上调滤泡调节性T细胞治疗肾移植抗体介导的排斥反应

doi:10.12307/2022.812

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (26): 4118-4122.doi: 10.12307/2022.812

• 组织构建临床实践 clinical practice in tissue construction • 上一篇下一篇

上调滤泡调节性T细胞治疗肾移植抗体介导的排斥反应

徐媛1，牛玉林1 ，袁智辉1，贾磊2，潘光辉1

贵州医科大学附属医院，1器官移植科，2肝胆外科，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2021-07-05 接受日期:2021-08-21 出版日期:2022-09-18 发布日期:2022-03-08
通讯作者: 潘光辉，主任医师，贵州医科大学附属医院器官移植科，贵州省贵阳市 550004
作者简介:徐媛，女，1981年生，贵州省贵阳市人，汉族，硕士，副主任医师，主要从事器官移植研究。
基金资助:
贵州省教育厅青年科技人才成长项目(黔教合KY字[2018]190)，项目负责人：徐媛；贵州省科技计划项目(黔科合平台人才[2018]5779-47)，项目负责人：徐媛

Up-regulating follicular regulatory T cells for treating antibody-mediated rejection after kidney transplantation

Xu Yuan1, Niu Yulin1, Yuan Zhihui1, Jia Lei2, Pan Guanghui1

1Department of Organ Transplantation, 2Department of Hepatological Surgery, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2021-07-05 Accepted:2021-08-21 Online:2022-09-18 Published:2022-03-08
Contact: Pan Guanghui, Chief physician, Department of Organ Transplantation, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Xu Yuan, Master, Associate chief physician, Department of Organ Transplantation, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
Young Science and Technology Talents Development Project of the Educational Department of Guizhou Province, No. KY[2018]190 (to XY); Guizhou Provincial Science and Technology Plan Project of Guizhou Province, No. [2018]5779-47 (to XY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
抗体介导排斥反应：亦称体液性排斥反应，是由抗体、补体等多种体液免疫效应因子参与所致的排斥反应免疫损伤，是肾移植后常见的排斥反应类型，由于病变表现程度不一、抗体检测技术水平的局限、C4d 染色方法的稳定性等因素，抗体介导排斥反应的免疫损伤机制较为复杂。
滤泡调节性T细胞：滤泡辅助性T细胞和滤泡调节性T细胞均定位于淋巴，滤泡调节性T细胞是Treg细胞的一个子集，与滤泡辅助性T细胞拥有共同的表型特征。滤泡辅助性T细胞和滤泡调节性T细胞在功能上相互制约，维持机体自身免疫反应的稳定进行，滤泡辅助性T细胞/滤泡调节性T细胞的免疫失衡使得自身抗体的产生失控，自身免疫耐受性丧失，最终引发自身免疫性疾病。

