明胶-海藻酸盐复合微球与凝胶修复软骨损伤

doi:10.12307/2022.297

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (28): 4452-4457.doi: 10.12307/2022.297

• 组织工程软骨材料 tissue-engineered cartilage • 上一篇下一篇

明胶-海藻酸盐复合微球与凝胶修复软骨损伤

蒋浩然1，2，高健明2，林万程1，2，李婷2，李获2，王鹏2，冯靖2，孟昊业2，彭江2，丁立祥1

1北京大学第九临床医学院，首都医科大学附属北京世纪坛医院脊柱外科，北京市 100038；2中国人民解放军骨科研究所，全军骨科战创伤重点实验室，骨科再生医学北京市重点实验室，北京市 100853

收稿日期:2019-02-19 接受日期:2020-03-12 出版日期:2022-10-08 发布日期:2022-03-18
通讯作者: 丁立祥，主任医师，教授，北京大学第九临床医学院，首都医科大学附属北京世纪坛医院脊柱外科，北京市 100038 彭江，研究员，中国人民解放军骨科研究所，北京市 100853
作者简介:蒋浩然，男，1995年生，江苏省扬州市人，汉族，北京大学医学部在读硕士，主要从事组织工程微载体构建、干细胞分化调控研究及脊柱外科手术改良方面的研究。
基金资助:
北京市医院管理中心重点医学专业发展计划(ZYLX202135)，项目负责人：丁立祥

Gelatin-alginate composite microspheres and gels for cartilage damage repair

Jiang Haoran1, 2, Gao Jianming2, Lin Wancheng1, 2, Li Ting2, Li Huo2, Wang Peng2, Feng Jing2, Meng Haoye2, Peng Jiang2, Ding Lixiang1

1Department of Spine Surgery, Beijing Shijitan Hospital Affiliated to Capital Medical University, the Ninth School of Clinical Medicine, Peking University, Beijing 100038, China; 2Institute of Orthopedics, Department of Orthopedics, Army Key Laboratory of Warfare Trauma, Beijing Key Laboratory of Orthopedic Regenerative Medicine PLA, Beijing 100853, China

Received:2019-02-19 Accepted:2020-03-12 Online:2022-10-08 Published:2022-03-18
Contact: Ding Lixiang, Chief physician, Professor, Department of Spine Surgery, Beijing Shijitan Hospital Affiliated to Capital Medical University, the Ninth School of Clinical Medicine, Peking University, Beijing 100038, China Peng Jiang, Researcher, Institute of Orthopedics, Department of Orthopedics, Army Key Laboratory of Warfare Trauma, Beijing Key Laboratory of Orthopedic Regenerative Medicine PLA, Beijing 100853, China
About author:Jiang Haoran, Master candidate, Department of Spine Surgery, Beijing Shijitan Hospital Affiliated to Capital Medical University, the Ninth School of Clinical Medicine, Peking University, Beijing 100038, China; Institute of Orthopedics, Department of Orthopedics, Army Key Laboratory of Warfare Trauma, Beijing Key Laboratory of Orthopedic Regenerative Medicine PLA, Beijing 100853, China
Supported by:
the Key medical professional development plan of beijing hospital management center, no. ZYLX202135 (to DLY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
明胶：是胶原在高温作用下变性的产物，相对分子质量分布较宽，从几万到10万不等，在实际应用中往往对分子质量进行进一步的限定，此次实验使用高分子量(分子质量大于5万)的明胶。
海藻酸钠：分子由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸按(1→4)键连接而成的聚合物，是一种天然多糖，常被用作靶向纳米粒子如包裹磁性颗粒等，同时还被用作包含了庆大霉素的磁性纳米颗粒表面修饰物，以进行靶向抗菌治疗。

