不同来源间充质干细胞外泌体治疗骨关节炎疗效的比较

doi:10.12307/2022.402

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (25): 3980-3985.doi: 10.12307/2022.402

• 干细胞外泌体 Stem cell exosomes • 上一篇下一篇

不同来源间充质干细胞外泌体治疗骨关节炎疗效的比较

王宪峰，欧昕，邓必勇

贵州省骨科医院骨外科，贵州省贵阳市 550000

收稿日期:2021-01-13 接受日期:2021-03-12 出版日期:2022-09-08 发布日期:2022-01-25
通讯作者: 邓必勇，博士，副主任医师，贵州省骨科医院骨外科，贵州省贵阳市 550000
作者简介:王宪峰，男，1990年生，山东省武城县人，汉族，2018年大连医科大学毕业，硕士，医师，主要从事骨关节疾病及运动医学相关基础与临床研究。
基金资助:
贵州省科技计划项目(黔科合基础[2017]1093)，项目负责人：邓必勇

Comparison of effects of exosomes secreted by different mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis

Wang Xianfeng, Ou Xin, Deng Biyong

Department of Orthopedics, Guizhou Orthopedic Hospital, Guiyang 550000, Guizhou Province, China

Received:2021-01-13 Accepted:2021-03-12 Online:2022-09-08 Published:2022-01-25
Contact: Deng Biyong, MD, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Guizhou Orthopedic Hospital, Guiyang 550000, Guizhou Province, China
About author:Wang Xianfeng, Master, Physician, Department of Orthopedics, Guizhou Orthopedic Hospital, Guiyang 550000, Guizhou Province, China
Supported by:
the Science and Technology Plan Project of Guizhou Province, No. [2017]1093 (to DBY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
外泌体：是一类50-150 nm大小的脂质囊泡，是细胞旁分泌中重要的组成部分，被认为是细胞间的通讯载体，其功能是在细胞间传递脂质、核酸(mRNA和miRNA)和蛋白质，从而在受体细胞中引发相应的生物反应。
骨关节炎：是最常见的疾病之一，也是目前患病率增长最快的疾病。骨关节炎是关节进行性退行疾病，以软骨和半月板退化、滑膜炎、软骨下骨硬化和骨赘形成为主要特征。

背景：在过去的数十年中，间充质干细胞作为组织工程种子细胞，在骨关节炎治疗中展现出了强大的疗效，在国内已开展了多项临床注册试验。研究表明，间充质干细胞主要依靠旁分泌效应释放外泌体等载体在体内发挥治疗作用。
目的：比较骨髓间充质干细胞来源外泌体和脐带间充质干细胞来源外泌体治疗骨关节炎的效果。
方法：采用超速离心法提取骨髓间充质干细胞来源外泌体和脐带间充质干细胞来源外泌体，采用透射电镜、Nanosight和Western blot鉴定两种外泌体；采用白细胞介素1β与软骨细胞共培养体外模拟骨关节炎环境，通过CCK-8、Western blot、qPCR评估两种外泌体对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡和细胞外基质分泌的影响；建立Ⅱ型胶原酶诱导的大鼠骨关节炎模型，通过大体和组织学染色评估体内注射两种外泌体治疗骨关节炎的疗效，ELISA检测关节液中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平。
结果与结论：①两种外泌体在透射电镜下均为典型的圆形或杯状，粒径在105-120 nm之间，均表达CD63、CD81和TSG1010特征性蛋白；②脐带间充质干细胞来源外泌体的产量和纯度均高于骨髓间充质干细胞来源外泌体；③两种外泌体均能缓解白细胞介素1β对软骨细胞的炎症作用，主要表现在促进增殖、抑制凋亡和增加细胞外基质的分泌，其中脐带间充质干细胞来源外泌体的促软骨修复活性更强；④两种外泌体治疗后，骨关节炎大鼠关节软骨的宏观表现和OARSI评分均高于对照组，且关节液中炎症因子水平下降，其中脐带间充质干细胞来源外泌体的疗效更优；⑤结果表明：脐带间充质干细胞来源外泌体的产量和纯度均高于骨髓间充质干细胞来源外泌体，且脐带间充质干细胞来源外泌体对骨关节炎的治疗效果优于骨髓间充质干细胞来源外泌体，因此脐带间充质干细胞来源外泌体更适合作为治疗骨关节炎的新疗法。
缩略语：骨髓间充质干细胞来源外泌体：exosomes from bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC-Exos；脐带间充质干细胞来源外泌体：exosomes from umbilical cord mesenchymal stem cell，UMSC-Exos

https://orcid.org/0000-0002-1837-0670 (王宪峰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨性关节炎, 间充质干细胞, 骨髓间充质干细胞, 脐带间充质干细胞, 外泌体, 软骨, 再生

