苗药九仙罗汉接骨汤干预胫骨骨折模型大鼠的成骨分化及骨折愈合

doi:10.12307/2022.808

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (33): 5350-5356.doi: 10.12307/2022.808

• 骨科植入物相关基础实验 Basic experiments of orthopedic implant • 上一篇下一篇

苗药九仙罗汉接骨汤干预胫骨骨折模型大鼠的成骨分化及骨折愈合

李义，杨彦君，彭松云，程志刚，钟凯，殷天坪，唐良华

贵州中医药大学第二附属医院骨二科，贵州省贵阳市 550001

收稿日期:2021-03-02 接受日期:2021-06-09 出版日期:2022-11-28 发布日期:2022-03-31
通讯作者: 唐良华，1972年生，博士，主任医师，硕士生导师，贵州中医药大学第二附属医院骨二科，贵州省贵阳市 550001
作者简介:李义，男，1987年生，贵州省金沙县人，汉族，2016年贵州中医药大学毕业，硕士，医师，主要从事中西医结合治疗骨与关节病的研究。
基金资助:
贵州省科学技术厅科技核心计划项目 (黔科合LH字[2015]7257号)，项目负责人：唐良华

Effect of Miao medicine Jiuxian Luohan Jiegu Decoction on osteogenic differentiation and fracture healing in tibial fracture rats

Li Yi, Yang Yanjun, Peng Songyun, Cheng Zhigang, Zhong Kai, Yin Tianping, Tang Lianghua

Second Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550001, Guizhou Province, China

Received:2021-03-02 Accepted:2021-06-09 Online:2022-11-28 Published:2022-03-31
Contact: Tang Lianghua, MD, Chief physician, Master’s supervisor, Second Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550001, Guizhou Province, China
About author:Li Yi, Master, Physician, Second Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550001, Guizhou Province, China
Supported by:
the Science and Technology Core Project of Guizhou Provincial Department of Science and Technology, No. LH [2015]7257 (to TLH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨折愈合：过程复杂连续，由多细胞协同完成。骨折愈合的基本过程包括3个阶段：第一、血肿机化演进期，时间段大约是在骨折之后2周，骨折之后断端会形成血肿，在机体的作用下会使血肿机化，形成纤维性连接，可以获得初步稳定；第二、原始骨痂形成期，这个时期持续的时间从6-12周不等，在这一时期骨折在成骨细胞的作用下，会使骨痂逐渐生长，并获得骨性愈合；第三、骨痂塑形改造期，持续时间从半年到两年不等，在这一阶段通过骨折处受力的影响，使受力处逐渐加强，不受力处骨痂逐渐吸收。
骨形态发生蛋白2：又称骨形成蛋白，是一组具有类似结构的高度保守的功能蛋白，属于转化生长因子β家族。骨形态发生蛋白能刺激DNA的合成和细胞的复制，从而促进间充质细胞定向分化为成骨细胞。它还是体内诱导骨和软骨形成的主要因子，并在肢体生长、软骨内骨化、骨折早期、软骨修复时表达，对骨骼的胚胎发育和再生修复起重要作用。

背景：九仙罗汉接骨汤具有活血散瘀、接骨消肿、止痛的作用，但目前其对胫骨骨折的具体作用机制尚未完全掌握。
目的：探究苗药九仙罗汉接骨汤介导BMPs/Smad信号通路对胫骨骨折大鼠成骨分化及骨折愈合能力的影响。
方法：60只SD大鼠随机分为模型组、苗药组、三七组，采用改良钻孔法建立不完全性胫骨骨折模型。造模成功当天，苗药组给予苗药九仙罗汉接骨汤煎剂(2 mL/kg)灌胃；三七组给予同体积三七粉液(1 mL/kg)灌胃；模型组给予同等计量蒸馏水灌胃，1次/d，共28 d。28 d后麻醉下取大鼠胫骨组织，茜素红染色测骨髓间充质干细胞成骨分化；三点弯曲试验测胫骨生物力学指标；苏木精-伊红染色测骨组织形态；ELISA检测血清中血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1表达水平；RT-PCR和Western blot检测骨形态发生蛋白 2、转化生长因子β、Smad1、Smad2的mRNA和蛋白水平；实验已经过贵州中医药大学第二附属医院动物伦理委员会批准(2018-072)。
结果与结论：①与模型组比较，苗药组与三七组骨髓间充质干细胞成骨分化后细胞多层重叠生长且形成灶状，有大量的钙结节形成，且苗药组较三七组效果更佳；②与模型组相比，三七组与苗药组骨形态发生蛋白 2、转化生长因子β 、Smad1、Smad2的mRNA和蛋白水平均有所上升(P < 0.05)；③三七组与苗药组最大载荷、刚度水平较模型组均有所升高(P < 0.05)；④模型组骨小梁较细，髓腔间空隙大，杂乱无章，较为松散，有大量的未钙化软骨细胞；三七组与苗药组大鼠骨组织形态较为接近，均表现为骨小梁较粗，髓腔空隙减小，分布较为有序，软骨细胞骨化较多；⑤与模型组相比，三七组与苗药组血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1表达水平有一定程度的提升(P < 0.05)；⑥模型组大鼠存在明显骨折线，三七组与苗药组标本骨折断端均达到完全愈合，但与三七组相比，苗药组标本骨折断端骨痂密度稍高；⑦结果说明，苗药九仙罗汉接骨汤可促进成骨细胞分化，加速骨折愈合，其作用机制可能是通过激活BMPs/Smad信号通路来实现。

