内热针干预激素性股骨头缺血性坏死模型大鼠抑制破骨及促进新骨形成

doi:10.12307/2022.528

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (17): 2642-2648.doi: 10.12307/2022.528

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内热针干预激素性股骨头缺血性坏死模型大鼠抑制破骨及促进新骨形成

田心保1，许建峰1，2，黄媛1，赖喆蓥1，李小龙1，刘小丽1，林瑞珠1，3，朱宁1，3

1宁夏医科大学，宁夏回族自治区银川市 750004；宁夏医科大学总医院，2中医骨伤科，3康复医学科，宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2021-05-22 修回日期:2021-05-25 接受日期:2021-07-26 出版日期:2022-06-18 发布日期:2021-12-24
通讯作者: 朱宁，主任医师，教授，硕士生导师，宁夏医科大学总医院康复医学科，宁夏回族自治区银川市 750004 林瑞珠，博士，副主任医师，副教授，硕士生导师，宁夏医科大学，宁夏回族自治区银川市 750004；宁夏医科大学总医院康复医学科，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:田心保，男，1993 年生，宁夏回族自治区银川市人，回族，宁夏医科大学在读硕士，初级治疗师，主要从事肌肉骨骼疾患康复研究。
基金资助:
国家自然科学地区基金 (81760904)，项目负责人：朱宁

Internal heat-type acupuncture inhibits osteoblast viability and promotes bone formation in a rat model of steroid-induced avascular necrosis of the femoral head

Tian Xinbao1, Xu Jianfeng1, 2, Huang Yuan1, Lai Zheying1, Li Xiaolong1, Liu Xiaoli1, Lin Ruizhu1, 3, Zhu Ning1, 3

1Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2Department of Orthopedics and Traumatology of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Rehabilitation Medicine, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2021-05-22 Revised:2021-05-25 Accepted:2021-07-26 Online:2022-06-18 Published:2021-12-24
Contact: Zhu Ning, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Department of Rehabilitation Medicine, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China Lin Ruizhu, MD, Associate chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Department of Rehabilitation Medicine, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Tian Xinbao, Master candidate, Therapist, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81760904 (to ZN)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
内热针疗法：是软组织外科学创始人宣蛰人教授经过临床应用总结出的一种最新软组织疼痛治疗方式，以软组织外科学无菌性炎症致痛学说为理论依据，通过针刺效应和热效应松解病变肌筋膜的激痛点，解除肌肉组织痉挛，达到局部组织的减压及减张，改善局部供血，消除无菌性炎症，松解局部肌肉痉挛，调节生物力学平衡，以达到治疗疾病的目的。
骨保护素：是作为肿瘤坏死因子的家族成员，可以调节破骨细胞和骨吸收过程，骨保护素是核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的可溶性诱饵受体，与核因子κB受体活化因子(RANK)竞争性结合，可抑制RANKL与RANK的结合，从而抑制破骨细胞的形成和活性，在骨重塑过程中发挥重要作用。

背景：出于疾病治疗目的，临床上糖皮质激素被广泛应用，导致该类患者群体患激素性股骨头缺血性坏死的风险增加。然而目前为止，激素性股骨头缺血性坏死的详细发病机制尚不明确。内热针疗法治疗激素性股骨头缺血性坏死在临床上效果良好，但对其具体作用机制尚未明晰。
目的：探讨内热针疗法对激素性股骨头缺血性坏死股骨头组织中骨保护素、核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)表达的影响。
方法：随机在30只健康、无特定病原体的SD大鼠中选择10只作为空白组，其余20只采用甲基强的松龙联合大肠杆菌内毒素的方法制备激素性股骨头缺血性坏死模型，造模成功后再随机分为模型对照组和治疗组，每组10只。治疗组对SD大鼠双侧臀部进行1次/周的内热针治疗，20 min/次，设定温度为42 ℃；空白组和模型对照组均不采取任何处理。干预前后对大鼠进行一般状态和行为学检测实验(测定自主活动次数和抓力)；干预4周后对大鼠双侧股骨头取材，采用苏木精-伊红染色观察各组大鼠股骨头骨组织形态学变化并计算空骨陷窝率；分别采用实时荧光定量PCR、免疫组织化学染色和蛋白免疫印迹法检测各组股骨头组织中骨保护素、RANKL的mRNA及蛋白表达。
结果与结论：①与空白组相比，模型对照组和治疗组大鼠的相关行为学评分明显降低(P < 0.01)；干预后与模型对照组相比，治疗组大鼠的相关行为学评分升高(P < 0.05)；②与空白组相比，模型对照组的股骨头组织形态学明显恶化且空骨陷窝率升高(P < 0.001)，差异有显著性意义；干预后与模型对照组相比，治疗组的股骨头组织形态学明显改善且空骨陷窝率降低(P < 0.05)；③与空白组相比，模型对照组大鼠股骨头组织中的RANKL的蛋白及mRNA表达水平明显升高，骨保护素的蛋白及mRNA表达水平明显降低，差异均有显著性意义(P < 0.001)；干预后与模型对照组相比，治疗组大鼠股骨头组织中的RANKL的蛋白及mRNA表达水平明显降低，骨保护素的蛋白及mRNA表达水平明显升高，差异均有显著性意义(P < 0.05)；④结果说明，内热针疗法可能通过上调骨保护素的表达和下调RANKL的表达，抑制破骨细胞的功能及活性，从而抑制骨吸收，促进新骨的形成及骨组织修复。
缩略语：激素性股骨头缺血性坏死：Steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH；核因子κB受体活化因子配体：receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL

https://orcid.org/0000-0003-0594-9584 (田心保)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 激素性股骨头缺血性坏死, 内热针, 骨重塑, 破骨细胞, 骨代谢, 骨保护素, 核因κB受体活化因子配体

Abstract: BACKGROUND: For the therapeutic purpose, glucocorticoids have been widely used in clinic, resulting in an increased risk of steroid-induced avascular necrosis of the femoral head (SANFH). However, the detailed pathogenesis of SANFH is not yet clear. Internal heat-type acupuncture therapy has a good clinical effect in the treatment of SANFH, but its specific mechanism has not been clearly analyzed.
OBJECTIVE: To explore the effect of internal heat-type acupuncture on the expression of osteoprotegerin and nuclear factor kappa B receptor activator ligand (RANKL) in SANFH femoral head tissue.
METHODS: Thirty healthy Sprague-Dawley rats without specific pathogens were randomly divided into blank group (n=10) and model group (n=20). The SANFH model was made by methylprednisolone combined with Escherichia coli endotoxin. After successful modeling, the model rats were further randomly divided into model group (n=10) and treatment group (n=10). In the treatment group, the bilateral buttocks of Sprague-Dawley rats were treated with internal heat-type acupuncture once a week for 20 minutes, and the temperature was set at 42 °C. Both the blank group and the model group were not given any treatment. The general state and behaviors (number of voluntary activities and holding power) of Sprague-Dawley rats were detected before and after intervention, and the bilateral femoral heads of rats were taken after 4 weeks of intervention. The histomorphological changes of the rat femoral head were observed by hematoxylin-eosin staining and the rate of empty lacunae was calculated. The mRNA and protein expressions of osteoprotegerin and RANKL in the femoral head tissues of each group were detected by real-time fluorescence quantitative PCR, immunohistochemical staining and western blot, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: The behavioral scores of rats in the model and treatment groups were significantly lower than those in the blank group (P < 0.01). After intervention, the behavioral scores of rats in the treatment group were significantly higher than those in the model group. Compared with the blank group, the histomorphology of the femur became significantly worse and the rate of empty bone lacuna was significantly higher in the model group (P < 0.001). Compared with the model group, the histomorphology of the femur was significantly improved and the rate of empty bone lacuna was decreased in the treatment group (P < 0.05). Compared with the blank group, the expression levels of RANKL protein and mRNA in the rat femoral head tissue were significantly higher in the model group, while the protein and mRNA expression levels of osteoprotegerin were significantly lower in the model group (P < 0.001). After intervention, the expression levels of RANKL protein and mRNA in the rat femoral head tissue in the treatment group were significantly lower than those in the model group, while the protein and mRNA expression levels of osteoprotegerin were significantly higher than those in the model group (P < 0.05). To conclude, internal heat-type acupuncture may up-regulate the expression of osteoprotegerin, down-regulate the expression of RANKL, and inhibit the function and activity of osteoclasts, thus inhibiting bone resorption and promoting new bone formation and bone tissue repair.