Abstract: BACKGROUND: Mesenchymal stem cells, as seed cells in tissue engineering, have shown powerful curative effect for the treatment of osteoarthritis in the past few decades, and many registered clinical experiments have been carried out in China. More studies have shown that mesenchymal stem cells that play a therapeutic role in vivo release exosomes through paracrine function.
OBJECTIVE: To compare the effect of bone marrow mesenchymal stem cell exosomes and umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes on the treatment of osteoarthritis.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cell exosomes and umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes were isolated by ultra-centrifugation. Nanosight, transmission electron microscopy, and western blot assay were used to identify exosomes. Chondrocytes were co-cultured with interleukin-1β to simulate osteoarthritis in vitro. The effects of bone marrow mesenchymal stem cell exosomes and umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes on the proliferation, apoptosis and extracellular matrix secretion of chondrocytes were evaluated by CCK-8 assay, western blot assay, and qPCR. Collagen II collagenase was injected to induce rat osteoarthritis model and the efficacy of in vivo injection of exosomes was evaluated by macroscopic evaluation and histological staining. The concentrations of interleukin-1β and tumor necrosis factor-α of joint fluid were examined by ELISA.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Both kinds of exosomes were cup-shaped or round-shaped with particle size of 105-120 nm, and expressed characteristic proteins CD63, CD81, and TSG1010. (2) The yield and purity of umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes were higher than those of bone marrow mesenchymal stem cell exosomes. (3) Both exosomes could alleviate the inflammatory effect of interleukin-1β on chondrocytes, which was mainly manifested in promoting proliferation, inhibiting apoptosis, and increasing the secretion of extracellular matrix. Among them, umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes had stronger cartilage repair activity. (4) After the treatment of both exosomes, the macroscopic performance and OARSI score of articular cartilage were better than those of the control group, and the inflammatory factors in the joint fluid were decreased, among which the efficacy of umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes was better than that of bone marrow mesenchymal stem cell exosomes. (5) Results suggest that the yield and purity of umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes are higher than that of bone marrow mesenchymal stem cell exosomes, and the therapeutic effect of umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes on the treatment of osteoarthritis is better than that of bone marrow mesenchymal stem cell exosomes. Therefore, umbilical cord mesenchymal stem cell exosome is more suitable as a new strategy for osteoarthritis.

Key words: stem cells, osteoarthritis, mesenchymal stem cells, bone marrow mesenchymal stem cell exosomes, umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes, exosomes, cartilage, regeneration

中图分类号:

王宪峰, 欧昕, 邓必勇. 不同来源间充质干细胞外泌体治疗骨关节炎疗效的比较[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(25): 3980-3985.

Wang Xianfeng, Ou Xin, Deng Biyong. Comparison of effects of exosomes secreted by different mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(25): 3980-3985.

图/表（结果） 5

2.1 外泌体的鉴定结果 BMSC-Exos和UMSC-Exos在透射电镜下均显示出典型的圆形或杯状，见图1A；Nanosight显示两种外泌体的直径均在60-150 nm之间，UMSC-Exos比BMSC-Exos的直径略小，见图1B；Western blot检测显示BMSC-Exos和UMSC-Exos均表达外泌体特征蛋白：TSG1010、CD63和CD81，不表达Calnexin蛋白，见图1C；上述结果表明外泌体提取成功。

2.2 外泌体产量和纯度的比较外泌体产量=外泌体颗粒总数/细胞总数，BMSC-Exos产量为(2 488±63)颗粒/细胞，而UMSC-Exos产量为(3 539±125)颗粒/细胞，UMSC单细胞分泌外泌体的能力强于BMSC(P < 0.01)，见图2A；外泌体纯度=外泌体颗粒总数/外泌体蛋白总量，BMSC-Exos纯度为(2.6±0.13)×107颗粒/μg，而UMSC-Exos纯度为(3.5±0.11)×107颗粒/μg，UMSC外泌体的纯度高于BMSC(P < 0.01)，见图2B；上述结果表明UMSC在外泌体的产量和纯度方面均强于BMSC。

