顺轴疲劳运动对兔髌股关节软骨损伤的影响

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (在线): 1-6.

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顺轴疲劳运动对兔髌股关节软骨损伤的影响

谭新访1，郭艳幸2，秦晓飞2，张斌清2，赵东亮2，潘琨琨2，李瑜卓2，陈皓宇2

1河南中医药大学，河南省郑州市 450000；2河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)，河南省洛阳市 471000

收稿日期:2021-06-04 修回日期:2021-06-08 接受日期:2021-07-22 出版日期:2022-01-08 发布日期:2021-11-13
通讯作者: 郭艳幸，主任医师，硕士生导师，博士生导师，河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)，河南省洛阳市 471000
作者简介:谭新访，女，1996年生，河南省舞钢市人，汉族，河南中医药大学在读硕士，主要从事骨与关节损伤方面的研究
基金资助:
全国中医学术流派传承工作室建设项目(国中医药人教函[2016]227 号)，项目负责人：郭艳幸；2019 年河南省科技攻关项目(192102310433)，项目负责人：郭艳幸

Effect of uniaxial fatigue exercise on patellofemoral cartilage injury in a rabbit

Tan Xinfang1, Guo Yanxing2, Qin Xiaofei2, Zhang Binqing2, Zhao Dongliang2, Pan Kunkun2, Li Yuzhuo2, Chen Haoyu2

1Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China; 2Luoyang Orthopedic-Traumatological Hospital of Henan Province (Henan Provincial Orthopedic Hospital), Luoyang 471000, Henan Province, China

Received:2021-06-04 Revised:2021-06-08 Accepted:2021-07-22 Online:2022-01-08 Published:2021-11-13
Contact: Guo Yanxing, Chief physician, Master’s supervisor, Doctoral supervisor, Luoyang Orthopedic-Traumatological Hospital of Henan Province (Henan Provincial Orthopedic Hospital), Luoyang 471000, Henan Province, China
About author:Tan Xinfang, Master candidate, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
Supported by:
the National Traditional Chinese Medicine Academic Schools Inheritance Studio Construction Project, No. [2016]227 (to GYX); the Science and Technology Project of Henan Province in 2019, No. 192102310433 (to GYX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

顺轴疲劳运动：疲劳运动是多数骨关节病的发病机制或者诱发原因，顺轴疲劳运动即顺应关节自然活动轴线，不进行偏角设置的疲劳运动，更符合关节运动的现实情况以及发病机制。
髌股关节：是膝关节的主要构成部分之一，由髌骨与股骨滑车组成，周围包覆韧带与滑膜组织，髌骨下有丰富的髌下脂肪垫。髌股关节在膝关节屈曲伸展过程中活动明显。髌股关节软骨损伤常会出现髌股关节综合征，屈膝30°-60°时髌骨作用于股骨的压力最大，所以在上下楼梯以及膝关节大幅度屈曲伸展等动作时疼痛明显。

背景：以髌股关节软骨损伤为主要特征的疾病临床发病率高，但目前的研究对其病因认识不足。过度活动是临床广泛认可的病理机制之一，对认识髌股关节损伤的发生与发展有重要的意义。
目的：观察顺轴疲劳运动对髌股关节软骨的影响，探究疲劳运动对兔髌股关节软骨造成的损害，为了解过度活动对髌股关节软骨病变的影响提供实验依据。
方法：将8只新西兰大耳白兔适应性饲养1周后，选取右后膝为实验侧，将右后膝固定于造模机上进行顺轴疲劳运动，活动角度设置为 0°-95°，活动频率为60次/min，每天活动90 min，持续2周；左后膝不做处理。造模结束后采集动物膝关节MRI图像，之后麻醉处死动物并取材，对髌股关节进行软骨组织切片观察以及软骨Mankin评分。

