体外诱导人胎盘来源间充质干细胞向肝细胞分化

doi:10.12307/2022.568

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (24): 3870-3874.doi: 10.12307/2022.568

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

体外诱导人胎盘来源间充质干细胞向肝细胞分化

梁婷婷1，陈黎2，范明松2，张国英2，张世昌1

南京医科大学第一附属医院，1检验学部，2产科，江苏省南京市 210029

收稿日期:2021-05-22 接受日期:2021-06-17 出版日期:2022-08-28 发布日期:2022-01-24
通讯作者: 张世昌，博士，副教授，硕士生导师，南京医科大学第一附属医院检验学部，江苏省南京市 210029
作者简介:梁婷婷，女，1997年生，江苏省扬州市人，汉族，2019年江苏大学毕业，硕士，主要从事干细胞与再生医学研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81671836)，项目负责人：张世昌

In vitro differentiation of human placenta-derived mesenchymal stem cells into hepatocytes

Liang Tingting1, Chen Li2, Fan Mingsong2, Zhang Guoying2, Zhang Shichang1

1Department of Laboratory Medicine, 2Department of Obstetrics, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China

Received:2021-05-22 Accepted:2021-06-17 Online:2022-08-28 Published:2022-01-24
Contact: Zhang Shichang, MD, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
About author:Liang Tingting, Master, Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81671836 (to ZSC)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
胎盘间充质干细胞：是一种起源于中胚层、来源于胎盘组织、具有自我复制能力的多潜能细胞。与其他组织来源间充质干细胞比较，具有更强的自我更新和多向分化能力、取材方便、来源广泛、免疫原性低等优势，为许多疾病的干细胞治疗提供理想的间充质干细胞来源。
肝功能衰竭：当受到多种因素引起严重损害时，造成肝细胞大量坏死，导致肝功能发生严重障碍或失代偿，进而出现以凝血机制障碍和黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群。治疗肝功能衰竭需要大量高质量肝细胞通过细胞移植或体外生物人工肝代偿肝脏功能，以过渡到自身肝再生或肝移植。

背景：间充质干细胞是治疗肝功能衰竭的重要细胞来源，将其诱导分化为肝细胞后能提高肝功能衰竭的治疗效果。
目的：探讨胎盘组织来源间充质干细胞在体外诱导分化为成熟肝细胞的可行性，为其用于肝功能衰竭治疗奠定基础。
方法：从人胎盘组织中分离培养人胎盘来源间充质干细胞，采用流式细胞分析、多向诱导分化等方法鉴定。应用多细胞因子将胎盘间充质干细胞向肝细胞诱导分化22 d，采用免疫荧光染色检测肝细胞标志物的表达变化，糖原染色检测细胞的糖原合成能力。
结果与结论：①倒置显微镜下可见分离培养的细胞为梭形或成纤维细胞样细胞，增殖迅速，传10代后细胞形态未见明显变化；②流式细胞分析结果显示CD73、CD90、CD105、CD44、CD166、CD29、CD54、HLA-ABC在胎盘间充质干细胞中阳性率超过95%，而CD34、CD45、CD117、CD14、CD19、CD133、CD31、HLA-DR均为阴性；③经成脂、成骨、成软骨细胞诱导分化后，油红O、茜素红、阿辛蓝染色均为阳性；④向肝细胞诱导分化22 d后，呈圆形或多角形、细胞界限明显的典型肝细胞形态，免疫荧光染色显示大量细胞表达肝细胞表面标志物白蛋白、细胞角蛋白18、HepPar1、CYP7A1，糖原染色为阳性；⑤结果表明，从人胎盘组织分离培养的细胞为间充质干细胞，人胎盘间充质干细胞在体外可诱导分化为成熟肝细胞，有望为肝功能衰竭治疗提供可靠的肝细胞来源。

https://orcid.org/0000-0003-2240-4076 (梁婷婷) ；https://orcid.org/0000-0002-6587-2518 (张世昌)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 间充质干细胞, 胎盘, 肝细胞, 肝衰竭, 成熟肝细胞, 体外诱导