https://orcid.org/0000-0001-6836-188X (李义)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 苗药九仙罗汉接骨汤, BMPs/Smad信号通路, 成骨分化, 骨折愈合

Abstract: BACKGROUND: Jiuxian Luohan Jiegu Decoction can promote blood circulation, remove blood stasis, reduce swelling, and relieve pain. However, its specific mechanism underlying tibial fractures has not yet been fully elucidated.
OBJECTIVE: To explore the effect of Miao medicine Jiuxian Luohan Jiegu Decoction on the osteogenic differentiation and fracture healing ability of rats with tibial fractures mediated by bone morphogenetic proteins (BMPs)/Smad signaling pathway.
METHODS: Sixty Sprague-Dawley rats were randomly divided into a fracture group, a Miao medicine group, and a Panax notoginseng group. The Miao medicine group was given Jiuxian Luohan Jiegu Decoction (2 mL/kg) by gavage; the Panax notoginseng group was given the same volume of panax notoginseng powder (1 mL/kg) by gavage; and the model group was given the same amount of distilled water by gavage, once a day, for 28 days in total. Alizarin red staining was used to measure osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. RT-PCR and western blot were used to measure BMP-2, transforming growth factor-β, Smad1, and Smad2 at mRNA and protein levels. Three-point bending test was used to measure biomechanical indexes. Hematoxylin-eosin staining was used to detect bone tissue morphology. ELISA was used to measure serum vascular endothelial growth factor and insulin growth factor-1.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the model group, the differentiated cells of the Miao medicine group and the Panax notoginseng group grew in multiple layers and formed focal shapes, and a large number of calcium nodules were formed. The Miao medicine group showed better effects than the Panax notoginseng group. (2) Compared with the model group, the mRNA levels of BMP-2, transforming growth factor-β, Smad1, and Smad2 were increased in the Panax notoginseng group and the Miao medicine group increased (P < 0.05). (3) The maximum load and stiffness of the panax notoginseng group and the Miao medicine group were higher than those of the model group (P < 0.05). (4) The bone trabeculae of the model group were thin, arranged disorderly, and relatively loosely, the space between the medullary cavities was large, and a large number of uncalcified chondrocytes appeared. Similar bone tissue morphology was found in the Panax notoginseng group and the Miao medicine group is similar, in which the bone trabecula was thicker, the medullary cavity space was reduced, the distribution was more orderly, and the chondrocytes were more ossified compared with those in the model group. (5) Compared with the model group, the expression levels of vascular endothelial growth factor and insulin growth factor-1 in the Panax notoginseng group and the Miao medicine group increased to a certain extent (P < 0.05). (6) Radiological observations showed that there were obvious fracture lines in the model group, while the fractured ends of the samples in the Panax notoginseng group and the Miao medicine group reached complete healing. However, the scab density at fractured ends of the Miao medicine group was slightly higher than that of the Panax notoginseng group. (7) To conclude, Miao medicine (Jiuxian Luohan Jiegu Decoction) can promote osteoblast differentiation and accelerate fracture healing. Its mechanism of action may be achieved by activating the BMPs/Smad signaling pathway.

Key words: Miao Medicine Jiuxian Luohan Jiegu Decoction, BMPs/Smad signaling pathway, osteogenic differentiation, fracture healing

中图分类号:

李义, 杨彦君, 彭松云, 程志刚, 钟凯, 殷天坪, 唐良华. 苗药九仙罗汉接骨汤干预胫骨骨折模型大鼠的成骨分化及骨折愈合[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(33): 5350-5356.

Li Yi, Yang Yanjun, Peng Songyun, Cheng Zhigang, Zhong Kai, Yin Tianping, Tang Lianghua. Effect of Miao medicine Jiuxian Luohan Jiegu Decoction on osteogenic differentiation and fracture healing in tibial fracture rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(33): 5350-5356.