结果与结论：①实验侧髌骨软骨出现明显的损害；②顺轴疲劳运动2周后，实验侧髌骨软骨颜色晦暗、可见裂隙存在，髌骨软骨面粗糙，髌骨-股骨接触面边缘增生；对照侧没有发现明显的软骨退变；③膝关节MRI结果显示，实验侧髌骨软骨信号不均匀；④苏木精-伊红染色后，光镜下观察实验侧软骨表面不光滑，可见软骨细胞增殖，排列紊乱，多条潮线；实验侧Mankin评分明显高于对照侧，差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤提示持续2周的顺轴疲劳运动可以造成兔髌股关节软骨轻度病损，出现软骨肿胀、裂隙等病理改变。

https://orcid.org/0000-0002-7819-2343 (谭新访) ；https://orcid.org/0000-0003-1085-8046 (郭艳幸)

关键词: 髌股关节, 软骨, 髌骨软化症, 顺轴疲劳运动, 动物模型, 病理

Abstract:

BACKGROUND: There is a high incidence of patellofemoral cartilage injury in clinical practice. However, the current research on its etiology is insufficient. Hyperactivity is one of the pathological mechanisms widely recognized in clinic, and understanding the occurrence and development of patellofemoral injury is of great significance.
OBJECTIVE: To study the effect of uniaxial fatigue exercise on the patellofemoral articular cartilage, and to explore patellofemoral cartilage injuries caused by fatigue in rabbits, so as to provide an experimental basis for understanding the effect of hyperactivity on patellofemoral cartilage lesions.
METHODS: Eight New Zealand white rabbits were adaptively fed for 1 week. The right knee of each rabbit was selected as the experimental side and the left knee as the control side. The right knee was fixed on a modeling machine for uniaxial fatigue exercise, and the activity angle was set to be 0°-95° and the activity frequency was set at 60 beats per minute, 90 minutes a day, for 2 weeks. The left knee of each rabbit was untreated. After modeling, MRI images of the rabbit knee joints were collected. The animals were then sacrificed and sampled, and the cartilage tissue sections of the patellofemoral joint were observed and assessed by the Mankin score.
RESULTS AND CONCLUSION: The patellar cartilage of the experimental side was significantly damaged. After 2 weeks of uniaxial fatigue exercise, the patellar cartilage of the experimental side had dull color, visible fissures, rough surface, and hyperplasia at the edge of the patellofemoral interface, while no obvious cartilage degeneration was observed on the control side. The results of knee MRI showed that the signal intensity of the patellar cartilage on the experimental side was heterogeneous. Hematoxylin-eosin staining results revealed that the cartilage surface of the experimental side was not smooth, and chondrocyte proliferation, disarrangement, and multiple tidal lines were observed under a light microscope. The Mankin score of the experimental side was significantly higher than that of the control side (P < 0.05). These findings indicate that 2-week uniaxial fatigue exercise can cause mild damage to the cartilage of the patellofemoral joint in rabbits, accompanied by pathological changes such as cartilage swelling and fissures.

Key words: patellofemoral joint, cartilage, chondromalacia patellae, uniaxial fatigue exercise, animal model, pathology

中图分类号:

谭新访, 郭艳幸, 秦晓飞, 张斌清, 赵东亮, 潘琨琨, 李瑜卓, 陈皓宇. 顺轴疲劳运动对兔髌股关节软骨损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(在线): 1-6.