背景：软骨损伤的微创治疗对于微载体的要求较高，需要其有较高的细胞相容性、较强的细胞黏附力、较好的力学性能与低免疫原性。同时，临床使用条件相比实验室更加苛刻，在微创或注射使用微载体时液态微载体要明显优于固态微载体。
目的：制备一种全新的高分子有机微载体，以用于修复软骨缺损。
方法：通过明胶与液体石蜡(W/O)混合搅拌的化学乳化法制备浓度为6%的明胶微球，冻干后用无水乙醇处理固定，再使用紫外交联法固定，电镜观察微球形态。配置浓度为7%的海藻酸钠凝胶，与明胶微球混合孵育2 h，制备明胶-海藻酸盐复合凝胶。将脂肪间充质干细胞悬液滴入明胶-海藻酸盐复合凝胶中孵育24 h，滴入5%CaCl2溶液中充分交联，制备含细胞明胶-海藻酸盐复合微球。采用CCK-8法检测无细胞明胶-海藻酸盐复合微球浸提液的细胞毒性；利用死活染色观察含细胞明胶-海藻酸盐复合微球的细胞活性；将约1 mL明胶-海藻酸盐复合凝胶吸入10 mL针管进行注射，对未注射与注射1，3次的凝胶进行光镜观察。
结果与结论：①扫描电镜下可见，明胶微球孔隙相对均一且表面有层次感，微球粒径大多分布在180-500 μm之间；②死活染色显示，培养24 h含细胞明胶-海藻酸盐复合微球中的细胞生长良好，携带细胞数量多且分布均匀，培养1，3，7 d后的细胞活性均在90%以上；③CCK-8检测显示，无细胞明胶-海藻酸盐复合微球浸提液无明显的细胞毒性；④与未注射时相比，注射1，3次后明胶-海藻酸盐复合凝胶中的明胶微球形态无变化，显示明胶-海藻酸盐复合凝胶体力学性能良好；⑤结果表明，联合使用含细胞明胶-海藻酸盐复合微球及含细胞明胶-海藻酸盐复合凝胶可使凝胶发挥组织胶的作用，利于材料紧贴目标区域。

https://orcid.org/0000-0002-1573-3640 (蒋浩然)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 明胶, 海藻酸盐, 复合微球, 复合凝胶, 高分子有机材料, 化学乳化法, 细胞相容性, 光交联, 软骨

Abstract: BACKGROUND: Minimally invasive treatment of cartilage injury is highly demanding for microcarriers, which need to have high cytocompatibility, strong cell adhesion, better mechanical properties with low immunogenicity. Simultaneously, the clinical use conditions are more demanding compared to the laboratory, and liquid microcarriers are significantly better than solid microcarriers when they are used minimally invasively or for injection.
OBJECTIVE: To prepare a brand-new polymer organic microcarrier for repairing cartilage.
METHODS: Gelatin microspheres at a concentration of 6% were prepared by chemical emulsification of gelatin mixed and stirred with liquid paraffin (w/O), fixed by lyophilization followed by absolute ethanol treatment, then fixed using ultraviolet cross-linking. The microsphere morphology was observed by electron microscopy. The gelatin-alginate composite gel was prepared by dispensing the gel with sodium alginate at a concentration of 7% and incubating with gelatin microspheres for 2 hours. Cell-containing gelatin-alginate composite microspheres were prepared by dropping adipose mesenchymal stem cell suspension into gelatin-alginate composite gel and incubating for 24 hours, and fully crosslinking by dropping into 5% CaCl2 solution. The cytotoxicity of the extracts from cell-free gelatin-alginate composite microspheres was examined by CCK-8 assay. The cytocompatibility of cell-containing gelatin-alginate composite microspheres was observed by using live & dead staining. Approximately 1 mL of gelatin-alginate composite gel was aspirated into a 10 mL needle tube for injection, and the gel not injected versus injected 1 and 3 times was observed by light microscopy.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) As observed by scanning electron microscope, the pores of gelatin microspheres were relatively uniform and the surface was hierarchical, and most of the particles were distributed between 180 and 500 μm in size. (2) As indicated by the live & dead staining, the cells in gelatin-alginate composite microspheres containing cells grew well and carried a large number and even distribution of cells at 24 hours of culture, and the cell viability was above 90% after 1, 3, and 7 days of culture. (3) CCK-8 assays showed no significant cytotoxicity of extracts from cell-free gelatin-alginate composite microspheres. (4) The morphology of the gelatin microspheres in the gelatin-alginate composite gel was unchanged after 1 and 3 injections compared with that when it was not injected, indicating good mechanical properties of the gelatin-alginate composite gel. (5) The results indicated that the combined use of cell-containing gelatin-alginate composite microspheres and cell-containing gelatin-alginate composite gels could make the gels play the role of tissue glue, which is beneficial for materials to adhere closely to the target area.