2.3 外泌体对软骨细胞活性的影响通过白细胞介素1β预处理模拟骨关节炎环境，发现软骨细胞的增殖活性明显下降(P < 0.01)；在加入外泌体共培养后，软骨细胞的增殖活性得到恢复，UMSC-Exos组的恢复作用强于BMSC-Exos组(P < 0.01)，见图3A。采用Western blot实验检测了与软骨细胞基质合成(ColⅡ、Sox9和Aggrecan)、基质降解(MMP-13和ADAMTS5)以及凋亡(Bcl-2和Bax)相关基因的蛋白表达，发现软骨细胞与外泌体共培养后其基质合成增加、分解降低并且凋亡活性被抑制，且UMSC-Exos组生物活性强于BMSC-Exos组，见图3B；实时荧光定量PCR结果进一步证实了Western blot的结果，见图3C。

2.4 外泌体对骨关节炎大鼠的治疗作用 12只SD大鼠均进入结果分析。如图4A所示，大体观察可见对照组关节软骨表面粗糙、色泽变暗，软骨细胞纤维化，软骨下骨质暴露，出现严重的骨关节炎表现；BMSC-Exos组骨关节炎症状较对照组有所改善，部分关节面出现骨关节炎特征表现；UMSC-Exos组大体观最接近正常软骨，大部分关节表面未见明显破坏，仅有小部分软骨菲薄。
如图4B所示，苏木精-伊红染色可见对照组软骨细胞排列紊乱，成簇分布，潮线漂移中断；而外泌体组软骨细胞排列整齐，细胞分布均匀，潮线光滑平整，但BMSC-Exos组的软骨表面偶见不规则裂隙且细胞数小于UMSC-Exos组。甲苯胺蓝染色可见对照组染色呈阴性，表明软骨细胞结构改变伴随软骨特异性蛋白多糖的大量丢失；而外泌体组染色呈阳性， UMSC-Exos组的染色强度大于BMSC-Exos组。用OARSI评分将上述病理染色结果作半定量分析，发现UMSC-Exos组的骨关节炎表现最轻，见图4C。采用ELISA检测关节液中的炎症因子水平，发现外泌体组白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平降低，且UMSC-Exos组的下降趋势最强(P < 0.05)，见图4D。

2.5 生物相容性外泌体是干细胞分泌的囊泡，属于细胞产物，因此具有和亲本细胞相似的生物学性质。干细胞被公认为高生物相容性、无毒性和低免疫原性，因此外泌体也应具有这些特性。在体内实验中，外泌体被注射至大鼠膝关节腔内，均未出现如腹泻、体质量下降、溶血等明显的不良反应，也未出现坐立不安和寒战等全身性过敏反应，且在处死取标本时未见关节腔内有异物生长，在解剖内脏时未发现治疗组大鼠的肝、肾、肺和小肠组织与正常小鼠有明显差异。因此，可以认为外泌体具有极好的生物相容性，是适合应用于临床治疗的分子和载体。

