 000),次日将膜放进Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) HRP(1∶5 000)中孵育2 h后洗膜曝光,用Image Lab统计铁蛋白(Ferritin)、PCNA、p27及β-actin的灰度值,用目的灰度值/β-actin灰度值的比值进行统计分析。
1.4.7 铁离子检测 收集对照组和铁死亡诱导剂组的增生性瘢痕成纤维细胞(25T培养瓶),按照每5×106个细胞加入
1 mL裂解液,超声波破碎细胞(功率200 W,超声3 s,间隔10 s,重复30次),按照铁离子比色法检测试剂盒说明书中的体系进行加样;60 ℃孵育1 h后每孔加入30 μL铁离子检测剂室温孵育30 min;取200 μL于96孔板,用酶标仪在520 nm波长处测定吸光度,绘制标准曲线并计算铁离子浓度(μmol/L)。
1.4.8 丙二醛检测 收集对照组和铁死亡诱导剂组的增生性瘢痕成纤维细胞(25T培养瓶),按照每5×106个细胞加入
1 mL提取液,超声波破碎细胞(功率200 W,超声3 s,间隔10 s,重复30次),按丙二醛含量检测试剂盒说明书中的体系进行加样;混合液在100 ℃水浴中保温60 min后(盖紧),置于冰浴中冷却,离心后取200 μL上清液于96孔板,测定各样本在532 nm和600 nm处的吸光度。将测定的吸光度结果带入说明书的公式计算丙二醛水平(ΔA532=A532测定-A532空白,ΔA600=A600测定-A600空白,ΔA=ΔA532-ΔA600,丙二醛水平(nmol/104 cell)=0.107 5×ΔA。
1.4.9 CCK-8测定增生性瘢痕成纤维细胞增殖活力 收集对照组、铁死亡诱导剂组和铁死亡诱导剂+铁死亡抑制剂组的增生性瘢痕成纤维细胞(96孔板,每孔5×103个细胞),各组细胞在培养箱中培养24 h,每孔加入10 μL CCK-8溶液,放入培养箱中孵育1 h;用酶标仪检测波长为450 nm的吸光度值,计算6个孔吸光度值的平均值进行统计分析。
1.4.10 EdU检测增生性瘢痕成纤维细胞的增殖情况 收集对照组、铁死亡诱导剂组、铁死亡诱导剂+铁死亡抑制剂组的增生性瘢痕成纤维细胞(共聚焦小皿每皿接种9.0×105个细胞),依据EdU说明书进行操作,激光共聚焦显微镜拍摄,用红色的细胞数/蓝色的细胞数的比值进行统计分析。
1.5 主要观察指标 ①PCNA及p27的mRNA表达;②铁蛋白(Ferritin)、PCNA及p27蛋白表达;③细胞铁离子含量;④细胞丙二醛水平;⑤CCK-8、EdU检测细胞增殖活力和增殖水平。
1.6 统计学分析 采用GraphPad Prism 6.0统计软件,结果以x±s表示,组间比较采用两样本均数t检验,P < 0.05为差异有显著性意义。统计学方法已经宁夏医科大学统计学专家审核。