图/表（结果） 12

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠60只，分为3组，大鼠在建模及药物灌胃过程中无意外死亡，全部进入结果分析。
2.2 骨髓间充质干细胞成骨分化检测结果茜素红能将钙结节染成棕红色，与模型组比较，苗药组与三七组细胞多层重叠生长且形成灶状，有大量的钙结节形成，且苗药组较三七组效果更佳，说明苗药九仙罗汉接骨汤可促进成骨分化，见图1。

2.3 骨形态发生蛋白 2、转化生长因子β、Smad1、Smad2 mRNA水平三七组与苗药组大鼠胫骨中骨形态发生蛋白 2、转化生长因子β 、Smad1及Smad2的mRNA水平较为接近，差异无显著性意义(P > 0.05)；与模型组相比，三七组与苗药组骨形态发生蛋白 2 、转化生长因子β、Smad1及Smad2的mRNA水平均有所上升(P < 0.05)，见表2，图2。

2.4 各组大鼠胫骨生物力学指标检测结果三七组与苗药组最大载荷、刚度水平较为接近，差异无显著性意义(P > 0.05)；三七组与苗药组最大载荷、刚度水平较模型组均有所升高 (P < 0.05)，见表3，图3。

2.5 病理组织形态及组织愈合评分结果模型组骨小梁较细，髓腔间空隙大，杂乱无章，较为松散，有大量的未钙化软骨细胞；三七组与苗药组大鼠骨组织形态较为接近，均表现为骨小梁较粗，髓腔空隙减小，分布较为有序，软骨细胞骨化较多，见图4。三七组与苗药组组织愈合评分较为接近(P > 0.05)，苗药组组织愈合评分高于模型组(P < 0.05)，见表4。

2.6 血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1水平三七组与苗药组血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1表达较为接近，差异无显著性意义(P > 0.05)；模型组血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1水平低于三七组与苗药组(P < 0.05)，见表5，图5。

2.7 骨愈合程度检测结果骨折后4周X射线片显示，模型组大鼠存在明显骨折线，三七组与苗药组标本骨折断端均达到完全愈合，但与三七组相比，苗药组标本骨折断端骨痂密度稍高，见图6。

2.8 各组大鼠骨组织骨形态发生蛋白 2、转化生长因子β、Smad1、Smad2蛋白水平三七组骨形态发生蛋白 2、转化生长因子β、Smad1、Smad2水平与苗药组水平较为接近(P > 0.05)，苗药组骨形态发生蛋白 2、转化生长因子β、Smad1、Smad2水平高于模型组(P < 0.05)，见表6，图7。