Key words: gelatin, alginate, composite microspheres, composite gel, polymer organic materials, chemical emulsification, cell compatibility, photo crosslinking, cartilage

中图分类号:

蒋浩然, 高健明, 林万程, 李婷, 李获, 王鹏, 冯靖, 孟昊业, 彭江, 丁立祥. 明胶-海藻酸盐复合微球与凝胶修复软骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(28): 4452-4457.

Jiang Haoran, Gao Jianming, Lin Wancheng, Li Ting, Li Huo, Wang Peng, Feng Jing, Meng Haoye, Peng Jiang, Ding Lixiang. Gelatin-alginate composite microspheres and gels for cartilage damage repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(28): 4452-4457.

图/表（结果） 9

2.1 明胶微球中明胶溶液浓度的选择明胶微球表面微结构由电镜拍摄，观察明胶溶液浓度分别为2%，6%，10%，20%时的形态与孔隙，见图1，综合判断发现，当明胶溶液为6%浓度时，微球的孔隙相对均一且表面更有层次感，课题组一致认为此浓度最为理想。

2.2 明胶微球交联效果的观察取同一批次、同一浓度、相同粒径区间的明胶微球，分成2组，一组不进行紫外交联，一组进行紫外线交联，泡水后24，72 h进行光镜下观察，见图2，可见未交联明胶微球难以维持形状完整，而经过紫外线交联的微球外形保持完好，紫外线交联后明胶微球形态维持能力大幅提升。

2.3 明胶微球的体积分布收集无水乙醇固定后的明胶微球5 g，使用各级筛板(74，154，180，355，500 μm)进行微球大小筛选，按明胶微球直径大小分布区间分装，分为：< 74 μm，74-154 μm，155-180 μm，181-355 μm，356-500 μm及>500 μm共6组，全部使用相同的天平进行称质量，重复3次，取平均值，见图3，可见明胶微球粒径大多分布在180-500 μm之间。粒径过小的微球无法满足细胞生长的需求，且粒径过小产量会下降，粒径过大的微球与化学乳化法的制作过程相冲突，难以维持均一的外形。

2.4 明胶-海藻酸盐复合微球的制备明胶微载体制成后的大体观见图4A，海藻酸盐凝胶大体观见图4B。P3代脂肪间充质干细胞生长较好，见图4C。通过改变明胶微球与海藻酸盐凝胶的比例可以改变微球的密度，综合各方面因素来看，课题组认为明胶微球与海藻酸盐凝胶体积比例为1∶2时效果最佳，见图4D。

2.5 含细胞明胶-海藻酸盐复合微球的死活染色含细胞明胶-海藻酸盐复合微球中的细胞生长良好，携带细胞数量多且分布均匀，见图5。孵育1，3，7 d后的激光共聚焦显微镜下可见，细胞活性均在90%以上，见图6。

2.6 无细胞明胶-海藻酸盐复合微球的细胞毒性检测明胶-海藻酸盐复合微球浸提液没有细胞毒性，细胞生长趋势与对照组基本一致，见图7。

2.7 明胶-海藻酸盐复合微载体力学性能的检测无细胞明胶-海藻酸盐复合凝胶注射1，3次的光镜下观察，见图8，明胶微球形态无变化，由此可以看出明胶-海藻酸盐复合微载体力学性能良好。

2.8 10%葡萄糖酸钙溶液的配置及使用 10%葡萄糖酸钙溶液与5%CaCl2溶液在交联海藻酸钠这一点上无明显差异，无论是交联速率还是交联强度，因此10%葡萄糖酸钙溶液可以替代5%CaCl2溶液进行海藻酸盐交联。然而常温下，葡萄糖酸钙仅微溶于水，在查询了相关资料后，课题组发现葡萄糖酸钙微溶于水可能与水在常温下溶解空气中的CO2气体所致，因此将水温加热至100 ℃后溶解葡萄糖酸钙，快速转移至可高温高压消毒的密封容器中进行高温高压消毒，即可制得无菌的10%的葡萄糖酸钙溶液。
2.9 微球生物相容性由CCK-8实验与细胞死活染色可知，明胶-海藻酸盐复合微球具有良好的生物相容性。