Key words: steroid-induced avascular necrosis of the femoral head, internal heat-type acupuncture, bone remodeling, osteoclast, bone metabolism, osteoprotegerin, receptor activator of nuclear factor kappa B ligand

中图分类号:

田心保, 许建峰, 黄媛, 赖喆蓥, 李小龙, 刘小丽, 林瑞珠, 朱宁. 内热针干预激素性股骨头缺血性坏死模型大鼠抑制破骨及促进新骨形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(17): 2642-2648.

Tian Xinbao, Xu Jianfeng, Huang Yuan, Lai Zheying, Li Xiaolong, Liu Xiaoli, Lin Ruizhu, Zhu Ning. Internal heat-type acupuncture inhibits osteoblast viability and promotes bone formation in a rat model of steroid-induced avascular necrosis of the femoral head[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(17): 2642-2648.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析实验选用30只SD大鼠，随机分为3组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。
2.2 SANFH大鼠模型的建立 SANFH动物模型建立结束后，分别对空白组及模型对照组的两只大鼠进行影像学X射线片检查，见图1A，B。与空白组相比，模型对照组股骨头上出现高密度的弧形硬化带，边缘相对模糊；并处死2只模型对照组大鼠，取大鼠股骨头标本，常规苏木精-伊红染色进行组织病理学检查，见图1C，D，可见骨小梁减少、骨陷窝排列紊乱、骨髓脂肪细胞体积增大、部分脂肪细胞融合成泡状物等形态异常。苏木精-伊红染色结果结合影像学表现提示成功地建立了SANFH大鼠模型，为进一步的体内检测提供了准确可靠的保证。

2.3 各组大鼠干预前后一般状态观察结果比较造模前各组大鼠在体质量、毛色、饮食等方面没有明显改变。造模1周后，模型对照组大鼠逐渐表现为烦躁、易激惹、毛发泛黄无光泽、活动次数明显减少；经4周的内热针治疗后，大鼠表现出良好的活力，毛色有明显改善，进食良好，活动次数明显增加。
2.4 各组大鼠干预前后相关行为学评分比较
2.4.1 自主活动次数与空白组相比，模型对照组大鼠自主活动次数明显减少，3 min及5 min时差异均有显著性意义(P < 0.05)；干预后，与模型对照组相比，治疗组大鼠自主活动次数3 min内未见明显差异，但5 min内差异有显著性意义(P < 0.001)，结果见表2。

2.4.2 抓力测试结果与空白组相比，模型对照组大鼠抓力明显降低，差异有非常显著性意义(P < 0.001)；干预后，与模型对照组相比，治疗组大鼠抓力明显增加，且差异有非常显著性意义(P < 0.001)，结果见表2。
2.5 各组SD大鼠股骨头骨组织病理学改变苏木精-伊红染色分析股骨头坏死程度，结果显示，空白组骨小梁排列整齐致密，骨小梁内骨细胞清晰可见，脂肪细胞形态正常，成骨细胞丰富，空骨陷窝率较低；与空白组相比，模型对照组骨小梁减少、骨陷窝排列紊乱、骨髓脂肪细胞体积增大、部分脂肪细胞融合成泡状物等形态异常，空骨陷窝率显著升高 (P < 0.001)；治疗组干预后，观察到治疗组骨小梁、骨陷窝、骨髓和脂肪组织均有显著改善；空骨陷窝明显减少，骨小梁内可见核固缩的骨细胞，变薄但不弥散；特别是骨髓腔内有丰富的骨髓细胞和少量的脂肪细胞，空骨陷窝率明显降低 (P < 0.05)，结果见图2。

2.6 各组股骨头组织中骨保护素和RANKL的蛋白表达检测结果比较免疫组织化学染色和Western blot分析检测各组股骨头骨组织中相骨保护素和RANKL的蛋白表达，见图3。

模型对照组大鼠股骨头组织中RANKL阳性细胞较多，骨保护素阳性染色较少；然而，大鼠经内热针治疗后，这一趋势完全相反。Western blot分析结果显示，与空白组相比，模型对照组股骨头组织中骨保护素的蛋白表达明显降低(P < 0.05)，而股骨头组织中RANKL的蛋白表达明显升高(P < 0.001)；干预后，与模型对照组相比，内热针治疗组股骨头骨组织中骨保护素的蛋白表达明显升高 (P < 0.001)，而RANKL的蛋白表达明显降低(P < 0.05)，见图4。