背景：由抗体介导排斥反应引起的移植肾失功目前临床尚缺乏有效的治疗手段。有研究显示肾移植患者血浆miR-4286的表达显著上调，miR-4286可靶向下调转化生长因子β的表达而激活免疫反应。
目的：探讨沉默miR-4286上调滤泡调节性T细胞治疗肾移植抗体介导排斥反应的作用及机制。
方法：选择贵州医科大学附属医院接受肾移植的患者，纳入20例肾移植抗体介导排斥反应患者与20例免疫耐受患者，对两组活检肾组织进行苏木精-伊红染色与C4d免疫组化染色，检测两组患者外周血淋巴细胞miR-4286 mRNA的表达与滤泡辅助性、调节性T细胞比例。将排斥反应患者淋巴细胞分组处理，空白载体组、miR-4286过表达组、miR-4286沉默组、转化生长因子β阻断组(该组转染miR-4286抑制的慢病毒载体的同时加入转化生长因子β中和抗体)，48 h后，检测B细胞、浆细胞和滤泡调节性T细胞的比例，以及细胞上清转化生长因子β、干扰素γ、白细胞介素6和白细胞介素21的水平。
结果与结论：①苏木精-伊红染色显示，排斥反应组肾组织浸润的炎细胞数量高于免疫耐受组(P < 0.05)；免疫组化染色显示，排斥反应组肾组织可见大量C4d阳性的细胞，免疫耐受组未见C4d阳性细胞。②排斥反应组miR-4286 mRNA表达量、滤泡辅助性T细胞比例高于免疫耐受组(P < 0.05)，滤泡调节性T细胞比例低于免疫耐受组(P < 0.05)。Spearman相关分析显示，miR-4286表达与滤泡辅助性T细胞比例呈正相关，与滤泡调节性T细胞比例呈负相关。③与对照组比较，miR-4286过表达组转化生长因子β水平降低(P < 0.05)，干扰素γ、白细胞介素6、白细胞介素21水平升高(P < 0.05)；miR-4286沉默组转化生长因子β水平升高(P < 0.05)，干扰素γ、白细胞介素6、白细胞介素21水平降低(P < 0.05)。与miR-4286沉默组比较，转化生长因子β阻断组转化生长因子β水平降低(P < 0.05)，干扰素γ、白细胞介素6、白细胞介素21水平升高(P < 0.05)。④与对照组比较，miR-4286过表达组B细胞与浆细胞比例均升高(P < 0.05)，滤泡调节性T细胞比例降低(P < 0.05)；miR-4286沉默组B细胞与浆细胞比例均降低(P < 0.05)，滤泡调节性T细胞比例升高(P < 0.05)。与miR-4286沉默组比较，转化生长因子β阻断组B细胞与浆细胞比例均升高(P < 0.05)，滤泡调节性T细胞比例降低(P < 0.05)。⑤结果表明，miR-4286在肾移植抗体介导排斥反应患者外周血淋巴细胞中高表达，miR-4286沉默可通过转化生长因子β途径上调淋巴细胞中滤泡调节性T细胞比例，抑制体液免疫。
缩略语：滤泡辅助性T细胞：follicular helper T cell，Tfh；滤泡调节性T细胞：follicular regulatory T cell，Tfr

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 肾移植, 抗体介导排斥反应, miR-4286, 淋巴细胞, 滤泡调节性T细胞, 浆细胞, 转化生长因子β