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引言

自从1992年 KAISER[1] 提出了再生医学的概念，相关研究已经成为医学领域内最热门的研究方向之一。再生医学发展至今，虽然仍然以干细胞相关研究作为主体，但再生医学早已不止于此，包括了组织工程、基因治疗、生物材料、纳米技术及许多其他的学科[2]。对于组织工程的应用，基于蛋白质的生物聚合物(如明胶)是首选，不仅仅因为这类物质对细胞和药物的负载能力[3]，更因为他们所带有的功能性基团，这些都是对于材料功能延伸的重要因素[4]，例如这些基团可以为明胶的生物功能特性提供巨大的化学修饰机会[5]，使材料可以用在更多原先可能并不适用的地方，例如传统手术方法难以满足临床需求的软骨损伤。

软骨是一种存在于滑膜关节、脊柱、肋骨等的无血管、神经的结缔组织，分为透明软骨、纤维软骨和弹性软骨3类[6]。透明软骨主要是由聚集性多糖这种蛋白多糖组成，由百余条硫酸软骨素糖胺多糖取代的核心蛋白和少量的硫酸角蛋白组成[7]。许多软骨疾病(如骨关节炎、脊柱外膜干垢端发育不良)的病因及发病机制尚不明确[8]，治疗方法也不甚理想，而且软骨损伤早期往往没有症状，等到疾病发展到基质受到严重结构破坏后才会出现症状，这导致软骨损伤的治疗极具挑战性。在这样的临床背景下，急需全新的治疗方法修复软骨损伤，这种方法需要在能够切实修复和再生软骨的同时具有低侵入性，使用微创手术甚至不需要手术以直接注射的方式进行治疗。这样的治疗方式有别于传统手术，原来的手术耗材也无法实现较低的侵入性，制作全新的、高生物亲和性的微载体可以满足低侵入性甚至注射的要求。作为前人深入研究过的材料，明胶及海藻酸盐兼具高生物亲和性、生化特性稳定、免疫原性低的特征，故成为了此次实验的首选。

明胶是一种食品制作中常用的材料[9]，独特的凝胶特性使其成为了一种饱受欢迎的食品，同时其也被批准使用在医学领域特别是药物胶囊等方面，尤其是将其作为微粒子或者微球用于药物受控释放系统[10-11]，最初是20世纪60年代由田中等开始的尝试，他们开发了一种含有磺胺或者核黄素的口服明胶微球[12]。明胶微球呈球形，表面光滑，直径一般在6-200 µm之间，大鼠间充质干细胞足以在明胶微球上贴附[13]。但是明胶也存在一些问题，虽然明胶为胶原水解的产物，但是免疫原性却不如胶原，可能是因为缺乏特定的氨基酸，较易引发免疫原性反应[14]。目前常用制备明胶微球的方法包括凝聚相分离法[15-16]、电场辅助制备法[17-18]、化学乳化法[5，19-21]。曾有研究报道过含有明胶的微载体可以促进细胞的增殖，并具有修复软骨损伤的潜力[22]，因此使用明胶这类高分子材料制成的微载体时就可以进一步促进种子细胞的分化，获得更好的修复效果。同时，使用天然微载体(如壳聚糖、明胶、海藻酸盐等)而非合成微载体(聚丙烯酰胺、葡萄糖、聚丙乙烯等)不仅极大提升了生物相容性，还避免了无机物植入可能带来的毒性，更因为天然微载体含有细胞识别位点而使细胞生长得更好[23]，进一步提升了种子细胞的生长繁殖，提高了种子细胞的修复效果。
海藻酸钠分子是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸按(1→4)键连接而成的聚合物，是一种天然多糖[24]，常被用作靶向纳米粒子如包裹磁性颗粒等[25]，海藻酸钠包裹磁性颗粒在体外环境中被用来控制顺铂的给药系统[26]，同时海藻酸钠还被用作包含了庆大霉素的磁性纳米颗粒表面修饰物，以进行靶向抗菌治疗[27]。此外，含有海藻酸钠的微球包裹超顺磁性纳米被用于纯化α-淀粉酶[28]。海藻酸盐与间充质干细胞的细胞相容性良好，负载能力强，且负载细胞的成活率高[29]。