2.7 各组实时荧光定量PCR检测结果比较与空白组相比，模型对照组的股骨头骨组织中骨保护素 mRNA表达明显降低(P < 0.001)，而RANKL mRNA表达明显升高(P < 0.001)；干预后，与模型对照组相比，治疗组股骨头骨组织中骨保护素mRNA表达明显升高(P < 0.05)，而RANKL mRNA表达明显降低(P < 0.05)，差异均有显著性意义，见图5。

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引言

激素性股骨头缺血性坏死(steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH)是激素药物长期使用引起的一种进行性疾病，减少股骨头中血液供应，引起骨髓和骨细胞等活性成分死亡，可导致股骨头内部结构紊乱及塌陷，髋关节功能障碍甚至残疾，其发病率呈逐年增加的趋势[1-2]。这种疾病的发生发展可能会严重降低患者的日常生活质量，给患者及其家庭在心理和经济上带来巨大的压力[3]。因此，探索有效的预防手段和治疗方法至关重要。
目前，SANFH的病因及发病机制仍不完全清楚[4]。破骨细胞在SANFH中维持正常骨组织代谢及骨重塑过程发挥重要的作用[5-6]。研究表明糖皮质激素直接结合破骨细胞上的作用位点，从而增加破骨细胞的活性并延长其存活时间，导致骨吸收破坏作用增强，使股骨头中出现骨代谢紊乱现象，导致骨重塑失衡，引起骨量减少以及骨稳态的破坏，长期累积下将导致的破坏是进行性及不可逆的，导致的最终结果是股骨头塌陷，诱发SANFH[7-8]。而有研究表明，骨保护素、核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)与破骨细胞的调控密切相关[9]，在骨的生长发育和重塑过程中发挥重要的调节作用[10]。
近年来，已有的动物实验发现温针灸和电针可有效地调控骨保护素、RANKL的表达，调控破骨细胞的功能及活性，抑制骨破坏，促进骨形成，维持骨稳态的作用[11-12]。内热针是一种将针刺疗法和热疗有机结合起来的新型治疗技术，是将特制针具刺入患者损伤的骨骼肌区，连接针具与内热式针灸治疗仪，温度调节在38-60 ℃，针尖到针体均能恒温发热，将针刺与热疗有机结合起来，具有减轻痉挛变性肌肉的张力和无菌性炎症等作用[13-14]，且较传统温针灸具有恒温加热、避免烫伤及烟雾、治疗范围广而深的特点[15]，对SANFH有很好的临床治疗效果[16]。
作者团队前期研究表明，在应用内热针疗法治疗兔膝骨性关节炎模型的实验中发现，内热针可上调骨保护素的表达，下调RANKL的表达，从而抑制骨吸收[17]。但内热针疗法在SANFH的相关基础实验研究未见报道，而与内热针疗法相近的温针灸疗法在股骨头坏死相关研究中证明在缓解疼痛、改善关节功能方面具有较好的疗效[18-19]。此次研究拟通过建立SD大鼠SANFH模型，观察内热针对SD大鼠SANFH组织中骨保护素、RANKL的蛋白及mRNA表达的影响，探讨内热针治疗SANFH的作用机制，为治疗SANFH的临床应用提供实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，在统计前先对实验数据进行正态性和方差齐性检验，若符合正态分布，多组间差异采用单因素方差分析；若不符合正态分布，进行组间两两比较，采用秩和检验。
1.2 时间及地点实验于2020年7月至2021年4月在宁夏医科大学科技楼实验平台完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物及分组选择30只健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄各半，体质量200-220 g，由宁夏医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(宁)2019-0001。动物实验方案通过宁夏医科大学总医院医学科研伦理审查委员会批准，批准号：2017104。SD大鼠饲养动物房维持温度23-25 ℃，湿度55%-60%，保证充足的水和饲料供应。适应性喂养1周后，经观察无异常，将SD大鼠采用随机数字表法分为空白组10只及造模组 20 只。采用甲基强的松龙与大肠杆菌内毒素联合诱导制备SANFH模型，造模成功后再随机分为模型对照组和治疗组，每组10只。动物实验中所有程序严格按照《实验动物福利伦理审查同意书》进行。
1.3.2 主要试剂与仪器骨组织RNA提取试剂TRIzol试剂(Takara Biotechnology，日本东京) ；注射用甲基强的松龙(比利时辉瑞公司，批号：Z06177)；大肠杆菌内毒素 (美国Sigma公司，批号：L-2630)；骨保护素、RANKL多克隆抗体 (美国Santa Cruz公司)；二抗山羊抗兔 (Abcam公司，美国 )；苏木素与伊红染色液(福州迈新公司)；PBS、2%戊巴比妥钠溶液、40 g/L 多聚甲醛液(银川市伟博鑫生物科技有限公司，中国)；内热针(直径为0.5 mm，针总长100 mm，针体长65 mm，针柄长35 mm，针柄直径2.2 mm)；内热针治疗仪(济宁佳科疗科技有限公司，批号：鲁械注准20172270321)；RM2235型石蜡切片机(Leica公司，德国)；BX51型显微镜(Olympus公司，日本)；凝胶成像系统(ABI，美国)；qPCR仪器(Bio-Rad公司，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验模型建立采用激素联合大肠杆菌内毒素的造模方法[20]，SD大鼠适应性喂养1周后开始造模。先以20 μg/kg剂量间隔24 h静脉注射大肠杆菌内毒素2次，在第2次注射大肠杆菌内毒素后再以40 mg/kg剂量间隔24 h肌肉注射甲基强的松龙3次；空白组SD大鼠同时间点注射5次等量生理盐水。造模4周后每组各麻醉处死2只，进行组织形态学结合影像学检查，并进行模型鉴定。激素性股骨头坏死判定标准：①形态学[21]：骨小梁内骨细胞缺失，骨陷窝排列紊乱、坏死区周围出现骨髓脂肪细胞体积增大、部分脂肪细胞融合成泡状物等形态异常；②影像学[22]：出现高密度的弧形硬化带，关节间隙变窄及边缘相对模糊。