Abstract: BACKGROUND: Mesenchymal stem cells are an attractive source of therapies for liver failure. The differentiation of mesenchymal stem cells into hepatocytes can improve the therapeutic effect of liver failure.
OBJECTIVE: To investigate the feasibility of placenta derived mesenchymal stem cells to differentiate into mature hepatocytes in vitro for the treatment of liver failure.
METHODS: Placenta-derived mesenchymal stem cells were isolated and cultured from human placenta tissue. The surface markers and differentiation potential of the isolated cells were identified by flow cytometry, and multidirectional induction. Placenta-derived mesenchymal stem cells were induced into hepatocytes by several cytokines for 22 days. Hepatic markers of induced cells were detected by immunofluorescence staining. Glycogen staining was used to detect the glycogen synthesis ability of cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Under the inverted microscopy, the cultured cells were spindle or fibroblast-like cells, which proliferated rapidly. There was no obvious change in cell morphology after 10 passages. (2) Flow cytometry results revealed that the positive rate of CD73, CD90, CD105, CD44, CD166, CD29, CD54, and HLA-ABC in placenta-derived mesenchymal stem cells was more than 95%, while CD34, CD45, CD117, CD14, CD19, CD133, CD31, and HLA-DR were all negatively expressed. (3) The results of oil red O, alizarin red, and alcian blue staining were positive after adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation of placenta-derived mesenchymal stem cells. (4) After 22 days of hepatic differentiation, these cells exhibited typical morphology of hepatocytes such as round or polygonal shape with obvious cell boundary. Immunofluorescence staining showed that a large number of differentiated cells expressed albumin, CK-18, HepPar1, and CYP7A1 after induction. The positive staining of differentiated cells was observed by glycogen staining. (5) Our results demonstrated that the cells isolated from placenta were mesenchymal stem cells, and placenta-derived mesenchymal stem cells can differentiate into mature hepatocytes in vitro, which could provide reliable sources of hepatocytes for the treatment of liver failure.

Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, placenta, hepatocytes, liver failure, mature hepatocytes, in vitro induction

中图分类号:

梁婷婷, 陈黎, 范明松, 张国英, 张世昌. 体外诱导人胎盘来源间充质干细胞向肝细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3870-3874.

Liang Tingting, Chen Li, Fan Mingsong, Zhang Guoying, Zhang Shichang. In vitro differentiation of human placenta-derived mesenchymal stem cells into hepatocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(24): 3870-3874.

图/表（结果） 6

2.1 人胎盘间充质干细胞的形态特征培养5 d后，倒置显微镜下可见典型梭形或成纤维细胞样细胞生长，见图1A，培养10 d后可增殖形成集落样，见图1B，有少量漂浮细胞。传代后细胞形态更单一，呈梭形，见图1C，增殖后呈漩涡状生长，传代到第10代，细胞形态未见明显变化，见图1D。

2.2 人胎盘间充质干细胞的表型鉴定结果流式细胞分析结果显示，传至第4代的人胎盘间充质干细胞的干细胞或间质细胞标志CD90、CD73、CD105、CD29、CD44、CD166、CD54均为阳性，特别是CD73、CD90、CD105、CD29、CD44、CD166均在98%以上；而造血细胞相关标志CD34、CD45、CD14、CD117、CD19、CD133以及组织相容性抗原Ⅱ分子HLA-DR均为阴性，而组织相容性抗原Ⅰ分子HLA-ABC为阳性；CD31为阴性排除了血管内皮细胞；CD105+CD34-的细胞达98.37%，CD73+CD90+的细胞达98.62%，CD133-CD31-和CD117-CD14-的细胞超过96.00%，见图2。结果表明分离获得的细胞是来源于间质的干细胞，并排除造血细胞的污染。