Tan Xinfang, Guo Yanxing, Qin Xiaofei, Zhang Binqing, Zhao Dongliang, Pan Kunkun, Li Yuzhuo, Chen Haoyu. Effect of uniaxial fatigue exercise on patellofemoral cartilage injury in a rabbit[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(在线): 1-6.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析纳入实验动物8只，左侧后肢为对照组，右侧后肢为实验组，全部进入结果分析，无脱落。
2.2 MRI检测结果造模结束后对实验动物进行MRI检测，正常关节软骨在MRI影像上显示为低信号；左侧髌骨软骨信号均匀且连续，实验动物右侧髌骨软骨在T2序列上信号不连续，中间有高信号影，见图2。

2.3 大体观察结果实验兔左膝空白对照侧，髌骨软骨及股骨对应面软骨呈蓝白色，软骨表面光滑，未见明显软化病灶或者裂隙；左侧滑膜组织表面光滑、湿润，有光泽，见图3A。实验兔右侧造模侧，髌骨软骨及股骨对应面软骨呈灰白色，颜色晦暗、表面不平整，偶见软骨裂隙，边缘软骨肿胀明显，见图3B，C；右侧软骨周围滑膜样组织增生，局灶灰红色改变，见图3D。

2.4 组织学观察(苏木精-伊红染色)结果光镜下观察可见左侧髌骨及股骨对应面软骨表面光滑，具有丰富的玻璃样细胞外基质，表层排列有扁平的软骨细胞，中间层可见球形软骨细胞，深层软骨细胞肥大，在深层和钙化层可见增生的软骨细胞，见图4A，B。右侧髌骨及股骨对应面软骨表层增厚，可见“天鹅绒”样改变；细胞外基质减少，软骨中层与深层细胞失去柱状排列，软骨细胞增殖明显，可见局灶性细胞增殖，形成再生软骨细胞克隆，增生的软骨细胞周围基质呈嗜碱性，软骨细胞排列紊乱；软骨表面可见特征性水泡，有软骨细胞灶性坏死，有血管伸入软骨钙化层，钙化软骨与非钙化软骨间多条潮线或潮线模糊，且潮线不规则，见图 4C-F。

光镜下观察滑膜组织，左侧空白对照侧间滑膜边缘单排细胞紧密排列，见图5A。右侧造模侧可见滑膜组织肥厚增生，局部呈乳头状，衬覆的滑膜细胞丰富，局部表面可见纤维素样渗出，伴轻度炎性细胞浸润，见图5B。

2.5 软骨Mankin评分统计分析结果将软骨光镜观察结果按照软骨Mankin评分进行评估，将评分结果导入SPSS 26.0软件进行统计分析。按照实验设计，选用配对t检验进行统计分析。将两侧髌股关节评分结果导入SPSS 26.0软件，求得差值后，对差值进行正态性检验，P > 0.05，差值符合正态性，进行配对t检验。左侧髌股关节评分为1.56±1.02，右侧髌股关节评分为3.88±1.13，两组数据总体均数相比差异有显著性意义(差值为2.31，95%CI：1.34-3.28，P=0.001)，见表1。

进一步进行比较分析，将差值符合正态性分布的进行配对t检验，不符合正态性分布的进行配对秩和检验。左右两侧股骨髁间软骨分别与同侧髌骨软骨进行比较，差异无显著性意义(P=0.830，P=0.142)；但左侧髌骨软骨评分与右侧髌骨软骨评分进行比较，左侧髌骨软骨评分1.13±1.13，右侧髌骨软骨评分3.50±1.93，两组数据总体均数相比差异有显著性意义(差值为2.38，95%CI：1.29-3.46，P=0.001)；左侧股骨髁间软骨与右侧股骨髁间软骨评分比较，左侧股骨髁间软骨评分1.50±1.20，右侧股骨髁间软骨评分4.25±1.58，两组数据总体均数相比差异有显著性意义(差值为2.75，95%CI：1.59-3.91，P=0.001)，见表2。