参考文献

[1] LI Y, SHEN S, XIAO Q, et al. Efficacy comparison of double-level and single-level bone transport with Orthofix fixator for treatment of tibia fracture with massive bone defects. Int Orthop. 2020;44(5):957-963.
[2] Goey RS, van Drunen B, van der Linden E, et al. Fracture of the tibia after a fibula graft for mandibular reconstruction: A rare complication, report of a case. Clinical Case Reports. 2021;9(5):e03987.
[3] CONSORTIUM T. A Randomized Controlled Trial Comparing rhBMP-2/Absorbable Collagen Sponge Versus Autograft for the Treatment of Tibia Fractures With Critical Size Defects. J Orthop Trauma. 2019;33(8): 384-391.
[4] 唐良华, 杨彦君. 苗药九仙罗汉接骨汤促进兔胫骨干骨折愈合的动物实验研究[J]. 贵阳中医学院学报,2014,36(1):25-26.
[5] 宋敬锋,梁春雨,刘昊,等.强骨胶囊对老年股骨头近段骨折延迟愈合患者血清BMP-2及IGF-1水平的影响[J].现代生物医学进展, 2017,17(7):1255-1258.
[6] 张文韬, 段宁, 陈勋,等. 血清血管细胞黏附因子-1、骨形态发生蛋白-2动态监测对尺桡骨骨折延迟愈合的预测价值[J]. 中国临床医生杂志,2019,47(2):198-200.
[7] 董瑛,袁小娟,高卉,等.骨折内固定术后感染对Smad通路蛋白的影响及与预后的关系[J]. 实用医学杂志,2019,35(9):1411-1414.
[8] 黄琼, 向阳, 曾楚华. 独正杆接骨膏外用对骨折愈合过程中SMAD1/5,SMURF1mRNA表达的影响[J]. 中华中医药学刊,2018, 36(3):543-546.
[9] 姜自伟, 曾景奇, 李悦,等. 骨碎补总黄酮对大鼠胫骨牵张末期BMP-2与Smad-1表达的影响[J]. 辽宁中医杂志,2018,45(1):166-168.
[10] 罗清龙,唐良华,熊屹,等. 苗药九仙罗汉接骨汤促进SD大鼠胫骨骨折愈合中TGF-β1动态表达[J]. 贵州医药,2019,43(4):24-27.
[11] 郭春锋,南子春,石永秀. HMGB1对大鼠胫骨骨折愈合的影响机制[J]. 基因组学与应用生物学,2020,39(9):4378-4384.
[12] 吴雪花, 车晓明, 顾勇,等. 水飞蓟素胶囊对大鼠胫骨骨折愈合的促进作用[J]. 中国医院药学杂志,2017,37(19):1909-1913.
[13] 屈墨羱, 胡静, 李运峰. 神经轴突导向分子Semaphorin 3A对骨质疏松模型大鼠骨折愈合的影响[J]. 广东医学,2016,37(2):173-177.
[14] KAKKAR RS. Malunited proximal third tibia fracture treated with open reduction and internal fixation surgery with a raft plate using the early stage callus as a potential autograft. Indian J Orthop. 2020;6(2):147-151.
[15] SCHAFFER NE, WILSON JL, YEE MA, et al. Intramedullary Nail for a Distal Tibia Fracture.J Orthop Trauma. 2020;34 Suppl 2:S37-S38.
[16] 陈祥和,彭海霞,李世昌,等.不同运动方式对Ⅱ型糖尿病小鼠骨形成及BMPs/Smad途径相关分子表达的影响[J].北京体育大学学报,2017,40(5):51-58.
[17] 熊为,丁金玉,张劲松,等.血府逐瘀汤对股骨颈骨折患者TGF-β、VEGF及BMP-2表达的影响[J].现代生物医学进展,2016,16(5):901-903.
[18] 罗艳,胡桂英,叶彬.降钙素调节BMP-2治疗骨质疏松所致骨折的临床价值分析[J].标记免疫分析与临床,2018,25(3):399-402.
[19] 王斌,麦彩园,谢胜德,等. Wnt/β-catenin,BMP-2/Runx2/Osterix, OPG/RANKL,LGR4/RANKL通路的相关因子在绝经后骨质疏松性骨折中的表达[J]. 2020,26(11):1577-1583,1658.
[20] 韩杰,王大伟,莫坚,等.中药在骨折愈合过程中对TGF-β1表达机制的影响[J].吉林中医药,2016,5(5):494-496.
[21] 孙贵耀, 张雪华, 乔晓光,等. 密骨方对股骨粗隆间骨折患者TGF-β1与骨折愈合的影响[J]. 川北医学院学报,2019,34(1):81-84.
[22] 曾继涛, 涂小林, 刘宏. TGF-βⅡ型受体小分子抑制剂ITD-1对骨髓基质细胞成骨分化和血管形成的作用[J]. 第三军医大学学报, 2020,42(4):384-391.
[23] 杨彦君,熊屹,程志刚,等.苗药九仙罗汉接骨汤干预胫骨干骨折不同时相点的X射线比较[J].中国组织工程研究,2012,16(50): 9311-9315.
[24] 燕梦云,依香叫,李金诚,等.刺老苞根皮水提物对成骨细胞TGF-β/BMPs信号通路的影响[J]. 药物评价研究,2017,40(11):1541-1544.
[25] 罗清龙, 唐良华, 刘玉召,等. 苗药九仙罗汉接骨汤对SD大鼠胫骨骨折愈合中bFGF基因表达的影响[J]. 亚太传统医药,2018,14(6): 27-29.
[26] 安晓晖, 刘恩, 吕飞,等. 基于VEGF/VEGFR-2信号通路探讨穿山龙总皂苷促进去势大鼠骨折血管形成和骨折愈合的效果[J]. 中国中医急症, 2020, 29(5):846-849,869
[27] 温慧敏, 尹小娟, 杨沙,等. 小儿伤科方泡腾颗粒和配方颗粒对闭合性骨折大鼠的治疗效果研究[J]. 解放军医药杂志,2019,31(12): 19-22,28.
[28] 冯洋, 陈跃平, 章晓云,等. 骨生长因子调控骨折愈合机制及在骨再生修复中的作用[J]. 中国组织工程研究,2019,23(4):613-620.
[29] 黄孝斌,黄河,杨宏泉. 骨伤康颗粒对兔桡骨骨折模型VEGF,NO及ALP表达的影响[J]. 中国中医急症,2020,29(3):423-425,429.
[30] 蔡郁,陈小波,朱文清,等. 血清中血管内皮生长因子和血小板源性生长因子与胫腓骨骨折患者骨折愈合及关节功能的关系[J]. 中国卫生检验杂志,2019,29(9):1116-1118.
[31] 金培程, 程正江. 闭合复位髓内钉固定治疗股骨干骨折对VEGF,HIF-1α表达的影响[J]. 现代医学,2020,48(2):201-206.
[32] 冯宗贤,郑敏哲,徐君翔,等.高压氧辅助治疗胫骨骨折的临床疗效及对血清FGF-2和IGF-1的影响[J].中华航海医学与高气压医学杂志,2019,26(3):239-241.
[33] 白秋芳, 邹明, 张继志,等. IGF-1对2,5-己二酮诱导的骨髓间充质干细胞凋亡的拮抗作用研究[J]. 大连医科大学学报,2020,42(1):5-10.
[34] 赵子星,李宏宇,席立成,等.体外冲击波疗法联合仙桃草口服用于兔桡骨骨不连临床效果观察[J].山东医药,2016,56(36):31-33.
[35] 唐良华,杨彦君.苗药九仙罗汉接骨汤促进兔胫骨干骨折愈合的动物实验研究[J].贵阳中医学院学报,2014,36(1):25-26.
[36] 鲍根强,肖春来,张国辉,等.甲状旁腺激素联合降钙素对大鼠骨质疏松性骨折骨生长因子的影响[J]. 中国骨质疏松杂志,2020,26(4): 480-484,489.
[37] 杨彦君,熊屹,唐良华,等.苗药九仙罗汉接骨汤干预对兔骨折模型的病理染色变化及血管内皮生长因子表达的作用[J].中国老年学杂志,2015,35(4):1002-1004.
[38] 罗清龙,唐良华,熊屹,等.苗药九仙罗汉接骨汤促进SD大鼠胫骨骨折愈合中TGF-β1动态表达[J].贵州医药,2019,43(4):526-529.
[39] 杨彦君,熊屹,程志刚,等. 苗药九仙罗汉接骨汤促进胫骨干骨折的愈合[J].中国组织工程研究,2012,16(46):8566-8570.
[40] 杨彦君,唐良华. 苗药九仙罗汉接骨汤促进骨折愈合的临床效应[J].贵阳中医学院学报,2013,35(2):265-267.
[41] 罗清龙.苗药九仙罗汉接骨汤对大鼠胫骨骨折后TGF--β1、BMP--2、bFGF基因及蛋白动态表达的实验研究及其临床疗效观察[D].贵阳:贵阳中医学院,2018.
[42] 熊屹.苗药九仙罗汉接骨汤促进骨折愈合实验研究[C].贵阳:第25届全国脊柱脊髓学术会议暨2013年贵州省骨科年会,2013.
[43] 唐良华.苗药九仙罗汉接骨汤干预对兔骨折模型的HE变化及VEGF表达的实验观察[C].贵州省医学会骨科学分会2014年学术年会,2014.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2019年5月至2020年4月在贵州中医药大学实验动物研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物与分组 SPF级雄性SD大鼠60只，来自长沙迈越公司，实验动物许可证号：SCXK(湘)2019-0005，鼠龄在6-8周，体质量为122-132 g，常规饲养。随机分为模型组20只、苗药组20只、三七组20只，实验已经过贵州中医药大学第二附属医院动物伦理委员会批准(2018-072)。
1.3.2 实验药物九仙罗汉接骨汤煎剂由仙桃草(批号：Z42020142)20 g、九节茶(批号：14061606)15 g、地罗汉(货号：0001)3 g组成，九仙罗汉接骨汤所需草药均为亳州杰康堂公司的产品，按照680 g/L浓度熬制后，4倍稀释，按传统方法煎煮后无菌封瓶，4 ℃冷藏柜储存备用[10]。三七粉(西安天宝公司，批号：130227)溶水后，杀菌备用，含生药20 g/L。
1.3.3 实验试剂戊巴比妥钠(陕西养元神公司，货号：P15453)；红霉素软膏(上海通用公司，批号：H34020379)；茜素红染色液(武汉卡诺斯公司，货号：YT8939)；地塞米松(佛山晟熠公司，货号：40323ES03)；高糖DMEM培养液(北京百奥来博公司，货号：GNM-12850)；青霉素(湖南泰仁公司，货号：18140-122)；MTS-858型生物力学实验机(济南美斯特公司)；β-甘油磷酸钠(山东腾望公司，货号：101)；胰蛋白酶(安徽中南公司，批号：H31022008)；骨形态发生蛋白 2一抗(上海依赫公司，货号：CL-1012T)；转化生长因子β(上海帛科公司，货号：BK-K5081)；Smad1(货号：H00004086)、Smad2(货号：A-AJ1723b)、GAPDH一抗(货号：ABP50152)均为武汉艾美捷公司产品；辣根过氧化物酶二抗厂商(河北翰林公司)；血管内皮生长因子试剂盒(上海莼试生物公司，货号：CP913905)；胰岛素样生长因子1试剂盒(武汉伊莱瑞特公司，货号：E-EL-M3006)。
1.4 实验方法
1.4.1 改良钻孔法建立不完全性骨折模型及药物干预所有大鼠腹内注射30 mg/kg戊巴比妥钠麻醉，备皮，于造模台上固定，消毒。双下肢胫骨结节下2 mm沿胫骨脊切长约 1.5 cm切口，继续沿外侧缘0.5 mm纵轴切开浅、深筋膜层，展露胫骨外骨面。充分显露术野后，小功率钻在鼠膝关节胫骨结节下2 mm处由胫骨外骨面向髓腔造孔道，钻头直径为0.3 mm，可钻达髓腔，但不破坏内侧骨外皮质，原孔道1处换1 mm钻头扩大孔道，在第一孔下沿胫骨纵轴方向，孔间距2 mm，依照前法造孔道2及孔道3。冲洗，缝合切口，适量红霉素软膏外敷，术后分笼饲养，持续3 d肌内注射青霉素。建模及建模成功标准见参考文献[11]。所有动物于骨折当天开始给药，苗药组给予苗药九仙罗汉接骨汤煎剂(2 mL/kg)灌胃[12]，三七组给予同体积三七粉液(1 mL/kg)灌胃，模型组给予同等剂量蒸馏水灌胃，1次/d，共28 d。

