2.1   口腔癌相关成纤维细胞的分离与鉴定结果   新鲜的口腔鳞癌组织标本，经酶解消化法处理并培养2 d后，可见有梭形成纤维样细胞存在；培养三四天后可见大量成纤维细胞增殖。将爬出的成纤维细胞进一步培养，利用包装有人端粒酶反转录酶(pBABE-hygro-hTERT)的慢病毒感染已经分离得到的原代肿瘤相关成纤维细胞，见图1A，B。采用免疫荧光对非永生化和永生化成纤维细胞进行α-SMA、FSP-1以及PDGFRβ染色，见图1C，D，明确了永生化口腔癌相关成纤维细胞系的建立。



2.2   永生化与非永生化口腔癌相关成纤维细胞生长曲线对比   采用CCK-8实验检测第3，6，10，15代永生化与非永生化成纤维细胞的生长曲线，连续观察4 d，结果显示永生化成纤维细胞增殖速率明显优于非永生化成纤维细胞。随着细胞代数增加，非永生化成纤维细胞的增殖速率明显下降，而永生化成纤维细胞的增殖速率未受细胞代数的影响，见图2。



2.3   永生化与非永生化口腔癌相关成纤维细胞衰老对比    在相同培养条件下同时培养永生化成纤维细胞和非永生化口腔癌相关成纤维细胞，对第3，6，10，15代永生化和非永生化口腔癌相关成纤维细胞进行β-半乳糖苷酶染色，在37 ℃培养箱内进行过夜培养，显微镜下观察发现随着细胞代数的增加，衰老的永生化成纤维细胞显著少于非永生化成纤维细胞，见图3。



2.4   永生化与非永生化口腔癌相关成纤维细胞的染色体核型鉴定   镜下观察发现，永生化口腔癌来源成纤维细胞染色体核型仍保留正常细胞的基本特征，而未发生恶性转化，见图4A，B。此外，短串联重复序列检测结果显示，两株细胞均为原代细胞，与已知细胞数据库信息均无重合，见图4C，D。

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口腔鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤[1]，60%的患者在就诊时已处于临床进展的晚期阶段，且传统手术、放化疗等对晚期患者的治疗效果有限[2-3]。肿瘤微环境具有异质性，不同特性的肿瘤细胞、间质细胞以及胞外成分间的信号交流塑造了“种子-土壤”微环境的异质性[4-5]。肿瘤微环境间质细胞主要包含成纤维细胞、间充质干细胞以及各种免疫细胞，作者前期研究关注了间充质干细胞与巨噬细胞极化的关系[6]。近年来有关口腔鳞状细胞癌的研究中，针对肿瘤相关成纤维细胞的研究有了很大的发展，肿瘤相关成纤维细胞作为肿瘤微环境中的重要间质细胞类型[7-9]，通过合成、重塑细胞外基质和产生生长因子来调节肿瘤进展，影响肿瘤的生长、转移及耐药等多种功能[10-14]。作者所在团队在口腔癌间质异质性方向上做了许多探索，前期成功分离、培养并鉴定了口腔鳞癌组织来源的原代成纤维细胞，通过转录组测序分析，揭示了肿瘤相关成纤维细胞的来源和转化机制，并发现间质肿瘤相关成纤维细胞能够直接影响肿瘤生长和靶向治疗疗效[15-16]。