2.3 人胎盘间充质干细胞的多向分化能力鉴定结果经过28 d的成脂诱导培养后，油红O染色可见细胞内有较多红色的脂滴，见图3A；经过28 d的成骨诱导培养后，茜素红染色可见细胞内有较多红色矿化基质沉积，见图3B；经将21 d成软骨诱导培养后，阿辛蓝染色可见细胞显示出蓝色，见图3C，提示细胞表达软骨细胞特异性的Ⅱ型胶原蛋白。结果表明从胎盘组织分离培养的细胞具备向脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞分化的能力。

2.4 人胎盘间充质干细胞诱导分化为肝细胞向肝细胞诱导22 d后，在倒置相差显微镜下可见胎盘间充质干细胞由诱导分化前的成纤维细胞样、梭形细胞，逐渐变成圆形或多角形、细胞界限明显的上皮样细胞，见图4，与体外培养的人肝细胞形态相似。免疫荧光染色结果显示：向肝细胞诱导分化后，成熟肝细胞标志物白蛋白、细胞角蛋白18、HepPar1等阳性表达；生物转化的关键酶类CYP7A1由原来的阴性转为阳性表达，而未诱导分化的胎盘间充质干细胞为阴性，胆管上皮细胞的标志物细胞角蛋白19的表达未见明显变化，提示人胎盘间充质干细胞可以分化为肝细胞，见图5。人胎盘间充质干细胞向肝细胞诱导分化后糖原染色阳性，而未诱导的胎盘间充质干细胞糖原染色阴性，见图6。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外诱导分化实验。
1.2 时间及地点实验于2020年12月至2021年3月在南京医科大学第一附属医院检验学部实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验试剂 LG-DMEM、IMDM、胎牛血清、PBS(Gibco公司，美国)；4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)、青霉素、链霉素、胰酶消化液、多聚甲醛(碧云天公司，中国)；CD90、CD73、CD105、CD29、CD44、CD166、CD54、CD34、CD45、CD14、CD117、CD19、CD133、HLA-DR、HLA-ABC等流式细胞分析抗体(eBioscience公司，美国)；成脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞诱导培养基、油红O、茜素红和阿辛蓝染液(赛业公司，中国)；表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、烟酰胺、胰岛素-转移蛋白-硒、肿瘤抑制因子M、地塞米松、人白蛋白、细胞角蛋白18、细胞角蛋白19、细胞色素P450 7A1(CYP7A1)、HepPar1 (Thermo Fisher公司，美国)。
1.3.2 实验仪器倒置相差显微镜和荧光显微镜(Olympus公司，日本)；细胞培养箱(Nuaire公司，德国)。
1.4 实验方法
1.4.1 人胎盘间充质干细胞的分离和培养该研究经南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准，并与产妇签订知情同意书。从产科收集健康足月剖宫产分娩的人胎盘组织，置于含抗生素的生理盐水中，2 h内低温运送至实验室。将胎盘组织用PBS多次冲洗，用剪刀剪碎，用0.25%胰酶-EDTA消化，具体方法参照以往研究报道[20]。将新分离的细胞重新悬浮在含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/L链霉素的LG-DMEM培养液中，以1×108 L-1的细胞浓度接种于培养瓶内，置于37 ℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱内培养，待细胞融合达到80%左右，可进行传代培养。
1.4.2 人胎盘间充质干细胞的表型鉴定将第4代人胎盘间充质干细胞经0.25%胰酶消化、离心和洗涤后，将细胞浓度调整到1×109 L-1，在各管中分别加入以下抗体：PE标记的HLA-ABC、HLA-DR、CD117、CD133、CD73、CD29、CD54、CD105，FITC标记的CD166、CD14，CD19、CD31、CD34、CD44、CD45、CD90，室温孵育30 min，PBS清洗，流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达。