Abstract: BACKGROUND: There is currently no effective treatment for kidney transplant failure caused by antibody-mediated rejection. Studies have shown that the expression of plasma miR-4286 in kidney transplant patients is significantly up-regulated, and miR-4286 can down-regulate the expression of transforming growth factor β to activate an immune response.
OBJECTIVE: To investigate the effect of miR-4286 silencing on up-regulating follicular regulatory T cells in the treatment of antibody-mediated rejection after kidney transplantation and its mechanism.
METHODS: Patients who underwent kidney transplantation at the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University from December 2018 to December 2020 were enrolled and assigned into two groups (n=20 per group): antibody-mediated rejection group and immune tolerance group. Hematoxylin-eosin staining and C4d immunohistochemistry were performed for biopsy of kidney tissues. The mRNA expression of miR-4286 in peripheral blood lymphocytes and the proportions of follicular helper and follicular regulatory T cells were detected. The lymphocytes of patients suffering rejection reaction were divided into a blank vector group, a miR-4286 overexpression group, a miR-4286 silence group, and a transforming growth factor β blocking group in which the cells were simultaneously transfected with miR-4286-inhibited lentiviral vector and transforming growth factor β neutralizing antibody). After 48 hours, we detected the proportions of B cells, plasma cells, and follicular regulatory T cells, as well as the levels of transforming growth factor β, interferon γ, interleukin 6, and interleukin 21 in the cell supernatant.
RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining results showed that the number of inflammatory cells infiltrated in the transplanted kidney tissue was higher in the antibody-mediated rejection group than the immune tolerance group (P < 0.05). Immunohistochemistry results showed that the antibody-mediated rejection group had a large number of C4d positive cells in the kidney tissue, while there were no C4d-positive cells in the immune tolerance group. The mRNA expression of miR-4286 and the proportion of follicular helper T cells in the antibody-mediated rejection group were higher than those in the immune tolerance group (P < 0.05). Spearman correlation analysis indicated that the expression of miR-4286 was positively correlated with the proportion of follicular helper T cells, while negatively correlated with the proportion of follicular regulatory T cells. Compared with the blank vector group, the level of transforming growth factor β was decreased in the miR-4286 overexpression group (P < 0.05), and the levels of interferon gamma, interleukin 6, and interleukin 21 were increased in the miR-4286 overexpression group (P < 0.05). Compared with the blank vector group, in the miR-4286 silence group, the level of transforming growth factor β was increased (P < 0.05), while the levels of interferon γ, interleukin 6, and interleukin 21 were decreased (P < 0.05). Compared with the miR-4286 silence group, the level of transforming growth factor beta was decreased in the transforming growth factor β blocking group (P < 0.05), and the levels of interferon γ, interleukin 6, and interleukin 21 was increased (P < 0.05). Compared with the blank vector group, the proportion of B cells and plasma cells was increased in the miR-4286 overexpression group (P < 0.05), and the proportion of follicular regulatory T cells was decreased (P < 0.05). Compared with the blank vector group, the proportion of B cells and plasma cells was decreased in the miR-4286 silence group (P < 0.05), and the proportion of follicular regulatory T cells was increased (P < 0.05). Compared with the miR-4286 silence group, the proportion of B cells and plasma cells was increased in the transforming growth factor β blocking group (P < 0.05), and the proportion of follicular regulatory T cells was decreased (P < 0.05). All these findings indicate that miR-4286 is highly expressed in peripheral blood lymphocytes of antibody-mediated rejection patients after kidney transplantation, and silencing of miR-4286 can up-regulate the proportion of follicular regulatory T cells in lymphocytes and inhibit humoral immunity through transforming growth factor β pathway.

Key words: kidney transplantation, antibody-mediated rejection, miR-4286, lymphocyte, follicular regulatory T cell, plasma cell, transforming growth factor β

中图分类号:

徐媛, 牛玉林, 袁智辉, 贾磊, 潘光辉. 上调滤泡调节性T细胞治疗肾移植抗体介导的排斥反应[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(26): 4118-4122.

Xu Yuan, Niu Yulin, Yuan Zhihui, Jia Lei, Pan Guanghui. Up-regulating follicular regulatory T cells for treating antibody-mediated rejection after kidney transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(26): 4118-4122.

图/表（结果） 8

2.1 两组患者肾组织炎细胞浸润与C4d表达见图1。

苏木精-伊红染色显示，排斥反应组患者肾组织内的炎细胞浸润数量多于免疫耐受组[(87.17±13.56)，(18.11±3.95)个/视野，t=4.885，P < 0.001]；免疫组化染色显示，排斥反应组患者肾组织内可见广泛的C4d阳性表达，免疫耐受组未见检测到C4d表达。
2.2 两组患者外周血淋巴细胞内的miR-4286 mRNA表达 RT-PCR检测结果显示，排斥反应组与免疫耐受组患者外周血淋巴细胞中的miR-4286 mRNA表达量分别为3.95±0.32，2.18±0.27，组间比较差异有显著性意义(t=4.331，P=0.002)。
2.3 两组患者外周血淋巴细胞中Tfh与Tfr细胞的比例两组患者外周血淋巴细胞流式细胞术检测结果，见图2。

统计分析结果显示，排斥反应组患者外周血淋巴细胞中的Tfh细胞比例高于免疫耐受组(t=3.096，P=0.011)，Tfr细胞比例低于免疫耐受组(t=6.176，P < 0.001)，见表1。