明胶及海藻酸盐均有各自的优劣，两者的一些特性也可以产生互补，故课题组综合使用两种材料制作明胶-海藻酸盐复合微球，负载脂肪干细胞用以修复软骨缺损。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料-细胞生物相容性及材料力学评价，体外细胞学实验。
1.2 时间及地点实验于2019年7月至2020年9月期间在中国人民解放军总医院骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 3 d龄SD大鼠5只，SPF级，购自北京科宇动物养殖中心。
1.3.2 主要试剂和设备 RW050电动搅拌器(上海沪析实业有限公司)；LGJ-18真空冷冻干燥机(河南兄弟仪器设备有限公司)；BLX-E254紫外交联仪(法国VILBER LOURMAT公司)；TCS SP8共聚焦显微镜(德国Leica公司)；BH-2型倒置显微镜、IX 70型荧光显微镜(日本Olympus公司)；细胞死活荧光染色试剂(美国Biovision公司)；Ⅱ型胶原酶(美国Sigma公司)；胎牛血清(北京元亨圣马)；DMEM培养液(Corning，美国)；PBS(1X，北京索莱宝科技有限公司)；SU8020场发射扫描电子显微镜(日本日立集团)；SMZ25体视显微镜(日本尼康公司)；紫外线交联仪(法国VILBER LOURMAT公司)；酶标仪(美国伯爵仪器有限公司)。
1.4 方法
1.4.1 无细胞明胶微球的制备首先配置一定浓度(2%，6%，10%，20%)的明胶水溶液作为水相，缓慢滴入液体石蜡和Span-80充分混合均匀的油相中，使用电动搅拌器以恒定速率搅拌30 min，然后将悬液快速倒入足量液氮中，再用石油醚在零下环境中去除微球表面覆盖的石蜡，再将初步制得的微球冻干造孔后密封保存。场发射电子扫描显微镜下观察微球形态。取同一批次、同一浓度、相同粒径区间的明胶微球，分成2组，一组不进行紫外交联，一组进行紫外线交联，泡水后24，72 h光镜下观察交联效果。
1.4.2 脂肪间充质干细胞的原代培养取3 d龄SD大鼠5只，过量CO2处死，体积分数75%乙醇浸泡消毒5 min后转移入超净台。在超净台中，使用已消毒灭菌的眼科剪横向环形剪开腹股沟附近皮肤，小心剥离皮肤，避免损伤腹膜暴露腹腔内容物产生污染，使用眼科镊轻柔的从皮肤上提取脂肪，用含5%青霉素链霉素的PBS依序漂洗3遍，移入青霉素小瓶中。用已灭菌的眼科剪将脂肪组织剪成1 mm×1 mm×1 mm的碎块，加入4-10倍脂肪体积(约7.5 mL)含0.1%Ⅱ型胶原酶的DMEM，混合均匀后放入磁珠，无菌封口，将青霉素小瓶放在37 ℃培养箱中以磁力搅拌器消化30 min(随时观察脂肪组织消化情况)。消化好后取出小瓶，移入超净台，无菌打开青霉素小瓶，向瓶中加入等体积的含体积分数5%胎牛血清的DMEM(低糖，10%)终止消化，然后通过100 μm滤网过滤。收集过滤后的消化液，1 700 r/min 离心5 min，弃上清。用间充质干细胞专用培养基DMEM重悬沉淀。接种于小培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养，48 h后首次换液，后续按照细胞生长情况进行换液及传代，待细胞融合率达到80%-90%时即可使用。
1.4.3 复合凝胶的制备
无细胞明胶-海藻酸盐凝胶的制备：将明胶微球使用紫外线交联仪以固定波长254 nm交联6 h，同时配置浓度7%的海藻酸盐凝胶。将明胶微球与海藻酸盐凝胶混合均匀，在37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱孵育2 h。