1.4.2 茜素红染色检测骨髓间充质干细胞成骨分化给药 28 d后，将每组大鼠注射30 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后处死，并将大鼠放入乙醇中浸泡0.5 h后，取出胫骨，将骨髓腔冲洗干净后，2 250 r/min离心5 min，将上清液祛除后重悬，加入分离液，再次离心，将乳白色界面细胞吸出后PBS清洗，再次离心后将沉淀物震荡均匀制成细胞悬液后进行培养(经流式细胞仪鉴定为骨髓间充质干细胞)。48 h后换液，当长至80%时，传代，加入体积分数10%FBS、高糖DMEM、地塞米松0.1 μmol/L、维生素C 50 mg/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L的成骨诱导培养液培养。至21 d时，进行茜素红染色。去除多余培养基，PBS冲洗3次，每次1 min。加入甲醛，固定0.5 h。冲洗，加入2 mL茜素红染液染5 min，除去染液，PBS冲洗，显微镜下观察并记录。
1.4.3 RT-PCR检测骨形态发生蛋白 2、转化生长因子β、Smad1、Smad2 的mRNA水平取各组大鼠胫骨骨折组织，剪碎，胰酶消化后提取细胞悬液，冲洗。提取总 RNA，Primer 5.0 合成引物。 PCR 反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 40 s，以β-actin为内参，共40个循环。见表1。