参考文献

[1] PORTAL-NÚÑEZ S, ESBRIT P, ALCARAZ MJ, et al. Oxidative stress, autophagy, epigenetic changes and regulation by miRNAs as potential therapeutic targets in osteoarthritis. Biochem Pharmacol. 2016;108:1-10.
[2] HUNTER DJ. Imaging insights on the epidemiology and pathophysiology of osteoarthritis. Rheum Dis Clin North Am. 2009;35(3):447-463.
[3] SHAMOON M, HOCHBERG MC. Treatment of osteoarthritis with acetaminophen: efficacy, safety, and comparison with nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Curr Rheumatol Rep. 2000;2(6):454-458.
[4] Platas J, Guillén MI, Pérez Del Caz MD, et al. Paracrine effects of human adipose-derived mesenchymal stem cells in inflammatory stress-induced senescence features of osteoarthritic chondrocytes. Aging (Albany NY). 2016;8(8):1703-1717.
[5] KIM YG, CHOI J, KIM K. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Effective Cartilage Tissue Repair and Treatment of Osteoarthritis. Biotechnol J. 2020;15(12):e2000082.
[6] COSENZA S, TOUPET K, MAUMUS M, et al. Mesenchymal stem cells-derived exosomes are more immunosuppressive than microparticles in inflammatory arthritis. Theranostics. 2018;8(5):1399-1410.
[7] CASADO JG, BLÁZQUEZ R, VELA FJ, et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes: Immunomodulatory Evaluation in an Antigen-Induced Synovitis Porcine Model. Front Vet Sci. 2017;4:39.
[8] WU X, LI SH, LOU LM, et al. The effect of the microgravity rotating culture system on the chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Mol Biotechnol. 2013;54(2):331-336.
[9] MURPHY C, WITHROW J, HUNTER M, et al. Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases. Mol Aspects Med. 2018;60:123-128.
[10] BURKE J, KOLHE R, HUNTER M, et al. Stem Cell-Derived Exosomes: A Potential Alternative Therapeutic Agent in Orthopaedics. Stem Cells Int. 2016;2016:5802529.
[11] HARRELL CR, JOVICIC N, DJONOV V, et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes and Other Extracellular Vesicles as New Remedies in the Therapy of Inflammatory Diseases. Cells. 2019;8(12):1605.
[12] VIZOSO FJ, EIRO N, COSTA L, et al. Mesenchymal Stem Cells in Homeostasis and Systemic Diseases: Hypothesis, Evidences, and Therapeutic Opportunities. Int J Mol Sci. 2019;20(15):3738.
[13] YAGHOUBI Y, MOVASSAGHPOUR A, ZAMANI M, et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells derived-exosomes in diseases treatment. Life Sci. 2019;233:116733.
[14] LIU X, YANG Y, LI Y, et al. Integration of stem cell-derived exosomes with in situ hydrogel glue as a promising tissue patch for articular cartilage regeneration. Nanoscale. 2017;9(13):4430-4438.
[15] MAO G, HU S, ZHANG Z, et al. Exosomal miR-95-5p regulates chondrogenesis and cartilage degradation via histone deacetylase 2/8. J Cell Mol Med. 2018;22(11):5354-5366.
[16] PATEL DB, SANTORO M, BORN LJ, et al. Towards rationally designed biomanufacturing of therapeutic extracellular vesicles: impact of the bioproduction microenvironment. Biotechnol Adv. 2018;36(8):2051-2059.
[17] PRITZKER KP, GAY S, JIMENEZ SA, et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 2006; 14(1):13-29.
[18] NAM Y, RIM YA, LEE J, et al. Current Therapeutic Strategies for Stem Cell-Based Cartilage Regeneration. Stem Cells Int. 2018;2018:8490489.
[19] TOH WS, LAI RC, HUI JHP, et al. MSC exosome as a cell-free MSC therapy for cartilage regeneration: Implications for osteoarthritis treatment. Semin Cell Dev Biol. 2017;67:56-64.