1.4.2 内热针干预方法造模4周后对治疗组大鼠进行内热针干预。SD大鼠固定后，参照文献[23]进行内热针进针布点，髋关节囊进针点：分别在髋关节关节囊体表投影的扇形的“内弧”与“外弧”区域均匀间隔1 cm交错布点，共布2排。扇形的“内弧”：两端为大转子的前后缘中点(相当于转子间线、转子间嵴的中点)，最凸处为大转子尖；扇形的“外弧”：与“内弧”平行，经过髂后上棘与大转子间连线的中外1/3交点，前端在转子间线中点与髂前上棘连线上，后端在转子间嵴中点与骶管裂孔连线上。在“内弧”中点布1点；在“外弧”距中点0.5 cm各布1点；共计3点。进针后，针尖抵触骨膜后停止进针，针体连接内热针治疗仪后，设定温度为 42 ℃，20 min/次，1次/周。空白组和模型对照组SD大鼠不给予任何干预。连续干预4周后进行行为学评价并麻醉处死后取材。
1.4.3 观察一般状态连续4周观察SD大鼠的毛发、体质量、精神状态、进食情况等变化。
1.4.4 行为学评价 ①自主活动次数测定：分别在造模前、造模成功后次日和末次内热针干预后次日将大鼠放入自主活动仪中，让大鼠自主活动10 min适应后，由计算机自动分别记录3次每组大鼠3 min和5 min的自主活动次数；②抓力测试：分别在造模前、造模成功后次日和末次内热针干预后次日抓住大鼠尾巴根部，将大鼠放在抓力板上等其抓紧时加力后拉，测定最大抓力，共测3次，取其平均值。
1.4.5 取材根据大鼠体质量，按3 mL/kg腹腔注射2%的戊巴比妥钠进行麻醉。麻醉成功后，沿腹腔切开，暴露大鼠腹部，切断下肢，沿股骨分离软组织，打开关节囊。以大转子为切口，由外向内、由下向上分离股骨头周围韧带和组织，用咬骨钳在股骨颈切断股骨头，取出双侧股骨头并剔除周围附着组织。PBS清洗干净后，沿中心冠状面锯开，一侧放入40 g/L多聚甲醛液中固定3 d，10%EDTA 脱钙液脱钙1周后，分级乙醇脱水，石蜡包埋，切片5 μm，苏木精-伊红染色。将剩余的骨组织收集并置于-80 ℃冷冻冰箱中用于蛋白免疫印迹法等检测。
1.4.6 形态学观察取石蜡包埋块，切片5 μm，脱蜡后，常规苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察股骨头病理变化。并计算各组的空骨陷窝率：每张切片在×200倍镜下，随机选3个不重复区域，计数每个区域50个骨陷窝中的空骨陷窝数目，由此计算空骨陷窝率：空骨陷窝率=空骨陷窝数/ 50×100%。测定3个空骨陷窝率，取平均值。
1.4.7 免疫组织化学染色石蜡切片用二甲苯脱蜡，然后连续切片至5 μm厚，在甲醇中加入0.01%H2O2，灭活内源过氧化物酶活性30 min。用PBS冲洗5 min后，用50 μL体积分数10%的小牛血清在室温下封闭30 min；干燥后，加入Ⅰ抗(1∶200稀释骨保护素和RANKL)，4 ℃过夜。第2天，在室温下加入山羊抗兔二抗(稀释1∶500) 孵育30 min，载玻片用PBS再次冲洗5 min，并与二氨基联苯胺孵育10 min。DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封固。显微镜下观察染黄色或棕黄色为阳性，用Image-Pro Plus 6.0软件定量测定5个随机视野中骨保护素和RANKL蛋白的阳性染色面积，采用积分吸光度(IOD)值对骨保护素和RANKL蛋白进行定量分析。
1.4.8 蛋白免疫印迹(Western blot)法检测取-80 ℃保存的冻存的骨组织，通过研磨及离心处理后用全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取4 μL的蛋白样本加入1 μL 5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液振荡混匀，100 ℃变性5 min，样品于-20 ℃保存备用。SDS-PAG凝胶电泳，小心剥胶选用 PVDF膜进行转膜，用5%脱脂牛奶封闭 1 h，分别加入骨保护素、RANKL和GAPDH的一抗，4 ℃孵育过夜后等渗缓冲盐溶液(TBST)清洗，再加入二抗孵育 1 h，TBST清洗，化学发光试剂ECL暗室内压片、曝光、显影、定影，凝胶成像仪采图。借助 Quantity One 软件分析，再用Image pro plus 6.0软件分析相对灰度值。
1.4.9 实时荧光定量PCR 检测取-80 ℃保存的组织块用微动力磨钻清除软骨组织后液氮下研磨，使用Trizol LS试剂(Takara Biotechnology，日本东京)从股骨头组织中提取总RNA，并使用反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Master Mix(Takara Biotechnology，日本东京)进行反转录合成cDNA并保存在 -20 ℃，GAPDH被选为内参对照物，引物序列见表1。