含细胞明胶-海藻酸盐复合凝胶的制备：当脂肪间充质干细胞融合率达到80%-90%时，在超净台中弃去细胞培养瓶中的间充质干细胞培养液，使用PBS清洗培养瓶3遍；加入0.25%的胰酶消化1 min，吹打后转移至无菌离心管中，1 500 r/min离心5 min，弃上清，使用少量间充质干细胞培养液重悬，保证每毫升悬液细胞数量约200万(细胞浓度为2×109 L-1)。以无细胞明胶-海藻酸盐复合凝胶为基础，向每毫升凝胶滴入100 µL细胞悬液，再次放入37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱孵育24 h。
1.4.4 复合微球的制备
无细胞明胶-海藻酸盐复合微球的制备：取出孵育完成的无细胞明胶-海藻酸盐凝胶，缓慢滴入彻底灭菌消毒的5%CaCl2溶液中，交联成球，制得直径约1 mm的球形水凝胶，静待3-5 min等待微球彻底交联完毕。将交联完毕的无细胞明胶-海藻酸盐复合微球用DMEM(低糖，10%)清洗3遍，放入足量间充质干细胞培养基中，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中保存。
含细胞明胶-海藻酸盐复合微球的制备：取出孵育完成的含细胞明胶-海藻酸盐复合凝胶，缓慢滴入彻底灭菌消毒的5%CaCl2溶液中，交联成球，静待3-5 min等待微球交联完毕。将交联完毕的明胶-海藻酸盐复合微球用DMEM(低糖，10%)清洗3遍，放入足量间充质干细胞培养基中，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养。每3 d弃去培养基，使用PBS清洗后，加入新的间充质干细胞培养基。体视显微镜下观察微球形态。
1.4.5 明胶-海藻酸盐复合微球的细胞相容性取含细胞明胶-海藻酸盐复合微球，培养1，3，7 d后进行死活染色：取出购买的LIVE/DEAD死活染液进行避光复温，复温后A液与B液按照1∶4的比例分别取出4 μL与20 μL，放入到新的无菌15 mL离心管中，同时加入10 mL的无菌PBS制备成死活染液，将死活染液滴加至对应时间节点的水凝胶块中，避光染色15 min，进行共聚焦显微镜拍摄。取孵育24 h的含细胞明胶-海藻酸盐复合微球，进行死活染色，置于荧光显微镜下拍照观察。
1.4.6 无细胞明胶-海藻酸盐复合微球的细胞毒性首先使用适量的间充质干细胞培养液浸泡10个无细胞明胶-海藻酸盐复合微球，37 ℃浸提24 h以提取浸提液。制备P3代的脂肪间充质干细胞悬液，进行细胞计数后按2 000/孔的密度接种到96孔板中，同样的样本做3个重复，分3组，其中两组每孔分别加入间充质干细胞培养液(对照组)、微球浸提液(实验组)各100 μL，空白对照组仅加入100 μL间充质干细胞培养液(无细胞)。置于37 ℃培养箱中培养1，3，5，7 d后，每孔加入CCK-8检测液10 μL，放回37 ℃培养箱中培养2 h，缓缓吸取待检测孔内的上清液，转移到新的96孔板对应的孔中，每一孔转移液体时更换一次枪头，同时需要保证加入新的液体没有气泡，转移完成后，将96孔板放入酶标仪测定450 nm处吸光度值，检测波长450-490 nm，参比波长600-650 nm，利用origion9.0画出细胞增殖曲线。
1.4.7 明胶-海藻酸盐复合凝胶的力学性能鉴定取约1 mL无细胞明胶-海藻酸盐复合凝胶，吸入10 mL针管进行注射，分别取未注射，注射1次及注射3次的进行光镜观察，比较注射对于明胶-海藻酸盐复合凝胶尤其是明胶微球的影响。
1.4.8 CaCl2溶液的替代物含细胞明胶-海藻酸盐复合微球使用了5%CaCl2溶液进行交联，但是CaCl2溶液存在一些自身的不足，比如会引起中毒，成年女性静脉注射20 mg/kg的CaCl2溶液就会引起急性中毒，包括皮肤和附件的毒性及营养和代谢系统的毒性，因此，急需找寻其他安全的替代品以提供Ca2+，可能有效的备选项有葡萄糖酸钙，配置成10%葡萄糖酸钙即可。
1.5 主要观察指标含细胞明胶-海藻酸盐复合微球的细胞相容性与无细胞明胶-海藻酸盐复合微球的细胞毒性。