Spearman相关性分析结果显示，miR-4286 mRNA的表达与Tfh细胞比例呈正相关(r=0.715，P=0.009)，与Tfr细胞比例呈负相关(r=-0.741，P=0.006)。
2.4 排斥反应患者外周血淋巴细胞各分组相关检测结果
2.4.1 各组细胞上清细胞因子的分泌见表2。

与对照组比较，miR-4286过表达组的转化生长因子β水平降低(t=4.846，P=0.003)，干扰素γ、白细胞介素6、白细胞介素21水平升高(t=4.304，P=0.005；t=3.844，P=0.003；t=7.600，P < 0.001)；miR-4286沉默组转化生长因子β水平升高(t=15.053，P < 0.001)，干扰素γ、白细胞介素6、白细胞介素21水平降低(t=2.929，P=0.026；t=3.563，P=0.005；t=5.439，P < 0.001)。与miR-4286沉默组比较，转化生长因子β阻断组转化生长因子β水平降低(t=1.227，P < 0.001)，干扰素γ、白细胞介素6、白细胞介素21水平升高(t=1.001，P < 0.05；t=2.441，P=0.005；t=1.554，P < 0.001)。
2.4.2 各组细胞中B细胞和浆细胞的比例各组淋巴细胞B细胞和浆细胞比例流式细胞术检测结果，见图3。

统计分析结果显示，与对照组比较，miR-4286过表达组B细胞与浆细胞比例均升高(t=4.789，P < 0.001；t=5.276，P < 0.001)；miR-4286沉默组B细胞与浆细胞比例均降低(t=6.472，P < 0.001；t=4.865，P < 0.001)。与miR-4286沉默组比较，转化生长因子β阻断组B细胞与浆细胞比例均升高(t=7.875，P < 0.001；t=7.390，P < 0.001)，见表3。

2.4.3 各组细胞中Tfr细胞的比例各组淋巴细胞中Tfr细胞比例流式细胞术检测结果，见图4。

统计分析结果显示，对照组、miR-4286过表达组、miR-4286沉默组、转化生长因子β阻断组滤泡调节性T细胞的比例分别为(0.12±0.01)%，(0.06±0.01)%，(0.52±0.03)%，(0.05±0.01)%；miR-4286过表达组、miR-4286沉默组与对照组比较差异均有显著性意义(t=4.181，P=0.002；t=15.073，P < 0.001)，miR-4286沉默组与转化生长因子β阻断组比较差异有显著性意义(t=17.074，P < 0.001)。