1.4.4 三点弯曲试验检测各组大鼠生物力学指标取各组大鼠右侧胫骨，并置于MTS-858型生物力学实验机上，支点跨距17 mm，加载速度为2 mm/min，记录载荷原位移曲线，计算最大载荷和刚度。
1.4.5 苏木精-伊红染色检测骨组织形态学及组织愈合评分药物干预1周(每组取5只大鼠)、2周(每组取5只大鼠)、4周(每组取10只大鼠)后，无菌条件下随机取出一侧胫骨骨组织(1 cm×1 cm)，甲醛固定，硝酸脱钙，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，沿平行长轴方向切片，片厚4 μm，苏木精-伊红染色，光镜下观察染色结果。根据吴雪花等[12]组织学骨折愈合评分标准观察骨折愈合情况：1分，少量纤维组织；2分，大量纤维组织；3分，纤维组织和软骨组织等量；4分，软骨组织多于纤维组织；5分，软骨组织为主；6分，主要是软骨组织，少量不成熟骨组织；7分，软骨组织与不成熟骨组织等量；8分，主要为不成熟骨组织，少量软骨组织；9分，不成熟骨组织；10分，成熟骨组织。
1.4.6 检测各组大鼠血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1水平取各组大鼠尾部静脉血2 mL，3 000 r/min离心 10 min，取上层清液保存于零下20 ℃。采用ELISA法检测血清中血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1水平。
1.4.7 X射线片检测骨折愈合程度大鼠骨折胫骨标本收集后立即使用RADspeed数字化X射线摄影系统(40 kV，1.2 mA)拍摄 X射线片。参照文献[13]的方法，将骨折愈合程度分为：不愈合、可能愈合和完全愈合。
1.4.8 Western blot检测各组大鼠骨形态发生蛋白 2、转化生长因子β、Smad1、Smad2蛋白水平取各组大鼠骨组织，裂解液裂解，运转离心机后保留上清液，放入样孔中，进行电泳实验。PVDF膜TBS浸泡10 min，反复PBS冲洗，5 min/次，加入1抗骨形态发生蛋白 2、转化生长因子β、Smad1、Smad2和GAPDH抗体(1∶500)，后放入辣根过氧化物酶2抗体(1∶2 000)，杂交冲洗。将膜浸入ECL工作液，后检测并获取图象。
1.5 主要观察指标 ①大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化结果；②胫骨最大载荷、刚度水平；③胫骨病理组织形态及组织愈合评分；④大鼠血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1水平；⑤骨愈合程度；⑥胫骨组织骨形态发生蛋白 2、转化生长因子β、Smad1、Smad2的mRNA和蛋白水平。
1.6 统计学分析 SPSS 17.0软件分析，组间比较采用单因素方差分析，数据采用x±s表示，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