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引言

材料方法

1.1 设计对比观察动物造模实验，对Mankin评分结果进行正态性检验后，对符合或者近似符合正态性的数据进行配对t检验，偏态数据进行配对秩和检验。
1.2 时间及地点于2020年10-12月在河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)动物实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选取普通级雌性家兔8只，体质量2.5-3.0 kg，购自陕西省咸阳市西咸新区沣东新城实验动物养殖场，实验动物机构许可证号：SCXK(陕)2017-002。
1.3.2 实验仪器自动式滑膜炎造模机器(国家发明专利ZL 201510845488.2)，3.0T西门子MRI仪，全自动脱水仪器(Tissue-Tke®VIPTM5Jr)，包埋机(派斯杰医疗 BM450A)，半自动切片机(Leica HistoCore AUTOCUT)，自动染色机(LEICA AUTISTAINER XL ST5010)，光学显微镜(OLYMPUS BX41)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组及干预将实验动物适应性喂养1周后，选取右后肢为实验组，左后肢为空白对照组。将实验动物称质量后，按照体质量给予戊巴比妥钠注射液(0.3 mg/kg)肌注进行麻醉。待麻醉生效后，将实验动物侧卧固定于实验台上，利用自动式造模机器进行造模，制备髌股关节软骨损伤模型。造模机器由触屏控制箱与活动主体部分组成，活动主体部分主要由滑台、滑台底座、大小腿固定板构成。滑台通过金属连杆与小腿固定板连接，小腿固定板通过合页与大腿固定板连接，大腿固定板另一端通过直角连杆固定于滑台底座上，见图1。通过滑台运动带动小腿的屈伸，实现膝关节的屈伸活动，从而使髌骨在股骨髁间摩擦活动。
1.4.2 造模方法造模时，先打开造模机器将滑台运行到原点，使兔右膝关节与造模机器的大小腿活动关节对齐，大腿和小腿分别固定在大腿固定板和小腿固定板上。利用触屏控制箱设置活动参数：时间90 min，速度60次/min，角度0°-95°。造模活动结束后正常饮食，自由活动，造模持续2周。造模结束后，麻醉处死动物，切开双侧关节囊，暴露髌股关节，大体观察髌股关节软骨情况，并对双侧髌股关节进行病理取材。
1.5 主要观察指标
1.5.1 大体观察麻醉处死实验动物后，观察髌骨软骨及髌骨-股骨对应面软骨颜色、光泽度，以及软骨是否有发泡、溃烂、裂隙、血管翳样组织等。
1.5.2 组织学评价将组织置于体积分数4%的甲醛溶液中固定24 h，之后置于30%甲酸溶液中脱钙1周。脱钙完成后，将髌骨及周围组织沿矢状轴分为内侧和外侧两部分，大小约为3 cm×0.5 cm×0.5 cm，股骨及周围组织沿矢状轴切为内侧、中间、外侧三部分，大小约为3 cm×2 cm×2.5 cm。将组织置于全自动脱水仪器(Tissue-Tke®VIPTM5Jr)，进行梯度脱水，之后利用包埋机(派斯杰医疗 BM450A)进行包埋，在蜡块冷却变硬后，固定于切片机(Leica HistoCore AUTOCUT)上做厚度5 μm的连续切片，重复切片测量求平均值以减小误差。将切好的组织薄片置于载玻片上，烘烤20 min后，上自动染色机(LEICA AUTISTAINER XL ST5010)，经二甲苯及梯度乙醇脱蜡后切片行苏木精-伊红染色，结束后滴加封固胶，加盖盖玻片，置于光学显微镜(OLYMPUS BX41)下观察，并按照Mankin组织学评分进行评价[23]，根据表层软骨细胞分裂程度、细胞排列、染色程度、潮线、血管翳生成等5个方面进行评分，按照正常、轻度、中度、重度4个等级分别评为0-3分，汇总得出最后评分。

1.6 统计学分析利用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，符合正态性或近似正态的数据进行配对t检验检验，严重偏态数据进行配对秩和检验，检验水准为α=0.05，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