反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25个循环。根据各组Ct值计算2-ΔΔCt 值。
1.5 主要观察指标 ①各组大鼠的行为学检测；②苏木精-伊红染色观察各组大鼠股骨头骨组织病理学变化；③免疫组织化学染色及Western blot 检测骨保护素、RANKL的蛋白表达；④实时荧光定量PCR检测骨保护素、RANKL的 mRNA 表达。
1.6 统计学分析数据资料采用 SPSS 26.0 软件进行分析，计量资料用x±s表示。在统计前先对实验数据进行正态性和方差齐性检验，若符合正态分布，多组间的差异采用单因素方差分析；若不符合正态分布，进行组间两两比较，采用秩和检验。以 P < 0.05 为差异有显著性意义，P < 0.001 为差异有非常显著性意义。

讨论

股骨头坏死是一种常见的难治性骨病，分为创伤性和非创伤性，长期大剂量使用糖皮质激素导致的SANFH是非创伤性股骨头坏死最常见的类型，约占50%[2，5]。SANFH的主要临床表现为臀部和髋部疼痛、髋关节活动受限、下肢无力、精神萎靡不振等，极大地影响患者的生活质量[24-25]。SANFH的具体发病机制复杂，至今仍不完全清楚，因此，目前尚无有效和安全的早期治疗股骨头坏死的策略[26]。SANFH的治疗方法多种多样，但大多数治疗方法的临床效果并不理想，同时带给患者极大的痛苦，也给该领域的治疗发展带来了巨大的挑战[27]。内热针疗法作为一种新的非药物疗法，是软组织外科学创始人宣蛰人教授以软组织外科学无菌性炎症致痛学说为理论依据、通过临床实践总结出的一种最新软组织疼痛治疗方法[28]。利用针刺效应和热效应松解病变肌筋膜的激痛点[29]，解除肌肉组织痉挛，促进局部组织的减压及减张[30]，改善局部供血，消除无菌性炎症[31]，调节生物力学平衡，促进能量释放和能量补充[32]。在治疗SANFH的临床研究中可显著改善目测类比疼痛评分及髋关节Harris评分，同时可有效改善功能障碍，并缓解疼痛症状，提高生活质量[16，33]。
因此基于SANFH的临床症状，此次研究选用自由活动次数、抓力和一般观察状态等行为学指标进行内热针干预疗效的评价，结果表明经过甲基强的松龙联合大肠杆菌内毒素造模后，模型对照组SD大鼠出现烦躁、易激惹、毛发泛黄无光泽、活动次数明显减少等表现，说明SD大鼠出现了SANFH的行为学改变；经内热针干预后上述症状明显改善，表明内热针起到了干预调节的作用。自主活动次数及抓力主要反映SD大鼠的探究能力及四肢的力量[34]，此次研究结果显示，与空白组相比，模型对照组SD大鼠自主活动次明显减少，抓力明显减小；与模型对照组相比，经内热针干预后，治疗组SD大鼠自主活动次数明显增加，抓力明显增大，因此提示从行为学角度表明SANFH模型制备成功，同时说明内热针可以改善SANFH大鼠的行为学改变。