但是目前关于肿瘤相关成纤维细胞研究过程中的一个重要考虑因素是细胞材料的稳定性，包括传代稳定性和表型及功能稳定性[17]。原代细胞在体外培养一段时间后，细胞便会失去生长、分裂的能力而走向衰老和死亡[18]。因此，随着原代肿瘤相关成纤维细胞的传代次数增加，其衰老程度也显著上升，增殖能力和促肿瘤进展的能力显著削弱，而永生化细胞能够通过外界因素使细胞不断分裂增殖而达到永生化的状态，具有多次传代的特性[19]，能够克服原代细胞只能使用5-8代的实验限制[20]。目前，国内成熟的永生化口腔癌相关肿瘤相关成纤维细胞系还处于缺乏状态。该研究收集口腔鳞癌患者手术标本，对肿瘤组织中的肿瘤相关成纤维细胞进行分离、培养、纯化和鉴定，再利用包装有人端粒酶反转录酶(pBABE-hygro-hTERT)的慢病毒感染原代肿瘤相关成纤维细胞[21]，旨在建立一株永生化的口腔鳞癌肿瘤相关成纤维细胞系，为研究口腔鳞状细胞癌肿瘤微环境提供稳定的实验材料基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   体外细胞实验。
1.2   时间及地点   实验于2019年2月至2021年2月在南京大学医学院附属口腔医院中心实验室完成。
1.3   材料   标本取自南京大学附属南京市口腔医院颌面外科收治的1例口腔癌患者，女性，75岁，鳞状细胞癌Ⅰ级。在知情同意的情况下，获取其手术标本。标本抗污染处理约3 h，用250 mL生理盐水(含青霉素160万U)反复冲洗三四次，浸泡于生理盐水小瓶中。该研究所使用的临床样本均获得南京大学医学院附属口腔医院的伦理审核和患者知情同意批准，批准编号：2019NL-009(KS)。
实验主要试剂：磷酸盐缓冲液(Servicebio，中国武汉)；DMEM培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗溶液(Gibco，美国)；FM培养基(ScienCell，美国)；青霉素/链霉素双抗溶液(Gibco，澳洲)；无血清细胞冻存液(Bambanker，日本)；胰蛋白酶(Invitrogen，美国)；Ⅰ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶(Biosharp，中国合肥)；中性蛋白酶(蓝季生物，中国上海)；透明质酸酶(Sigma，美国)；组织保存液(Miltenyi Biotec，德国)；Lipofecamine 3000转染试剂、Opit-MEM培养基(Thermo Fisher，美国)；抗体稀释液(DAKO，美国)；荧光封固剂(SouthernBiotech，美国)；鼠抗人PD-L1单克隆抗体(1∶200，Proteintech，美国)；兔抗人α-SMA单克隆抗体(1∶1 000，CST，美国)；Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor® 647)、Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594) (1∶400，Abcam，英国)；CCK-8试剂盒(Thermo Fisher，美国)；β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒(RG0039，碧云天，中国)。
实验主要仪器：CO2培养箱(Thermo Fisher，美国)；超净工作台(苏净安泰公司，中国苏州)；台式低温高速离心机(HITACH，日本)；落地式培养摇床(Thermo Fisher，美国)；光学显微镜(尼康，日本)；液氮罐(CBS，美国)；纯水机(Millipore，美国)；制冰机(安创仪器，中国苏州)；恒温金属浴(博日，中国杭州)；细胞爬片(WHB，中国上海)；免疫共聚焦显微镜(Nikon，日本)。
1.4   实验方法   