1.4.3 人胎盘间充质干细胞的多向分化潜能鉴定将第4代人胎盘间充质干细胞分别用间充质干细胞成脂、成骨和成软骨诱导分化培养基按照说明书进行诱导分化，然后用油红O、茜素红和阿辛蓝染液进行染色，镜下观察成脂、成骨和成软骨细胞的诱导分化情况。

1.4.4 人胎盘间充质干细胞向肝细胞的诱导分化将第4代人胎盘间充质干细胞重悬在含体积分数为10%胎牛血清和100 U/mL青霉素和100 g/L链霉素的LG-DMEM培养液中，以1.0×104/cm2的细胞密度接种于10 cm培养皿，培养2 d后进行成肝诱导分化，换成含20 μg/L表皮细胞生长因子和10 μg/L成纤维细胞生长因子的IMDM培养液培养2 d，然后在含20 μg/L肝细胞生长因子、10 μg/L成纤维细胞生长因子、0.61 g/L烟酰胺和1%胰岛素-转移蛋白-硒的IMDM培养液中培养10 d，最后在含20 μg/L肿瘤抑制因子M、1 mol/L地塞米松、1%胰岛素-转移蛋白-硒的IMDM培养液中培养10 d。每个步骤的培养液均每3 d更换1次。倒置相差显微镜下观察诱导分化细胞形态变化。
1.4.5 免疫荧光染色将向肝细胞诱导分化22 d的细胞用40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS洗涤3次，浸泡在含0.1%TritonX-100和体积分数为1%正常山羊血清的PBS中30 min，然后在4 ℃下与以下兔抗人一抗孵育过夜：白蛋白(1∶300)、细胞角蛋白18(1∶200)、细胞角蛋白19(1∶200)、HepPar1(1∶200)和CYP7A1(1∶200)，PBS洗涤，与FITC或PE标记的山羊抗兔IgG(1∶400)室温孵育1 h，用4，6-二氨基-2-苯基吲哚染色细胞核，荧光显微镜观察并拍照记录。
1.4.6 糖原染色将向肝细胞诱导分化22 d的细胞用40 g/L多聚甲醛固定10 min，先用过碘酸液染色10 min，自来水冲洗10 min，再用Schiff氏液染色10 min，流水冲洗5 min，显微镜下观察，红色细胞为阳性。
1.5 主要观察指标 ①人胎盘间充质干细胞表面标志物的表达；②人胎盘间充质干细胞的成骨、成脂、成软骨细胞诱导分化潜能；③人胎盘间充质干细胞的成肝细胞分化潜能；④成肝细胞诱导分化后，免疫荧光染色检测肝细胞标志物表达；⑤成肝细胞诱导分化后，糖原染色检测糖原合成能力。

