依那普利减轻肢体缺血-再灌注模型大鼠心肌损伤的作用机制

doi:10.12307/2022.361

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (11): 1747-1751.doi: 10.12307/2022.361

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依那普利减轻肢体缺血-再灌注模型大鼠心肌损伤的作用机制

邢宏昶1，曹建平1，朱静1，姚鲲2

1沈阳医学院附属中心医院麻醉科，辽宁省沈阳市 110024 ；2中国医科大学附属盛京医院血液科，辽宁省沈阳市 110021

收稿日期:2020-11-19 修回日期:2020-11-21 接受日期:2021-01-07 出版日期:2022-04-18 发布日期:2021-12-11
通讯作者: 姚鲲，博士，副主任医师，中国医科大学附属盛京医院血液科，辽宁省沈阳市 110021
作者简介:邢宏昶，男，1975年生，辽宁省营口市人，汉族，硕士，主任医师，主要从事围术期器官保护研究。
基金资助:
辽宁省自然科学基金项目(2019-ZD-0325)，项目负责人：邢宏昶；沈阳医学院科学基金项目(20181029)，项目负责人：邢宏昶

Mechanism by which enalapril alleviates myocardial injury in a rat model of limb ischemia-reperfusion

Xing Hongchang1, Cao Jianping1, Zhu Jing1, Yao Kun2

1Department of Anesthesiology, Central Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang 110024, Liaoning Province, China; 2Department of Hematology, Shengjing Hospital Affiliated to China Medical University, Shenyang 110021, Liaoning Province, China

Received:2020-11-19 Revised:2020-11-21 Accepted:2021-01-07 Online:2022-04-18 Published:2021-12-11
Contact: Yao Kun, MD, Associate chief physician, Department of Hematology, Shengjing Hospital Affiliated to China Medical University, Shenyang 110021, Liaoning Province, China
About author:Xing Hongchang, Master, Chief physician, Department of Anesthesiology, Central Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang 110024, Liaoning Province, China
Supported by:
Liaoning Provincial Natural Science Foundation Project, No. 2019-ZD-0325 (to XHC); Science Foundation Project of Shenyang Medical College, No. 20181029 (to XHC)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
肢体缺血再灌注损伤：是指组织器官缺血一段时间后，重新恢复血流灌注时组织器官的损伤程度不但没有减轻反而较缺血时不断加重，机体功能进一步恶化的综合征，是一种临床上常见的、多发生于严重创伤后的复杂病理过程。肢体缺血再灌注损伤的病理机制至今仍未完全阐明，目前医学界多认为其与脂质过氧化及氧自由基损伤、钙离子代谢紊乱、细胞凋亡、炎症反应损害等有关。
细胞信号传导通路：人体细胞之间的信息转导可通过相邻细胞的直接接触来实现，但更重要也是更为普遍的则是通过细胞分泌各种化学物质来调节自身和其他细胞的代谢和功能，因此在人体中，信息传导通路通常是由分泌释放信息物质的特定细胞、信息物质(包含细胞间与细胞内的信息物质和运载体、运输路径等)以及靶细胞(包含特异受体等)等构成。

背景：有研究证实依那普利可以减轻肢体缺血再灌注导致的心肌损伤，但对其作用机制的研究还没有报道。
目的：探讨依那普利减轻大鼠肢体缺血-再灌注心肌损伤的作用机制。
方法：健康成年雄性SD大鼠48只随机分为对照组、模型组、依那普利组和抑制剂组。除对照组外，其余各组采用橡皮带环绕结扎大鼠双后肢根部3 h、再灌注3 h制备肢体缺血再灌注模型；抑制剂组再灌注前30 min时静脉注射PI3K抑制剂LY294002 0.3 mg/kg，依那普利组和抑制剂组再灌注即刻开始静脉输注依那普利13 μg/(kg•h)至再灌注结束；其余两组再灌注即刻开始给予等量生理盐水溶液。再灌注3 h时麻醉下处死大鼠，取心肌组织，检测心肌组织病理学改变、心肌组织细胞凋亡指数及凋亡基因表达、细胞传导通路蛋白表达。实验方案由沈阳医学院实验动物伦理委员会于2019年10月批准，批准号：研伦审第(2019)85号。
结果与结论：①光镜下与模型组比较，依那普利组心肌组织病理学损伤减轻；与依那普利组比较，抑制剂组心肌组织病理学损伤加重；②与模型组比较，依那普利组心肌组织细胞凋亡指数降低，Bax蛋白表达下调，PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表达上调(P < 0.05)；③与依那普利组比较，抑制剂组心肌组织细胞凋亡指数升高，Bax蛋白表达上调，PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表达下调(P < 0.05)；④结果说明，依那普利可通过激活PI3K/Akt信号通路，抑制细胞凋亡，减轻大鼠肢体缺血-再灌注心肌损伤。
缩略语：磷脂酰肌醇3-激酶：phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K；蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶：protein-serine-threonine kinase，Akt