1.4.1   肿瘤相关成纤维细胞的培养、纯化   用含20%抗生素的PBS洗涤口腔鳞癌组织，去除上皮和脂肪组织，然后将样品切成小块并用复合酶(包括胶原酶、中性蛋白酶和透明质酸酶)消化30 min，将消化后的组织放入DMEM/F12基础培养基，置于37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱孵育，每两三天更换1次培养基，待细胞长满培养皿后加入2 mL胰蛋白酶消化两三分钟以除去上皮细胞，剩余细胞则是成纤维细胞，待剩余细胞长满培养皿后加入2 mL胰蛋白酶进一步消化2 min，此时获得纯化后的原代成纤维细胞，然后原代细胞按照培养细胞的正常操作步骤进行传代培养，待细胞长满培养皿后进行胰蛋白酶消化、离心、传代或冻存。

1.4.2   肿瘤相关成纤维细胞的永生化   为了建立肿瘤相关成纤维细胞系，利用包装有人端粒酶反转录酶(pBABE-hygro-hTERT)的慢病毒感染已经分离得到的原代肿瘤相关成纤维细胞，6 h后更换成DMEM/F12完全培养液，于细胞培养箱内继续培养24 h，然后加入150 mg/L潮霉素进行筛选，每3 d更换1次培养基，选择培养12-14 d，直至对照组(加入是阴性对照病毒)细胞全部死亡，将培养液中潮霉素浓度减半继续培养，直至转染细胞出现阳性克隆，胰酶消化后传代培养。
1.4.3   细胞免疫荧光染色鉴定   用无菌玻璃制细胞爬片浸泡于体积分数为75%乙醇中至少24 h，于超净操作台中取出放置于小培养皿中， PBS冲洗 2次，再铺于 24孔板中。常规消化原代成纤维细胞(包括非永生化和永生化成纤维细胞)，并用 DMEM/F12完全培养基重悬至适当浓度(1.6×108 L-1)，吹打细胞悬液使得单个细胞率在95%以上，每孔加入500 μL细胞悬液，均匀接种于24孔板内培养过夜，40 g/L多聚甲醛固定15 min，吸去多聚甲醛，PBS冲洗3次，每次5 min，用提前预冷的甲醇于-20 ℃打孔，15 min后吸去甲醇，PBS冲洗3次，每次5 min，3%牛血清白蛋白封闭1 h，吸去牛血清白蛋白，4 ℃孵育一抗过夜，一抗分别为α-SMA、FSP-1以及PDGFRβ，PBS洗去一抗，室温避光孵育荧光二抗一两个小时，PBS洗去二抗，加入DAPI细胞核染色2 min，PBS洗去DAPI，滴加防泮灭剂，用盖玻片封固，共聚焦荧光显微镜观察、拍照。
1.4.4   细胞增殖   利用CCK-8实验检测第3，6，10，15代永生化与非永生化肿瘤相关成纤维细胞的生长曲线，以每孔3 000个细胞种于96孔板中，培养7 d后每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中孵育2 h，使用酶标仪检测450 nm 波长处吸光度值，连续检测4 d。重复实验3次，取均值。
1.4.5   β-半乳糖苷酶染色   将非永生化和永生化的第3，6，10，15代肿瘤相关成纤维细胞以1.5×105个/孔细胞密度接种于6孔板，培养24 h后吸除细胞培养液，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定10 min，吸除细胞固定液，PBS洗涤细胞3次，每次3 min，吸除PBS，每孔加入1 mL染色工作液，37 ℃孵育20 min-2 h或更长时间，直至部分细胞颜色变蓝，如果孵育时间较长，可以用封口膜或保鲜膜封住6孔板防止蒸发，普通光学显微镜下观察。
1.4.6   细胞染色体核型分析   取对数生长的永生化和非永生化口腔癌相关成纤维细胞，加入50 μL秋水仙素，继续培养4 h；用吸管轻轻吹打分裂相细胞，1 000 r/min离心10 min，吸弃上清液；逐滴加入预热至37 ℃的KCl(0.075 mol/L)，每次加入0.5 mL，共5 mL，混匀，用吸管轻轻吹打均匀，37 ℃孵育30 min，用新鲜固定液固定；取-10 ℃冰冻的载玻片，距玻片15 cm高度处向玻片滴1滴或2滴加入固定液之后的细胞悬液，于室温干燥；4%吉姆萨溶液染色20 min，流水冲洗玻片背面，乙醇逐级脱水；二甲苯透明3次，中性树胶封固；油镜观察两种细胞染色体的数目及形态特征，并用Visus2.1软件进行分析处理。
1.4.7   细胞系鉴定   为了鉴定细胞系身份，进行短串联重复序列(short tandem repeat，STR)检测。取适量永生化成纤维细胞和第3代非永生化成纤维细胞，应用Microread Genomic DNA kit提取DNA，采用ColdeneyeTM 20A STR复合扩增试剂盒进行扩增，在ABI 3100型遗传分析仪上对短串联重复序列位点和性别基因Amelogenin进行检测。
1.5   主要观察指标   ①α-SMA、FSP-1、PDGFRβ免疫荧光染色；②细胞增殖能力；③β-半乳糖苷酶染色结果；④染色体核型。
1.6   统计学分析   采用SPSS 22.0软件(SPSS Inc., Chicago, IL)和GraphPad Prism 8.0进行数据统计学分析和图片处理，采用student t检验分析组间差异性，P < 0.05为差异有显著性意义。