[20] SUN L, XU R, SUN X, et al. Safety evaluation of exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stromal cell. Cytotherapy. 2016; 18(3):413-422.
[21] MIANEHSAZ E, MIRZAEI HR, MAHJOUBIN-TEHRAN M, et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a new therapeutic approach to osteoarthritis? Stem Cell Res Ther. 2019;10(1):340.
[22] ZHANG R, MA J, HAN J, et al. Mesenchymal stem cell related therapies for cartilage lesions and osteoarthritis. Am J Transl Res. 2019;11(10): 6275-6289.
[23] TAO SC, YUAN T, ZHANG YL, et al. Exosomes derived from miR-140-5p-overexpressing human synovial mesenchymal stem cells enhance cartilage tissue regeneration and prevent osteoarthritis of the knee in a rat model. Theranostics. 2017;7(1):180-195.
[24] WANG Y, YU D, LIU Z, et al. Exosomes from embryonic mesenchymal stem cells alleviate osteoarthritis through balancing synthesis and degradation of cartilage extracellular matrix. Stem Cell Res Ther. 2017; 8(1):189.
[25] ZHANG B, YIN Y, LAI RC, et al. Immunotherapeutic potential of extracellular vesicles. Front Immunol. 2014;5:518.
[26] ZHANG B, YIN Y, LAI RC, et al. Mesenchymal stem cells secrete immunologically active exosomes. Stem Cells Dev. 2014;23(11):1233-1244.
[27] ZHANG S, CHUAH SJ, LAI RC, et al. MSC exosomes mediate cartilage repair by enhancing proliferation, attenuating apoptosis and modulating immune reactivity. Biomaterials. 2018;156:16-27.
[28] CHEN P, ZHENG L, WANG Y, et al. Desktop-stereolithography 3D printing of a radially oriented extracellular matrix/mesenchymal stem cell exosome bioink for osteochondral defect regeneration. Theranostics. 2019;9(9):2439-2459.
[29] MAO G, ZHANG Z, HU S, et al. Exosomes derived from miR-92a-3p-overexpressing human mesenchymal stem cells enhance chondrogenesis and suppress cartilage degradation via targeting WNT5A. Stem Cell Res Ther. 2018;9(1):247.
[30] WON LEE G, THANGAVELU M, JOUNG CHOI M, et al. Exosome mediated transfer of miRNA-140 promotes enhanced chondrogenic differentiation of bone marrow stem cells for enhanced cartilage repair and regeneration. J Cell Biochem. 2020;121(7):3642-3652.
[31] WU J, KUANG L, CHEN C, et al. miR-100-5p-abundant exosomes derived from infrapatellar fat pad MSCs protect articular cartilage and ameliorate gait abnormalities via inhibition of mTOR in osteoarthritis. Biomaterials. 2019;206:87-100.
[32] LIU Y, ZOU R, WANG Z, et al. Exosomal KLF3-AS1 from hMSCs promoted cartilage repair and chondrocyte proliferation in osteoarthritis. Biochem J. 2018;475(22):3629-3638.
[33] LIU Y, LIN L, ZOU R, et al. MSC-derived exosomes promote proliferation and inhibit apoptosis of chondrocytes via lncRNA-KLF3-AS1/miR-206/GIT1 axis in osteoarthritis. Cell Cycle. 2018;17(21-22):2411-2422.
[34] YAN L, LIU G, WU X. Exosomes derived from umbilical cord mesenchymal stem cells in mechanical environment show improved osteochondral activity via upregulation of LncRNA H19. J Orthop Translat. 2020;26:111-120.
[35] YAN L, LIU G, WU X. The umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomal lncRNA H19 improves osteochondral activity through miR-29b-3p/FoxO3 axis. Clin Transl Med. 2021;11(1):e255.
[36] HARASZTI RA, MILLER R, STOPPATO M, et al. Exosomes Produced from 3D Cultures of MSCs by Tangential Flow Filtration Show Higher Yield and Improved Activity. Mol Ther. 2018;26(12):2838-2847.