https://orcid.org/0000-0001-7830-0511 (邢宏昶)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 依那普利, 再灌注损伤, 心肌, 1-磷脂酰肌醇3-激酶, 蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶, 细胞凋亡, 炎症, 氧化应激

Abstract: BACKGROUND: Studies have confirmed that enalapril can alleviate myocardial injury caused by limb ischemia-reperfusion, but the mechanism of its action has not been reported.
OBJECTIVE: To investigate the effect mechanism of enalapril reduction of myocardial injury by ischemia-reperfusion in the rat limb.
METHODS: Forty-eight healthy adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group, model group, enalapril group and inhibitor group. Except for the normal control group, rats were bundled around the ligation of the posterior limbs with a rubber band for 3 hours, followed by 3-hour reperfusion to establish the model of limb ischemia-reperfusion. Intravenous injection of 0.3 mg/kg LY294002 was given in the inhibitor group 30 minutes before reperfusion. Enalapril group and inhibitor group were given intravenous infusion of enalapril 13 μg/kg/h immediately after reperfusion until the end of reperfusion. An equal amount of normal saline solution was given in the other two groups immediately after reperfusion. After 3 hours of reperfusion, the rats were killed and the myocardial tissue was taken. Myocardial histopathological changes, apoptotic index, apoptosis gene expression and cell conduction pathway protein expression were detected. The study was approved by the Laboratory Animal Ethical Committee of Shenyang Medical College in October 2019 with an approval No. (2019)85.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, myocardial histopathological injury was reduced in the enalapril group. Compared with the enalapril group, myocardial histopathological injury was aggravated in the inhibitor group. Compared with the model group, myocardial apoptosis index (AI) was decreased, Bax expression was downregulated, PI3K, p-Akt and Bcl-2 expression was up-regulated in the enalapril group (P < 0.05). Compared with the enalapril group, myocardial apoptosis index was increased, Bax expression was up-regulated, PI3K, p-Akt and Bcl-2 expression was downregulated in the inhibitor group (P < 0.05). The mechanism by which enalapril reduces limb ischemia-reperfusion caused myocardial injury is related to activating PI3K/Akt signaling pathway and inhibiting cell apoptosis in rats.

Key words: enalapril, reperfusion injury, myocardium, 1-phosphatidylinositol 3-kinase, protein-serine-threonine kinases, cell apoptosis, inflammation, oxidative stress

中图分类号:

邢宏昶, 曹建平, 朱静, 姚鲲. 依那普利减轻肢体缺血-再灌注模型大鼠心肌损伤的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1747-1751.

Xing Hongchang, Cao Jianping, Zhu Jing, Yao Kun. Mechanism by which enalapril alleviates myocardial injury in a rat model of limb ischemia-reperfusion[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(11): 1747-1751.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 48只大鼠随机分为对照组、模型组、依那普利组，抑制剂组，各12只。实验过程中没有动物死亡，全部进入结果分析。
2.2 肢体缺血再灌注对大鼠心肌组织病理的影响光镜下模型组心肌心尖、左心室、右心室各部位心肌组织细胞肿胀，细胞核减少，可见坏死纤维断裂，纤维间隙增宽，大量炎性细胞浸润，损伤程度接近，见图1。

2.3 依那普利对肢体缺血再灌注大鼠心肌组织病理的影响光镜下对照组心尖部心肌纤维排列整齐，细胞核均匀一致，纹理较清楚；模型组心尖部心肌细胞肿胀，细胞核减少，可见坏死纤维断裂，纤维间隙增宽，大量炎性细胞浸润；依那普利组心尖部心肌纤维排列较整齐，间隙减小，细胞轻度肿胀，病理学损伤较模型组明显减轻；抑制剂组心尖部心肌细胞中度肿胀，心肌纤维排列不整齐，间隙增宽，炎性细胞浸润，病理学损伤较依那普利组加重，见图2。