肿瘤基质与肿瘤的起始、进展和转移密切相关，主要包括间充质来源的基质细胞，如癌症相关成纤维细胞和细胞外基质[22]。细胞外基质是影响治疗效果的主要因素，被认为是肿瘤微环境中免疫抑制的关键因素[23]。肿瘤相关成纤维细胞不仅为癌细胞提供机械支持，而且通过调节肿瘤免疫、肿瘤微环境代谢重新编程、细胞外基质重塑和收缩以及诱导治疗耐药等多种现象参与调控癌细胞的增殖、存活、转移和治疗的耐药性[24-25]。肿瘤相关成纤维细胞在口腔鳞状细胞癌组织中分布广泛，主要集中在癌巢间质和前沿区域，具有较高肿瘤相关成纤维细胞比例的口腔鳞状细胞癌患者，其生存率较低，但其生物学机制还需进一步明确。目前，研究发现口腔鳞状细胞癌中肿瘤相关成纤维细胞可分泌肿瘤坏死因子α和基质细胞衍生因子(SDF1/CXCL12)，通过SDF-1/CXCR4信号轴促进人脐静脉内皮细胞侵袭性及新生血管形成[26]。作者所在团队也发现，肿瘤相关成纤维细胞中高度表达一种新的长链非编码RNA并命名为Lnc-CAF，Lnc-CAF/IL-33信号通路可诱导正常成纤维细胞转化为肿瘤相关成纤维细胞，敲除Lnc-CAF显著抑制了肿瘤细胞生长，并且组织中Ki-67表达降低[16]。因此，探究肿瘤相关成纤维细胞在口腔鳞状细胞癌生长、转移和免疫治疗中的作用是头颈癌研究领域的热点方向，但是目前实验研究过程中还缺乏能够稳定传代的肿瘤相关成纤维细胞系。
正常细胞在体外培养一段时间后，细胞便会失去生长、分裂的能力而走向衰老和死亡[27]。细胞系是生物学研究的重要工具，一般的建立方法是从生物体的离体组织中分离培养出细胞，并加以改造形成稳定的细胞系[21]。因此，使目的细胞在体外永生化成为众多研究的重点[28]，例如有研究建立了肾癌的内皮细胞系，为探索肾癌血管新生领域提供实验材料[29]。在该研究中，将人端粒酶反转录酶感染口腔鳞癌原代成纤维细胞建立了正常表型的肿瘤相关成纤维细胞永生化细胞系，永生化肿瘤相关成纤维细胞能够不受传代次数的限制，CCK-8实验证实该细胞系能够一直稳定传代，并且增殖能力没有明显衰退。相比之下，原代肿瘤相关成纤维细胞在增殖8-10代时就已经出现增殖能力下降的问题。其他文献也证实永生化细胞能够通过外界因素使细胞不断分裂增殖而达到永生化的状态，具有多次传代的特性，能够无限增殖、无表型变化，具有克隆性与均一性，能够使那些难以传代、增殖缓慢、易衰老的细胞获得永生化的特性，有利于毒理、致病机制、细胞移植、组织工程等各方面的研究[30]。
对口腔鳞癌的基础与临床研究而言，建立肿瘤相关成纤维细胞系是肿瘤相关成纤维细胞与肿瘤交互作用研究中至关重要的环节，而国内目前尚缺乏成熟的口腔鳞癌相关成纤维细胞系[31]。肿瘤相关成纤维细胞的体外建系主要面临三大问题：一是原代细胞在培养过程中容易出现衰老，很难进行长期的连续传代；二是要严格控制肿瘤细胞的生长；三是要预防经常发生的细菌、霉菌以及支原体等污染[32-33]。在肺癌研究中，有研究人员成功建立了肺癌相关成纤维细胞的永生化细胞系，该细胞能够在体外稳定传代，为肺癌的间质细胞研究提供基础[34]。该研究建立的永生化肿瘤相关成纤维细胞在连续传代过程中，没有出现显著的细胞衰老，活力能够有效保持，有助于进一步探讨肿瘤相关成纤维细胞与口腔鳞癌细胞的交互作用机制。此外，肿瘤微环境中的肿瘤相关成纤维细胞具有表型和功能的异质性，这意味着肿瘤相关成纤维细胞的特殊亚群在肿瘤进展和治疗反应中的作用迥异。该研究获得单细胞背景来源的肿瘤相关成纤维细胞克隆，将非常有效地用于探究肿瘤相关成纤维细胞在局部微环境中对肿瘤细胞的独特作用。
综上所述，该研究通过原代培养和细胞永生化技术成功建立了口腔癌来源的永生化成纤维细胞系，且永生化的成纤维细胞染色体无异常变化，表型和增殖能力稳定，该细胞系的建立为口腔癌肿瘤微环境的研究提供进一步的实验基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
肿瘤相关成纤维细胞：是肿瘤基质细胞的主要成分，又称肌纤维母细胞、癌旁成纤维细胞、反应性纤维母细胞、癌相关成纤维细胞。相较于长梭形的静息状态成纤维细胞，肿瘤相关成纤维细胞体积较大、排列方式杂乱、呈纺锤形、细胞核呈锯齿状、细胞浆中收缩细丝或张力纤维丝增加，可通过自分泌或旁分泌细胞因子的形式作用于肿瘤细胞，或通过与肿瘤细胞直接接触，参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等重要病理过程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

肿瘤相关成纤维细胞是肿瘤微环境中的重要间质细胞类型，可通过自分泌或旁分泌细胞因子的形式作用于肿瘤细胞，或通过与肿瘤细胞直接接触，参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等重要病理过程，探究肿瘤相关成纤维细胞在口腔鳞状细胞癌生长、转移和免疫治疗中的作用是头颈癌研究领域的热点方向。#br# 原代细胞在体外培养一段时间后，细胞便会失去生长、分裂的能力而衰老和死亡。永生化细胞能够不断分裂增殖而达到永生化的状态，具有多次传代的特性，能够克服原代细胞只能使用5-8代的实验限制。目前，国内尚缺乏成熟的口腔鳞癌相关成纤维细胞系。#br# 该研究收集口腔鳞癌患者手术标本，对肿瘤组织中的肿瘤相关成纤维细胞进行分离、培养、纯化和鉴定，再利用包装有人端粒酶反转录酶(pBABE-hygro-hTERT)的慢病毒感染原代肿瘤相关成纤维细胞，为研究口腔鳞状细胞癌肿瘤微环境提供稳定的实验材料基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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