引言

骨关节炎是中老年人群最常见的关节退行性疾病，主要表现为关节软骨变性、破坏以及骨质增生[1]。由于关节软骨缺乏血液供应，其再生和分化能力较弱，因此一旦损伤就无法自我修复[2]。目前传统的药物或手术治疗只能缓解症状，无法使关节软骨得到有效的再生修复[3]。随着再生医学的发展，间充质干细胞被认为是一种有希望治疗骨关节炎的细胞疗法[4-5]。
间充质干细胞是一类从骨髓、脂肪、滑膜、脐带等多种组织或器官中分离出的具有干细胞特征的多能成体干细胞，其最主要特征是高增殖活性、多向分化能力、免疫活性低等[6-7]。有学者认为干细胞治疗骨关节炎的机制是间充质干细胞增殖和分化为新的关节软骨，但是最新研究表明关节腔内注射的间充质干细胞只有小部分存活[8]。越来越多的研究认为间充质干细胞是通过分泌多种营养因子来改善关节腔的微环境，协调细胞的迁移和增生[9]，在这些旁分泌因子中，外泌体被认为是最具生物学效应的物质[10]。
外泌体是一类直径60-150 nm大小的双层脂质囊泡，其中含有来自母细胞的DNA、mRNA、microRNA和蛋白质等。目前很多研究证明间充质干细胞来源外泌体可以修复多种组织损伤，包括皮肤损伤、心肌坏死、肝纤维化等[11-13]。不同组织来源间充质干细胞在治疗骨关节炎方面存在差异，目前以骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)和脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell，UMSC)的研究报道最多，然而它们各自分泌的外泌体在治疗骨关节炎方面是否也存在差异尚未见报道[14-16]。
该研究目的主要是比较骨髓间充质干细胞来源外泌体(exosomes from bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC-Exos)和脐带间充质干细胞来源外泌体(exosomes from umbilical cord mesenchymal stem cell，UMSC-Exos)对骨关节炎的治疗效果。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验和动物体内实验，两组数据间的差异比较采用非配对t检验，多组数据间的差异比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2020年6-12月在贵州医科大学天然产物化学重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞人骨髓间充质干细胞(BNCC100385)、人脐带间充质干细胞(BNCC100383)和人软骨细胞(BNCC339995)均购自北纳生物，已有质检报告。
1.3.2 实验试剂和仪器 DMEM/F12培养基、胎牛血清、0.25%胰酶(美国Gibco公司)；RIPA裂解液、RNase A、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、BCA蛋白定量试剂盒、CCK-8试剂盒(中国碧云天)；单克隆抗体CD63、CD81、TSG101、Calnexin、MMP-13、ADAMTS5、Sox9、Bax、Bcl-2(美国Aabcam公司)；单克隆抗体COL Ⅱ、Aggrecan、GAPDH(美国Novus公司)；Ⅱ型胶原酶(中国索莱宝)；蛋白电泳仪、转印系统(美国Bio-Rad公司)；红外激光成像系统(美国Odyssey公司)；台式高速离心机(美国Beckman公司)；纳米颗粒跟踪分析仪Zetaview(德国Particle Metrix公司)。
1.3.3 实验动物 SD大鼠12只，雌性，体质量(200±10) g，随机分为3组，每组4只，由贵州医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(黔)2018-0001；使用许可证号：SYXK(黔)2018-0001。该动物实验已经通过贵州省骨科医院动物研究委员会的批准。
1.4 实验方法
1.4.1 外泌体的提取两种细胞的培养液均为含体积分数为10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM/F12，细胞培养环境为37 ℃，体积分数为5%CO2孵育箱。
第3代UMSC和BMSC融合度约80%，培养48 h后收集上清液200 mL，4 ℃环境2 000×g离心30 min后去除沉淀，收集上清；20 000×g离心60 min后去除沉淀，收集上清；100 000×g离心60 min，轻轻倒去上清，收集底部沉淀；沉淀用PBS稀释，100 000×g离心60 min，轻轻倒去上清，最后将收集的沉淀以100 μL PBS重悬，分装，-80 ℃保存。
1.4.2 外泌体的鉴定
(1)Nanosight检测外泌体的粒径和浓度：将PBS稀释好的外泌体吸入注射器中，再缓慢放入Nanosight分析仪，观察粒子的布朗运动，利用纳米粒子跟踪分析软件进行分析，测量出微粒的大小及浓度。
(2)透射电镜观察外泌体的形态：将2 mL PBS加入含外泌体的离心管中混匀，按照1∶50倍稀释后取外泌体稀释液10 μL，滴加于2 mm含碳载样铜网上，在室温下静置5 min后用滤纸将多余液体轻轻吸去，滴加3%磷钨酸钠溶液后室温晾干，透射电镜观察并照相。
(3) Western blot检测外泌体表面蛋白的表达：在外泌体中加入相同体积的细胞裂解液，在冰上静置10 min，4 ℃环境下12 000×g离心10 min，上层清液即为外泌体总蛋白。配制12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶及浓缩胶，上样量为每孔100 μg，80 V电泳2 h，200 mA转膜1 h，取出PVDF膜浸润在5%牛奶中封闭1 h，4 ℃湿盒中孵育一抗CD63、CD81、 TSG101和Calnexin过夜，PBST洗涤3次后37 ℃孵育二抗1 h，再用PBST洗涤3次，最后利用 ECL化学发光系统进行拍照。
1.4.3 软骨细胞增殖实验(CCK-8) 软骨细胞以3 000个/孔的密度接种于96孔板，用10 μg/L白细胞介素1β(P6470，碧云天，中国)预处理24 h模仿骨关节炎环境，然后分别加入1×108颗粒/mL的两种外泌体，每天换液1次，分别在第1，2，3，4天进行细胞增殖活性检测，每孔加入20 μL CCK-8溶液(C0037，碧云天，中国)，继续孵育2 h，用酶标仪检测各孔在450 nm波长处的吸光度值并绘制标准曲线。
1.4.4 细胞总RNA的提取软骨细胞以1×106个/孔密度接种于6孔板，用10 μg/L白细胞介素1β预处理24 h，然后分别加入1×108颗粒/mL的两种外泌体培养3 d，弃去培养基，PBS洗涤3次，按每5×106个细胞加入1 mL Trizol，反复吹打均匀，转移到EP管中，按比例加入200 μL氯仿/ 1 mL Trizol剧烈振荡15 s，静置3 min后12 000 r/min离心15 min；取上层水相加入等体积异丙醇，混合均匀，4 ℃环境下12 000 r/min离心10 min；沉淀中加入等体积的无水乙醇和Trizol洗涤沉淀，7 600 r/min离心5 min；去除上清，待RNA干燥后，加入20 μL DEPC水溶解沉淀备用。