骨折在人们的日常生活中较为常见，其对患者的生命威胁较小，但会影响患者的自主行动能力，如果得不到良好的治疗，还会面临截肢的风险[14-15]。目前已有研究证实中药及蛋白因子对患者的治疗具有较好的效果，此次实验通过改良钻孔法建立不完全性骨折模型，根据苏木精-伊红染色结果可知模型建立成功，并用苗药九仙罗汉接骨汤介导BMPs/Smad信号通路研究其对胫骨骨折大鼠成骨分化及骨折愈合能力的影响。

有多种信号通路均可调控成骨分化，其中BMPs/Smad信号通路起到了重要的作用[16]。骨形态发生蛋白广泛存在于骨基质中，是骨折愈合的关键性细胞因子之一，具有诱导充质间干细胞分化为成骨细胞的能力，可促进骨形成，其中以骨形态发生蛋白 2效果最为明显[17-19]。转化生长因子β可促进成骨细胞的分化，诱导骨形成，增进骨强度，加快骨修复和再生[20-22]。在此次研究中，模型组大鼠体内骨形态发生蛋白 2、转化生长因子β、Smad1、Smad2水平降低，在经过苗药九仙罗汉接骨汤的治疗后，各指标水平增加，发挥了促成骨分化及骨修复的能力。苗药九仙罗汉接骨汤中地罗汉具有舒筋活血、接骨止痛等作用[23]。在燕梦云等[24]对胫骨骨折大鼠成骨细胞的研究中提出，转化生长因子β、骨形态发生蛋白通过与细胞内特定的Samd蛋白形成异聚复合体，被激活后具有转录调节的功能，最终促进骨形成。罗清龙等[25]在胫骨骨折大鼠的实验研究中提出，苗药九仙罗汉接骨汤可加快骨折的愈合，对骨折的治疗具有一定的效果，其作用机制可能是通过促进转化生长因子β的表达来完成的。此次研究结果与上述研究的结果相似，因此作者认为苗药九仙罗汉接骨汤通过提高转化生长因子β的水平从而促进骨形态发生蛋白 2、Smad1、Smad2的表达，进而发挥促进成骨分化及骨修复的作用。在此次实验的茜素红染色以及三点弯曲实验结果中也可发现经过苗药九仙罗汉接骨汤治疗后成骨细胞增加，有大量的钙结节形成，骨折大鼠的骨最大载荷及刚度也有明显的提升，且运用X射线片观察骨痂生长情况的结果也表明已完全愈合，这一结果也可证实苗药九仙罗汉接骨汤可促进骨折大鼠成骨分化，加快骨修复，具有一定的治疗作用。