在此次研究中，通过采用甲基强的松龙联合大肠杆菌内毒素建立SD大鼠SANFH动物模型，组织学苏木精-伊红染色及影像学X射线片检查显示SD大鼠股骨头高度骨坏死，表明造模成功。造模成功后，观察内热针对SANFH的治疗作用。随后，收集股骨头组织进行组织学分析，比较模型对照组和治疗组之间的差异。结果表明模型对照组SD大鼠股骨头组织骨小梁减少、骨陷窝排列紊乱、骨髓脂肪细胞体积增大、部分脂肪细胞融合成泡状物等形态异常，空骨陷窝率显著升高；与模型对照组相比，治疗组可明显改善上述病理改变，空骨陷窝率显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，提示内热针疗法对大鼠SANFH有明确的治疗效果。
范思奇等[5]研究发现破骨细胞活性及功能在SANFH的骨代谢平衡中发挥重要的作用。骨组织代谢活动贯穿整个生命过程，不断受到骨重塑的影响，骨的吸收和形成在这些过程之间以“耦合”的动态平衡机制不断重复[35]。破骨细胞是吸收骨的细胞，而成骨细胞是骨形成的细胞，破骨细胞吸收的骨体积严格控制在正常情况下与成骨细胞形成的骨体积相等，骨形成和骨吸收之间的平衡对骨稳态至关重要[36]。研究表明大量的糖皮质激素应用极大程度上影响了骨代谢过程，使破骨细胞活性增强，导致骨吸收和骨形成过程失衡，骨的质量和基质就会出现异常[37]。而骨保护素、RANKL能够调控破骨细胞的活性及功能，调节破骨细胞/成骨细胞之间的动态平衡，从而维持骨稳态，防止骨丢失，确保正常的骨转换，在骨重塑过程中起重要作用[38-39]。骨保护素、RANKL作为肿瘤坏死因子的家族成员，可以调节破骨细胞和骨吸收过程，骨保护素是RANKL的可溶性诱饵受体，与RANK竞争性结合，可抑制RANKL与RANK的结合，从而抑制破骨细胞的形成和活性，促进骨形成，从而使骨代谢趋于正平衡，达到治疗疾病的目的[40]。
在此次研究中，分别采用免疫组织化学染色、Western blot方法和实时荧光定量PCR检测骨保护素和RANKL蛋白及mRNA的表达，结果表明，与空白对照组相比，模型对照组大鼠股骨头组织中的RANKL的蛋白及mRNA表达水平明显升高，骨保护素的蛋白及mRNA表达水平明显降低，差异均有显著性意义(P < 0.01)；内热针干预后，与模型对照组相比，内热针治疗组大鼠股骨头组织中的RANKL的蛋白及mRNA表达水平明显降低，骨保护素的蛋白及mRNA表达水平明显升高，差异均有显著性意义(P < 0.05)，与其他学者的研究结果相一致[41-42]，这表明内热针疗法能抑制SANFH股骨头组织中RANKL的表达，提高骨保护素的表达。
综上所述，内热针疗法通过上调骨保护素的表达，下调RANKL的表达，抑制破骨细胞的功能及活性，从而抑制骨吸收，促进新骨的形成及骨组织修复。此次实验为内热针治疗SANFH的临床应用提供了实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

内热针干预激素性股骨头缺血性坏死模型大鼠抑制破骨及促进新骨形成

Internal heat-type acupuncture inhibits osteoblast viability and promotes bone formation in a rat model of steroid-induced avascular necrosis of the femoral head

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