1.4.5 实时荧光定量PCR 根据PrimeScriptTM RT-PCR kit(TaKaRa，中国)说明书将RNA反转录合成cDNA，按照以下反应条件进行实时荧光定量PCR反应：95 ℃ 3 min；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40个循环；以GAPDH作为内参，根据2–ΔΔCT值计算各基因表达。各基因引物序列见表1。

1.4.6 SD大鼠骨关节炎模型的建立将12只SD大鼠随机分为3组：对照组(n=4)、BMSC-Exos组(n=4)、UMSC-Exos组(n=4)。以20 mg/kg剂量的戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠，关节腔内注射0.5 mg Ⅱ型胶原酶(C8000，索莱宝，中国)构建骨关节炎模型，术后每周1次分别注射10 μL的PBS、BMSC-Exos(1×1010颗粒/mL)和UMSC-Exos(1×1010颗粒/mL)。
在第4周注射后3 d处死大鼠，收集关节液和关节软骨组织进行下一步分析。
1.4.7 关节液中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平每只大鼠收集200 μL关节液，2 000×g离心10 min后取上清，然后通过Rat IL-1β ELISA Kit(PI303，碧云天，中国)和Rat TNF-α ELISA Kit(PT516，碧云天，中国)试剂盒检测关节液中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平。
1.4.8 组织学染色大鼠软骨组织标本用100 g/L多聚甲醛固定24 h，用EDTA慢脱液脱钙4周，经过梯度脱水后，包埋于石蜡，切成5 μm放于载玻片上，分别进行苏木精-伊红染色(E607318，上海生工，中国)和甲苯胺蓝染色(E670105，上海生工，中国)。每个样本由2名观察者采用盲法进行OARSI评分。
OARSI评分是国际骨关节炎研究学会定制的评估骨关节炎严重程度的半定量指标，评分越高骨关节炎越严重[17]。0级：软骨表面平整，软骨完整；1级：软骨表面浅层纤维形成，且不均匀；2级：软骨表面不连续，伴有细胞增殖，在Ⅱ-Ⅲ层异染物质增加或减少；3级：软骨皲裂扩散至Ⅲ层或出现侵蚀；4级：软骨侵蚀加重，关节软骨出现了损害；5级：关节软骨剥脱；6级：关节变形。
1.5 主要观察指标 ①外泌体的鉴定结果；②外泌体的产量和纯度；③外泌体对软骨细胞活性的影响；④外泌体对骨关节炎大鼠的治疗作用。
1.6 统计学分析使用SPSS 19.0软件处理各项数据，计量资料以x±s表示，采用非配对t检验比较两组数据间的差异，采用单因素方差分析比较多组数据间的差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前已有多项临床注册试验研究间充质干细胞对人体多种器官组织的治疗效果，然而作为细胞治疗方法，它仍存在较多的争议，包括活体细胞来源的伦理问题，细胞制备、存储、运输的后勤保障问题，以及细胞注射到人体后的生物安全性和有效性问题等[18]。因此，如果间充质干细胞的衍生物——外泌体，能达到和细胞本身一样的治疗效果，则这种非细胞治疗将更加安全和经济[19]。
UMSC是从废弃的脐带中提取，不存在伦理问题，与BMSC的提取相比，它是无创性的。一条脐带大约可提取1 000万个细胞，其来源比BMSC更加广泛；在免疫原性方面，UMSC不表达与移植排斥相关的抗原，适用于不同个体间的移植[20]；BMSC所需的骨髓可能来自于不同年龄的个体，其年龄大小对其生物活性有较大的影响，而UMSC不存在这方面的问题。有研究表明UMSC的增殖和分化潜能是BMSC数10倍，因此UMSC是比BMSC更好的母细胞来源。
目前关于间充质干细胞外泌体治疗骨关节炎的机制仍未达成定论[21-22]，可以主要归纳为以下几点：①促进细胞外基质的合成：TAO等[23]发现从滑膜间充质干细胞中提取的外泌体在骨关节炎大鼠模型中保护软骨免于降解，体外实验发现其外泌体促进了软骨细胞的增殖和迁移，但减少了细胞外基质的分泌；WANG等[24]则发现来自人胚胎干细胞诱导的间充质干细胞外泌体可以缓解小鼠内侧半月板失稳术后引起的骨关节炎症状，其主要机制是平衡软骨细胞外基质的合成和降解。上述实验结果与该实验结果符合，作者发现外泌体可以增加与软骨细胞基质合成相关基因的表达，包括ColⅡ、Sox 9和Aggrecan，并降低基质降解相关基因的表达，包括MMP-13和ADAMTS5。②免疫调节作用：间充质干细胞外泌体中含有多种免疫调节蛋白[25]，ZHANG等[26]发现间充质干细胞外泌体可以诱导白细胞介素10表达，降低免疫活性；ZHANG等[27]则发现间充质干细胞外泌体治疗软骨损伤后，修复组织中M2巨噬细胞增多，M1巨噬细胞减少。