血管内皮生长因子主要存在于骨细胞内，可促进内皮细胞的增殖，加快血管的生长[26-27]。有研究已证实，血管内皮生长因子在骨形成中具有一定的作用，可通过加快血管的新生促使骨发育；通过刺激血管内皮生长因子的表达，可使骨折处血管增加、血流加快，使大量的骨折愈合因子流动于骨折损伤处，促进骨折处血管新生，新骨增加，可加快骨愈合[28-31]。胰岛素样生长因子1可促进骨细胞及软骨细胞的增殖与分化[32-33]。根据此次研究发现，在模型组中血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1水平降低，在经过苗药九仙罗汉接骨汤治疗后水平有所提高。已有研究证实九仙罗汉接骨汤具有活血散瘀、接骨消肿、止痛的功效，且其方中的仙桃草与九节茶均具有活血化瘀的功效[34-35]。在鲍根强等[36]对骨质疏松骨折大鼠的实验研究中提出，血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1与骨形态发生蛋白 2、转化生长因子β具有正相关关系，提高其水平后可促进大鼠成骨分化，改善骨形态学，加快骨的愈合。杨彦君等[37]在对兔骨折的实验研究中表明，通过促进血管内皮生长因子的表达可有效促进其骨痂的形成，缩短愈合时间。此次研究结果与上述研究的结果相似，结果提示，苗药九仙罗汉接骨汤可能通过提高血管内皮生长因子的水平从而激活胰岛素样生长因子1蛋白表达，促进骨痂形成，加快骨修复，且苏木精-伊红染色结果也证实，在经过治疗后模型大鼠的骨小梁变粗，髓腔空隙缩小，软骨细胞骨化增多，这一结果也可证实苗药九仙罗汉接骨汤对骨折的治疗效果[38-43]。

综上所述，苗药九仙罗汉接骨汤可促进成骨细胞分化，加速骨折愈合，其作用机制可能是通过激活BMPs/Smad信号通路来实现。此次研究验证了苗药九仙罗汉接骨汤通过介导BMPs/Smad信号通路表达对胫骨骨折大鼠的治疗效果，目前此类研究层出不穷且方式方法各式各样，各类文献繁多，且近几年对此类的研究多集中于信号通路传导方面，后期将从其他信号通路或生物学靶点入手，进一步探究苗药九仙罗汉接骨汤对胫骨骨折的作用机制，为后期胫骨骨折的临床治疗提供实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

苗药九仙罗汉接骨汤干预胫骨骨折模型大鼠的成骨分化及骨折愈合

Effect of Miao medicine Jiuxian Luohan Jiegu Decoction on osteogenic differentiation and fracture healing in tibial fracture rats

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 12

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	李睿, 史文, 杨士彩, 吕林蔚, 张春秋. 夹板外固定与散巴布剂对桡骨骨折模型兔骨愈合的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1329-1333.
[2]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[3]	董艺, 单帅, 刘佳林, 韩祥帧, 何惠宇. 敲低环状RNA mmu_circ_0001775可提高小鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(30): 4767-4772.
[4]	申恩谱, 黄霸, 刘丹平, 綦惠, 吴志文, 李贝贝. 褪黑素预处理的骨髓间充质干细胞外泌体促进骨髓间充质干细胞成骨[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(30): 4800-4805.
[5]	艾力麦尔旦·艾尼瓦尔, 木合塔尔·霍加, 王玲. 转化生长因子β3与骨形成蛋白2对牙髓干细胞增殖和成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(30): 4862-4866.
[6]	李熙恒, 李欣悦, 毛天娇, 杨婉琪, 唐亮, 李江. 大麻二酚促进人牙周膜干细胞增殖和成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(30): 4867-4872.
[7]	黄为, 董盼锋, 黄有荣, 夏天. 淫羊藿调控骨髓间充质干细胞分化防治骨质疏松的相关信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(30): 4889-4895.
[8]	刘泽民, 吕欣. 髓内钉在四肢长管状骨骨折治疗中的应用：扩髓与不扩髓[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(3): 461-467.
[9]	罗臻, 黄禹僖, 柴生颋, 李飞龙, 陈群群. 补肾健脾活血方与靶点密切相关组蛋白去甲基化酶JMJD2B在骨质疏松症中促成骨分化：体外细胞实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(29): 4643-4650.
[10]	王静, 杨九菊, 王宁宁, 刘超. 改性3D打印钛支架对脂肪间充质干细胞成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(27): 4265-4271.
[11]	高昭, 赵宇昊, 何易祥, 赵海燕, 王文己 . 基于DNA水凝胶药物输送及在骨组织工程研究中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(27): 4379-4385.
[12]	黄涛, 贾志强, 赵晓光, 王磊, 方丽萍, 翟文静, 翟莎菲, 周永新. LncRNA-HOTAIR可调节脂肪间充质干细胞向成骨细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(25): 3951-3955.
[13]	陈迟迟, 张雨, 何家辰, 施勤. 肥胖小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3846-3851.
[14]	尤武林, 黄桂成, 王建伟. 微囊化转基因骨髓间充质干细胞与成骨细胞共培养后的成骨分化潜能[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3852-3857.
[15]	崔寅鹏, 郭艾, 马立峰, 刘振江. 哇巴因体外诱导人骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3796-3801.