讨论

明胶作为一种较为常用的组织工程高分子有机材料，就聚合物的安全性而言，体外与体内实验均证明其是无细胞毒性和非炎症性的[30]，海藻酸盐也被证实了良好的安全性和低免疫原性[31]。同时，明胶有众多的功能团，这些功能团为研究人员控制明胶的生物功能特性提供了显著的化学修饰机会[32]。此外，明胶的生物聚合物由于其独特的促细胞黏附的氨基酸序列而具有促进细胞黏附的特点[3]。

从术中损伤的角度来看，无论是利用关节镜将微球运送至目标位置还是采用微创注射的方式[33-34]，组织工程技术的发展都可以极大减少手术治疗软骨损伤所产生的损伤。但是，组织工程材料运输细胞进行软骨缺损治疗的方法仍存在着一些问题：一方面，微载体在关节内运输细胞的行为并不能保证种子细胞在目标区域的附着；另一方面，运送的细胞和微载体可能会迁移至滑液中，因此常常选取细胞黏附性较强的微载体甚至使用细胞黏附分子以保证细胞的贴附[35]，包括使用组织胶。实验介绍的含细胞明胶-海藻酸盐复合微球及凝胶可以结合起来一起使用，含细胞明胶-海藻酸盐复合微球填补缺损部位，含细胞明胶-海藻酸盐复合凝胶覆盖填补孔隙，再经体内交联使微载体紧密贴附在受损部位，以此解决了为载体的在体位置固定问题。同时找到了5%CaCl2溶液的替代品-10%的葡萄糖酸钙溶液，避免了交联剂在体内残留可能引起的中毒情况，而且在未来临床使用中10%葡萄糖酸钙注射液也更加容易获取。另一方面，在使用了海藻酸盐包裹明胶微球后，细胞主要附着在海藻酸盐内部而非海藻酸盐微球外部，未经过冻干处理的明胶-海藻酸盐复合微球表面孔隙也不利于细胞的进出，故而只要能够保证微载体位置的相对固定，就不会产生细胞位置游离的情况。

实验介绍的制备方法仍然存在着不少可以改进的方面，如明胶微球的功能，明胶微球可以携带药物进行缓释[36]，而涉及软骨损伤修复时可以让明胶微球携带成软骨因子(如转化生长因子β3)，进一步丰富含细胞明胶-海藻酸盐复合微球的功能。同时，明胶微球可以尝试使其带上磁性[37]，从而进一步增加微球的功能，赋予其磁驱动的能力，而且能使含细胞明胶-海藻酸盐复合微球与含细胞明胶-海藻酸盐复合凝胶之间的区别更加清晰，在两者配合使用时，以含细胞明胶-海藻酸盐复合微球为主要部分、含细胞明胶-海藻酸盐复合凝胶为次要部分，发挥辅助功能。另一方面，海藻酸盐在既往的报道中被认为可以调节免疫反应，后续可以进行体内的免疫反应实验，通过病理方法进一步明确含细胞明胶-海藻酸盐复合微球的免疫原性。

实验制备了含细胞明胶-海藻酸盐复合微球并初步检测了微球的细胞相容性、微观结构，还制备了含细胞明胶-海藻酸盐复合凝胶，用以弥补微球作为固体的一些缺陷，并可以额外作为组织胶来使用。总体来说，含细胞明胶-海藻酸盐复合微球符合实验初期对于微球性能的要求，并进一步增加了原先并未设想的特点，包括人为控制携带细胞的数量、凝胶配合微球弥补微球缺陷等，取得了成功。不过该研究对于含细胞明胶-海藻酸盐复合微球尤其是其中的明胶微球的部分挖掘较少，明胶微球不仅可以促进成软骨，且功能性极强，可以进行载药等进一步的优化，明胶微球作为一个组织工程被研究多年的微载体应当可以发挥远超现有的功能。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

明胶-海藻酸盐复合微球与凝胶修复软骨损伤

Gelatin-alginate composite microspheres and gels for cartilage damage repair

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