2.4 依那普利对肢体缺血再灌注大鼠心肌组织细胞凋亡的影响光镜下对照组大鼠心尖部心肌细胞核基本正常；模型组大鼠心尖部心肌细胞核黄染的凋亡细胞明显增加；依那普利组大鼠心尖部心肌细胞核黄染的凋亡细胞较模型组明显减少；抑制剂组大鼠心尖部心肌细胞核黄染的凋亡细胞较依那普利组增加，见图3。

2.5 依那普利对肢体缺血再灌注大鼠心肌组织细胞凋亡基因蛋白表达的影响与对照组比较，其他3组心肌组织细胞凋亡指数值明显升高，Bax表达明显上调，Bcl-2表达明显下调 (P < 0.05)；与模型组比较，依那普利组心肌组织细胞凋亡指数值明显下降，Bax表达明显下调，Bcl-2表达明显上调(P < 0.05)；与依那普利组比较，抑制剂组心肌组织细胞凋亡指数值明显升高，Bax表达明显上调，Bcl-2表达明显下调(P < 0.05)，见表1。

2.6 依那普利对肢体缺血再灌注大鼠心肌组织细胞通路蛋白表达的影响与对照组比较，模型组及抑制剂组心肌组织PI3K、P-Akt蛋白表达明显下调(P < 0.05)；与模型组比较，依那普利组心肌组织PI3K、P-Akt蛋白表达明显上调(P < 0.05)；与依那普利组比较，抑制剂组心肌组织PI3K、P-Akt蛋白表达明显下调(P < 0.05)，见图4。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点于2019年9-12月在沈阳医学院附属中心医院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康成年雄性SD大鼠48只，体质量200-250 g，适应性喂养1周，12 h白天，12 h黑夜，温度(25±1) ℃，湿度45%-55%，自由进食水，由沈阳医学院动物实验室提供。
1.3.2 药品与试剂依那普利(Enalapril，批号：E129304)、LY294002 (批号：L124970)(均为阿拉丁公司)；全蛋白提取试剂盒(WLA019)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(WLA004)、SDS-PAGE 凝胶快速制备试剂盒(WLA013)、羊抗兔IgG-HRP(WLA023)、ECL发光液(WLA003)、Tunel检测试剂盒(WL029a)、Bcl-2(WL01556)、Bax(WL01637)、苏木精-伊红染色试剂盒(WLA051a)(均为wanleibio，中国)；一抗(PI3K，Akt，p-Akt，Cell SignalingTechnology)；Triton X-100(ST795，Beyotime，中国)；DAB显色液(DA1010)、苏木精(H8070)、山羊血清(SL038)(均为Solarbio中国)；HRP标记山羊抗兔IgG(#31460，thermoFisher，美国)。
1.3.3 仪器与设备 VMS-LDF1型激光多普勒血流仪(Moor公司，英国)；水平摇床(WD-9405B)、双垂直蛋白电泳仪(DYCZ-24DN)、凝胶成像系统(WD-9413B型)(均为北京六一)；酶标仪(ELX-800，BIOTEK 美国)；超速冷冻离心机(H-2050R，长沙，湖南湘仪)；电热恒温鼓风干燥箱(QH01-9030A，精宏实验设备，上海)；电热恒温培养箱(DH36001B，天津泰斯特，天津)；显微镜拍照系统(DP73，OLUMPUS，日本)；超纯水系统(NW10LVF Heal Force，中国)；石蜡切片机(RM2235，Leica，德国)。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组、给药方法取健康成年雄性SD大鼠48只，采用随机数字表法随机分为4组，对照组、模型组、依那普利组和抑制剂组，每组12只。模型组、依那普利组和抑制剂组建立大鼠肢体缺血再灌注模型；抑制剂组再灌注前30 min时静脉注射PI3K抑制剂LY294002 0.3 mg/kg，依那普利组和抑制剂组再灌注即刻开始静脉输注依那普利 13 μg/(kg•h)至再灌注结束，其余两组再灌注即刻开始静脉输等量生理盐水溶液。

1.4.2 模型制备用弹力橡皮带环绕结扎大鼠双后肢根部3 h、再灌注3 h，采用激光多普勒血流仪监测血流被阻断，建立肢体缺血再灌注模型；对照组给予大鼠双后肢松绕橡皮带，模拟捆扎。