讨论

间充质干细胞是干细胞治疗肝功能衰竭的重要细胞来源，也是目前最有可能实现临床转化的干细胞[21]。间充质干细胞是中胚层来源的一类具有多向分化能力的干细胞，目前，间充质干细胞鉴定主要是根据细胞形态学、生长特征、多种免疫表型及多向分化潜能来综合判断，判断的最低标准[22]：首先分离的细胞在标准培养条件贴壁生长，细胞形态呈成纤维样；其次是细胞表型CD105、CD73、CD90、CD166、CD44等分子表达必须大于95%，而CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79或CD19、HLA-DR等分子表达小于2%；第三是多向分化潜能，细胞在体外必须能够分化成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。
该研究从胎盘组织中分离的细胞能在培养瓶内贴壁集落样生长，传代后呈较均一的梭形、旋涡状生长，与骨髓、脐血、脂肪组织来源间充质干细胞的形态相似。第10代的细胞形态学和增殖能力未见明显变化，表明从胎盘组织分离的细胞具有典型间充质干细胞形态和较强的增殖能力。不同组织来源、不同方法、不同实验室分离的间充质干细胞的表型特征并不完全一致[15，20，23-24]。该研究采用流式细胞仪检测干细胞或间质细胞标志物CD90、CD73、CD105、CD29、CD44、CD166、CD54均为阳性，而造血干细胞抗原标志(CD34、CD45、CD14、CD117、CD19、CD133等)均为阴性，提示分离的细胞群具有间充质干细胞的抗原标志而不是造血干细胞。胎盘间充质干细胞的CD105和CD166表达均在98%以上，远高于其他研究报道，而CD117的表达在2%以下，远低于以往的研究结果[25]，表明该研究分离的胎盘间充质干细胞更均一，CD73+CD90+、CD29+CD45-、CD105+CD34-、CD117-CD14-、CD31-CD133-等抗体双标检测结果均在95%以上，进一步确认从胎盘组织分离获得纯度较高的胎盘间充质干细胞。组织相容性抗原Ⅱ分子HLA-DR是细胞移植引起免疫反应的关键抗原分子，分离的胎盘间充质干细胞HLA-DR表达阴性，提示胎盘间充质干细胞的免疫原性可能较低。间充质干细胞鉴定的重要特性是其多向分化潜能[22]。胎盘间充质干细胞成脂诱导分化后利用油红O染色确定细胞内有脂滴形成，成骨诱导分化后利用茜素红染色证实有钙结节形成，成软骨诱导分化后利用阿辛蓝染色鉴定细胞表达软骨细胞特异性的Ⅱ型胶原蛋白，提示分离的胎盘间充质干细胞具有较强多向分化潜能。因此，以上结果表明该研究从胎盘组织分离培养的细胞是间充质干细胞。
以往研究表明，不同组织来源的间充质干细胞均能向肝细胞诱导分化，但大部分诱导分化成肝细胞样细胞[26-30]。间充质干细胞诱导分化为肝细胞最直接的证据是细胞形态的改变[15]，该研究经多步诱导分化后细胞呈典型的多角形肝细胞形态。肝细胞标志物的表达是鉴定诱导分化肝细胞的重要手段之一[31]。该研究胎盘间充质干细胞诱导分化后高表达白蛋白、细胞角蛋白18、HepPar1、CYP7A1等成熟肝细胞的标志物，白蛋白的表达提示诱导分化后的细胞具备一定的蛋白合成功能，糖原染色阳性表明诱导分化获得的细胞具备糖原合成功能，从功能上进一步证实其合成能力。CYP7A1是肝脏进行生物转化的关键酶类，诱导分化后细胞CYP7A1阳性表明其可能具备生物转化功能。在其他以往研究报道中[20，32-33]，胎盘间充质干细胞诱导分化后的细胞仅表达白蛋白和甲胎蛋白，而在该研究中胎盘间充质干细胞诱导分化后表达更多成熟的肝细胞标志物。FORTE等[34]研究报道显示采用多步骤诱导分化方法比一步法获得肝细胞更成熟，而该研究采用三步法将胎盘间充质干细胞逐渐向肝细胞诱导分化，这可能是获得成熟肝细胞标志物HepPar1和CYP7A1表达阳性的原因。因此，该研究中胎盘间充质干细胞诱导分化后获得的肝细胞更成熟，具备更完善的合成和生物转化功能，有望通过细胞移植治疗肝功能衰竭，为其提供更强的肝功能代偿。当然，该研究中诱导分化获得的肝细胞尚需详细评价其多方面的肝细胞功能。利用生物反应器将干细胞大规模诱导分化为肝细胞是干细胞临床转化的研究方向[35-36]，下一步将探讨人胎盘间充质干细胞诱导分化为成熟肝细胞的大规模制备方法，从而为肝功能衰竭治疗提供足够数量的肝细胞。
综上所述，该研究结果表明人胎盘间充质干细胞是一种来源充足、取材方便、可广泛应用的间充质干细胞，在体外可诱导分化为成熟肝细胞，有望为肝功能衰竭治疗提供可靠的肝细胞来源。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

体外诱导人胎盘来源间充质干细胞向肝细胞分化

In vitro differentiation of human placenta-derived mesenchymal stem cells into hepatocytes

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