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引言

材料方法

1.1 设计前瞻性单中心临床对照试验，多组间比较采用单因素方差分析和post hoc boferroni t检验。
1.2 时间及地点试验于2018年12月至2020年12月在贵州医科大学附属医院完成。
1.3 对象选择2018年12月至2020年12月在贵州医科大学附属医院接受肾移植的患者40例，男30例，女10例，其中20例肾移植后出现排斥反应，平均年龄(37.8±9.7)岁；其余20例为免疫耐受患者，平均年龄(38.3±7.0)岁。试验经过贵州医科大学附属医院人体器官移植伦理委员会批准和备案。所有患者均签署了试验知情同意书。
纳入标准：年龄在18-65岁之间；接受同种异体肾移植；单次移植；术前未检测到群体反应性抗体；排斥反应组患者符合排斥反应的Banff 2019诊断标准[12]。
排除标准：多器官联合移植；合并恶性肿瘤；合并严重的糖尿病或冠心病；移植后患者未严格按照医嘱服用免疫抑制药物。
1.4 材料空白对照的pLVx慢病毒载体、miR-4286 过表达的pLVx慢病毒载体、miR-4286 抑制的pLVx慢病毒载体、转化生长因子β中和性抗体，均购于美国Sigma公司；Triton X-100、苏木精和伊红染色试剂购于美国Sigma公司；C4d和转化生长因子β抗体购于美国Abcam公司；CD4-APC、CXCR5-FITC、Foxp3-PE、CD3-APC、CD20-PE、CD38-FITC购于美国BD公司；淋巴细胞分离液、Hyclone培养基、胎牛血清购于美国Hyclone公司；转化生长因子β、干扰素γ、白细胞介素6和白细胞介素21的ELISA试剂盒购于欣博盛生物科技公司。
1.5 方法
1.5.1 临床样本的收集和检测收集两组患者的移植肾活检标本，100 g/L多聚甲醛固定4 h。石蜡切片后，一部分组织进行苏木精-伊红染色，一分部组织进行免疫组化染色。
苏木精-伊红染色：使用二甲苯脱蜡10 min，事先准备好盖玻片，再用体积分数100%，90%，80%，70%乙醇各5 min覆水。苏木精染色6 min，流水冲洗。5%乙酸分化 1 min，流水冲洗，用吸管滴加乙酸，布满玻片上的组织即可。伊红染色1 min，流水冲洗。脱水晾干，滴上中性树胶封固，镜下观察炎细胞浸润。
免疫组化染色：切片常规脱蜡水化，高压抗原修复后用双氧水作用 10 min灭活内源性过氧化物酶。滴加一抗C4d抗体(1∶100稀释)室温反应1 h。加入HRP标记的二抗室温静置30 min。加DAB显色液，显色5-10 min，用苏木精复染2 min，乙醇分化、脱水、透明，树脂胶封固，镜下观察C4d的表达。
收集两组患者外周血，以PBS进行同体积稀释后，缓慢加入到淋巴细胞分离液上层。2 000×g离心20 min，吸取中层的单个核细胞。PBS反复洗3次后，收集淋巴细胞，一部分利用RT-PCR检测miR-4286的表达，一部分用于流式细胞仪检测。
RT-PCR检测：提取细胞总RNA，根据反转录试剂盒说明书将 RNA反转为cDNA 后，按照 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒说明书对 miR-4286进行 PCR 扩增。miR-4286的上游引物为 5′- ACA CTC CAG CTG GGA CCC CAC TCC T-3′，下游引物为5′-TAC CAG GAG TGG GGT TT-3′。以GAPDH 为内参。采用2-ΔΔCt法计算miR-4286的相对表达水平。
流式细胞术检测：加入CD4-APC和CXCR5-FITC抗体，37 ℃孵箱中染色15 min，PBS清洗3次，1%的Triton X-100处理细胞1 h，加入Foxp3-PE，37 ℃孵箱中染色15 min。PBS清洗3次，上流式细胞仪检测CD4+CXCR5+ Tfh细胞和CD4+CXCR5+Foxp3+ Tfr细胞的比例。
1.5.2 细胞转染[13] 收集排斥反应患者外周血，分离出淋巴细胞，细胞浓度为2×109 L-1，置于含有体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640中37 ℃恒温箱培养。24 h后，将淋巴细胞平均分成4组：对照组(转染空白对照的pLVx慢病毒载体)、miR-4286过表达组(转染miR-4286过表达的pLVx慢病毒载体)、miR-4286沉默组(转染miR-4286 抑制的pLVx慢病毒载体)和转化生长因子β阻断组(转染miR-4286 抑制的pLVx慢病毒载体同时加入转化生长因子β中和性抗体0.1 mg)。
48 h后，收集各组细胞，流式细胞仪检测CD20+B细胞、CD3-CD38++浆细胞和Tfr细胞的比例；收集各组细胞上清，采用ELISA方法检测转化生长因子β、干扰素γ、白细胞介素6和白细胞介素21的水平，按照试剂盒说明书操作。
1.6 主要观察指标两组患者肾组织炎细胞浸润、C4d的表达及淋巴细胞中miR-4286 mRNA的表达；排斥反应患者外周血淋巴细胞各分组的转化生长因子β、干扰素γ、白细胞介素6和白细胞介素21的水平，以及CD4+CXCR5+Tfh细胞和CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr细胞的比例。
1.7 统计学分析采用GraphPad软件进行数据分析，结果采用x±s表示，多组之间的比较采用单因素方差分析和post hoc boferroni t检验，采用Spearman分析进行相关性分析，P < 0.05表明组间差异有显著性意义。