1.4.3 取材实验结束麻醉下处死大鼠，开胸取心肌组织，模型组分别取心尖、左心室、右心室部位组织，其他组取心尖部位组织，用40 g/L多聚甲醛固定，各组剩余心肌组织用液氮冻存转移至-70 ℃超低温冰箱保存。
1.4.4 病理切片取固定心肌组织，石蜡包埋切片，切片脱蜡至水，苏木精-伊红染色，脱水、透明、封固，200倍光镜下观察心肌组织病理学结果。
1.4.5 细胞通路蛋白表达的测定 Western blot法检测PI3K、Akt和磷酸化Akt(P-Akt)的蛋白表达，将液氮中保存的心肌组织切成小块后，蛋白裂解，低温冷冻离心，分离的上清液依次进行蛋白质定量、SDS-PAGE、转印、封闭后，孵育一抗加入PI3K(1∶500)、Akt(1∶500)，p-Akt(1∶500)，β-actin (1∶1 000) 单克隆抗体，4 ℃ 孵育，摇床过夜。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗羊抗兔IgG-HRP，37 ℃孵育 45 min，ECL底物发光，暗室内曝光。将胶片进行扫描，用凝胶图象处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)分析目标条带的灰度值。以灰度值的比值反映其表达水平。
1.4.6 心肌凋亡细胞的检测采用TUNEL法检测心肌凋亡细胞。取固定的心肌组织，常规石蜡包埋、切片，脱蜡水化，组织透化，过氧化氢封闭，酶标记，POD标记，DAB显色、复染、封固，高倍镜下进行观察，细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞。随机取3张切片，每张切片于缺血区随机选取5个高倍视野(×400)，计算凋亡细胞数占总细胞数的百分比，取平均值即为细胞凋亡指数(AI)。
1.4.7 凋亡基因蛋白表达的测定采用免疫组化法测定凋亡基因(Bcl-2、Bax)蛋白的表达。取固定的心肌组织，石蜡包埋、切片，抗原修复，体积分数3%过氧化氢孵育，山羊血清封闭，一抗孵育，兔抗鼠Bcl-2、Bax抗体，PBS 1∶100稀释，湿盒内4 ℃过夜，PBS浸泡5 min，重复3次。HRP标记二抗孵育，山羊抗兔抗体，PBS 1∶500稀释，湿盒内37 ℃孵育60 min，PBS浸泡5 min，重复3次。DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封固，镜下观察。细胞核膜、胞质出现棕黄色颗粒为阳性表达。取3张连续切片，每张切片随机选择5个高倍视野(×400)，用Image-Pro Plus 图像分析软件计算吸光度值，取其平均值反映Bcl-2和Bax的表达。
1.5 主要观察指标 ①心肌组织病理学改变；②心肌组织细胞凋亡指数及Bax、Bcl-2蛋白表达；③心肌组织PI3K、Akt及P-Akt蛋白的表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，正态分布的计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析， P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