这与该实验结果符合，在动物实验中，ELISA检测发现关节液中炎症相关的白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平降低，表明外泌体可以有效调节免疫反应。③恢复线粒体功能：CHEN等[28]发现间充质干细胞外泌体中含有线粒体蛋白，并可以传递到软骨细胞中，从而恢复骨关节炎软骨细胞中线粒体功能和形态。④外泌体中miRNAs的作用：间充质干细胞外泌体中含有大量miRNAs，这些miRNAs可以有效介导软骨细胞的基因调控。目前有miR-92a-3p[29]、miR-320c、miR-140-5p[23，30]、miR-100-5p[31]、miR-95-5p[15]、lncRNA-KLF3-AS1[32-33]、lncRNA-H19等非编码RNA都被发现是外泌体治疗骨关节炎的潜在分子[34-35]。
该实验首次比较了BMSC-Exos和UMSC-Exos在骨关节炎中的治疗作用，发现无论在体外白细胞介素1β诱导的骨关节炎软骨细胞实验中还是在体内Ⅱ型胶原酶诱导的骨关节炎大鼠模型中，两种外泌体均能有效减轻骨关节炎症状，且UMSC-Exos的治疗效果优于BMSC-Exos。此外还发现UMSC-Exos的产量和纯度较高，这与HARASZTI等[36]的研究结果一致，因此UMSC作为外泌体治疗骨关节炎的母细胞可能更加合适。
下一步将多种来源间充质干细胞的外泌体做统一的疗效比较研究，以消除来自不同研究的差异，为骨关节炎的治疗指明最合适的间充质干细胞种类。外泌体治疗骨关节炎的具体机制仍不清楚，作者推测外泌体中多种生物活性成分起着关键的作用，因此未来的工作还需要关注外泌体中参与软骨修复再生的具体成分和作用机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

不同来源间充质干细胞外泌体治疗骨关节炎疗效的比较

Comparison of effects of exosomes secreted by different mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 5

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	谭新访, 郭艳幸, 秦晓飞, 张斌清, 赵东亮, 潘琨琨, 李瑜卓, 陈皓宇. 顺轴疲劳运动对兔髌股关节软骨损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(在线): 1-6.
[2]	吴聪, 贾全忠, 刘伦. 成年关节软骨碎块化后转化生长因子β1表达与软骨细胞迁移的关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1167-1172.
[3]	王宝娟, 郑曙光, 张琪, 李田洋. 苗药熏蒸治疗膝骨关节炎模型兔可延缓细胞外基质的破坏[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1180-1186.
[4]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[5]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[6]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[7]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[8]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[9]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[10]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[11]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[12]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[13]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.
[14]	朱兵兵, 邓江华, 陈晶晶, 慕晓玲. 白细胞介素8受体可提高脐带间充质干细胞迁移和向损伤内皮的黏附[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1045-1050.
[15]	罗小玲, 张丽, 杨茂桦, 徐洁, 徐晓梅. 柚皮素干预人牙周膜干细胞的成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1051-1056.