讨论

肾脏移植是治疗各种终末期肾病最有效的方法，环孢素、他克莫司及西罗莫司等免疫抑制剂的临床应用显著降低了急性T细胞介导排斥反应的发生，提高了肾移植的成功率[14]。临床研究结果显示，排斥反应已经成为引起晚期肾移植失败的主要原因，目前临床还缺乏很好的处理手段，血浆置换或B细胞清除具有一定的治疗效果，但存在严重感染、治疗失败、移植肾失功等风险[15]，因此寻找新的预防和治疗靶点具有重要的临床意义。大量研究显示miRNA与肾脏移植预后和排斥反应发生具有紧密的相关性，靶向调控miRNA表达可显著延长移植肾的存活时间[16-19]。此次研究收集肾移植患者的临床样本，发现排斥反应患者外周血淋巴细胞中的miR-4286 mRNA表达显著升高，且与Tfh细胞比例呈正相关，与Tfr细胞比例呈负相关，这说明miR-4286可能通过调控Tfr细胞参与肾移植排斥反应的发生和进展。
miRNA芯片检测结果显示，miR-4286在肾移植急性排斥反应患者血浆中的表达显著上调。miR-4286主要发挥着免疫调控作用，研究显示miR-4286可显著下调转化生长因子β的表达，促进免疫反应。体外实验显示，miR-4286沉默组下调淋巴细胞分泌干扰素γ等炎症分子的能力显著降低，B细胞和浆细胞增殖能力显著下降，Tfr细胞比例显著升高。在恶性肿瘤中miR-4286发挥着完全不同的生物学功能，非小细胞肺癌、前列腺癌和食管癌组织中miR-4286的表达显著上调，miR-4286可通过JAK2/STAT3和PTEN等通路促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等[20-22]。恶性肿瘤发生风险显著提高是器官移植患者服用抗排斥药物最主要的不良反应和死亡原因之一，据统计肾移植患者恶性黑色素瘤、肾癌和淋巴瘤等疾病的发病风险提高了10-100倍[23]。在肾移植后，靶向抑制miR-4286表达可通过调控免疫反应降低排斥反应的发生，同时还能显著降低恶性肿瘤发生风险。
Tfh细胞高表达CXCR5、PD1和ICOS等，可显著促进B细胞增殖和向浆细胞分化，白细胞介素21在这个过程中发挥着关键性的作用[24]。肾移植排斥反应患者体内的Tfh细胞比例显著升高，与患者的病情呈正相关性[25]。Tfr细胞是近期发现的一种新型免疫调节细胞，与调节性T细胞共同起源于原始T细胞[26]，其可通过细胞-细胞接触和分泌转化生长因子β等免疫抑制分子，抑制Tfh细胞，达到调控体液免疫的功能。此次研究显示，相对于非排斥反应的肾移植患者，排斥反应患者外周血Tfr细胞比例显著降低，相关抗体浓度则显著升高。不同组患者体内Tfr细胞的功能没有差异[27]。此次研究显示，miR-4286沉默可通过上调淋巴细胞中Tfr细胞比例提高B细胞增殖和向浆细胞分化的能力，转化生长因子β在这个过程中发挥着重要的作用。
综上，miR-4286在肾移植排斥反应患者外周血淋巴细胞中高表达，miR-4286沉默可能通过转化生长因子β途径上调淋巴细胞中Tfr细胞的比例，抑制体液免疫。该研究为移植患者发生慢性抗体介导排斥反应的预防和治疗提供了新的靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

上调滤泡调节性T细胞治疗肾移植抗体介导的排斥反应

Up-regulating follicular regulatory T cells for treating antibody-mediated rejection after kidney transplantation

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