此次研究参照文献[6]采用橡皮带环绕结扎大鼠双后肢3 h、再灌注3 h的方法建立大鼠肢体缺血再灌注损伤模型，病理结果表明，模型组心尖部、左心室、右心室心肌组织均细胞肿胀，细胞核减少，可见坏死纤维断裂，纤维间隙增宽，大量炎性细胞浸润，提示大鼠心肌各部均受到损伤且损伤程度接近，大鼠肢体缺血再灌注损伤模型制备成功。
肢体缺血再灌注致远隔组织、器官损伤的机制十分复杂，目前医学界多认为其与脂质过氧化及氧自由基损伤、细胞凋亡、炎症反应损害等有关[7-9]。临床和实验研究发现，肢体缺血再灌注损伤不仅存在于缺血组织，尚可造成远隔器官即非缺血受累区域组织器官功能的损伤[10]，这些功能异常相互联动，甚至引起全身炎症反应综合征的发生，导致多器官的功能衰竭[11]，影响患者预后恢复甚至危及生命，因此有必要对肢体缺血再灌注损伤的基础与临床进行研究。目前研究发现肢体缺血再灌注导致心肌损伤主要涉及以下几方面：①氧自由基介导性心肌损伤[12-14]；②中性粒细胞介导性心肌损伤，中性粒细胞激活是中性粒细胞介导再灌注损伤的关键步骤[15]；③继发性低灌注、低血压和再灌注损伤；④可能与自由基和前列腺素Ⅱ等激活肥大细胞引起组织损伤有关；⑤细胞凋亡，在缺血再灌注损伤中细胞的死亡形式除了坏死外，凋亡也起着很大的作用[16]。
心肌损伤主要表现在以下方面：①对蛋白质的损伤：丙二醛可使蛋白质发生交联聚合、蛋白质变性及其他不可逆的损害[17]；②对核酸和DNA的损伤：OH•可从DNA 的核糖中提氢，使DNA 的核糖成为自由基，引起蛋白质合成障碍[17]；③对线粒体的损伤[18]；④对生物膜的损伤[19]。
依那普利为2代血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)，为转换酶抑制剂前体药，不含巯基[20]。口服依那普利后约 1 h达血药浓度峰值，与剂量呈线性关系。近年研究发现血管紧张素转换酶抑制剂兼具氧自由基的清除作用，保护损伤的心肌；又可强化内皮源舒张因子(EDRF)的作用，促使血管扩张[21]。血管紧张素转换酶抑制剂可抑制血小板的聚集，对由肾上腺素、二磷酸腺苷(ADP)、胶原等诱导的血小板聚集和血栓烷(TXA)的释放均可抑制，这也是血管紧张素转换酶抑制剂可保护心脏另一作用[22]。现有研究证实，依那普利后处理可减轻肢体缺血再灌注诱发心肌损伤[23]，但其机制尚未阐明。
PI3K/Akt信号通路是细胞内重要信号通路之一，通过影响下游多种效应分子的活化状态，在细胞内发挥着抗凋亡、促细胞生存等功能，既有抗凋亡作用又有促凋亡作用，以抗细胞凋亡为主[24]。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，可被受体酪氨酸激酶或G2蛋白耦联受体激活，其产物PIP2和PIP3都是细胞内重要的第二信使，作用于PI3K/Akt通路，在细胞的增殖、凋亡、代谢等过程中起重要的作用。丝氨酸/苏氨酸激酶Akt，又称为蛋白激酶PKB，它是PI3K信号转导通路中一个重要的下游靶点[25]。当细胞受到细胞外信号的刺激后，PI3K 活化产生的PIP3与AktN端的pH结构域结合，使Akt向质膜转位而激活，后者催化其自身的Serl24和Thr450磷酸化，同时使PIP3依赖激酶PDK1、PDK2 分别催化Akt的Thr308和Ser473磷酸化，进一步激活Akt，从而引起级联反应[26]。研究证实Akt的活化与许多人类疾病如癌症、白血病、糖尿病、精神分裂等密切相关[27]。
PI3K/Akt通路参与调节机体细胞活化、凋亡、炎症反应和趋化等多种病理生理学过程[28-29]。LY294002可特异地阻断PI3K/Akt细胞通路的磷酸化过程，进而抑制该通路的激活[30-31]。此次结果显示，与模型组比较，依那普利组心肌组织PI3K、p-Akt蛋白表达有统计学意义(P < 0.05)；与依那普利组比较，抑制剂组心肌组织PI3K、p-Akt蛋白表达有统计学意义(P < 0.05)，提示依那普利通过激活PI3K/Akt信号通路，发挥抗凋亡作用，促进细胞生存，减轻大鼠肢体缺血再灌注心肌损伤。
随着对细胞凋亡研究不断深入，发现bcl-2家族是在细胞凋亡中有重要作用的一类蛋白质[32]。Bcl-2家族的表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一，在细胞凋亡信号转导途径中发挥重要作用[33]。Bcl-2和bax分别是bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促进凋亡基因，并且bax是bcl-2活性的主要调控因子[34]。Bcl-2和bax在肿瘤细胞凋亡中具有重要的调控作用。Bax是Bcl-2家族中研究最广泛的促凋亡蛋白[35]。Bax定位于细胞浆，自身可形成同源二聚体或与Bcl-2形成异源二聚体。许多细胞凋亡中有bax表达升高[36]。转染bax不仅能诱导许多细胞自发凋亡，而且促进多种因素诱导的多种细胞凋亡。此次研究结果显示，与模型组比较，依那普利组心肌组织细胞凋亡指数值、Bax和Bcl-2蛋白表达有统计学意义(P < 0.05)；与依那普利组比较，抑制剂组心肌组织细胞凋亡指数值、Bax和Bcl-2蛋白表达有统计学意义(P < 0.05)，提示依那普利减轻大鼠肢体缺血再灌注心肌损伤的机制与抑制细胞凋亡有关。
综上所述，依那普利可通过激活PI3K/Akt信号通路，抑制细胞凋亡，减轻大鼠肢体缺血-再灌注心肌损伤。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

依那普利减轻肢体缺血-再灌注模型大鼠心肌损伤的作用机制

Mechanism by which enalapril alleviates myocardial injury in a rat model of limb ischemia-reperfusion

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