膝前疼痛是临床骨科疾病的常见症状[24]，髌股关节的软骨病损，例如髌骨软化症是引起膝前疼痛的主要原因之一[25-26]。髌股关节软骨病损的发病原因复杂，有人认为与髌骨的异常结构有关[25]，也有研究发现了过度活动与疾病之间的相关性[27]。临床中的患者常自述在过度活动，比如爬山、上下楼梯后，膝前疼痛的症状会加重[3]。但即使对发病原因的认识有差异，也都认为其病理机制是软骨遭受到了破坏[28]，而软骨病损是由于机械应力引起的关节软骨磨损或者伴随滑膜炎症和分解代谢的破坏[29]。
目前髌骨软化症的动物实验因缺乏合适的动物模型，研究进展缓慢。当前应用的动物模型主要采取膝关节骨性关节炎的造模方法，通过手术或者注射药物的方法使得髌股关节软骨发生病损[29-31]。但髌股关节软骨损伤的病损主要局限在髌骨软骨与股骨滑车处，同时也会影响到周围的滑膜等组织，但整体病变较为轻微，而膝关节骨性关节炎的模型病变严重，软骨变薄甚至磨损消失，严重者可产生骨赘等，并不完全适合髌股关节软骨损伤的研究。也有学者通过髌支持带手术导致髌骨倾斜来建造髌股关节软骨损伤的模型，并且在实验中观察到了髌骨软骨的组织学改变[32-33]，但是不能排除手术破坏关节周围血供与滑液对关节软骨造成的负面影响，与人类髌股关节软骨损伤的发病缺乏相关性，在推广应用上有所限制。顺轴疲劳运动建造髌股关节损伤模型，顺应关节本身的自然活动轨迹与发病机制，既可针对性造成髌股关节软骨的损伤，又能够避免手术等对关节血运及软骨营养的影响。
此次研究在参考前人造模经验的基础上，基于临床普遍认可的过量活动病因及病理机制，采用运动造模的方法导致髌股关节软骨的病损，建造髌股关节软骨损伤动物模型。实验动物选取新西兰兔，因兔的膝关节结构与人类接近，在兔的膝关节上采用自体对照实验的方法，将左侧膝关节作为空白对照组，右侧膝关节作为实验组，利用自动造模机器进行顺轴疲劳运动造模；之后采用MRI检测加软骨病理切片等权威检测方法，确定是否成功建立髌股软骨病损的模型[34-35]。
在此次实验中，2周的顺轴疲劳运动后髌骨软骨以及股骨与髌骨的对应面软骨出现病损；大体观察可观察到实验侧的软骨病损，软骨周围可见滑膜样组织的增生；在MRI检查中，实验侧的髌骨软骨信号不均匀；另外实验侧与空白对照侧的镜下观察也存在明显的差异，而且这种差异在统计学上仍旧支持，而同侧的髌骨软骨与股骨软骨之间差异无显著性意义。
此次实验中观察到与既往髌股关节软骨损伤动物模型研究相似的结果：在光镜下见到实验侧软骨表面的“天鹅绒”样改变，这种软骨表面的纤颤，被认为与损伤的软骨细胞释放溶酶体酶后的酶降解和蛋白多糖降解引起的创伤影响和胶原丢失有关[36]；光镜下观察到的实验侧滑膜组织的增生以及炎性细胞的浸润，说明滑膜组织在长期的疲劳运动后有炎性反应。滑膜炎是关节炎的主要致病因素之一，而炎性细胞浸润导致的炎性递质释放，可能改变神经传入终末的敏感性，从而引起膝前疼痛症状[37]。
在进行软骨的Mankin评分时，遵循盲法原则，不对评分人员透露标本分组，结果发现左膝关节虽然没有进行造模活动，但仍可见到一定程度的软骨病损。为了鉴别这种情况是兔膝关节软骨的正常表现，还是受到了对侧造模活动的影响，作者重新饲养了动物，不进行造模活动，之后解剖并取病理，在光镜下观察到了完全正常的软骨病理图像，没有出现软骨细胞的明显增殖与肥大，也没有观察到软骨染色的加深，提示左侧出现的软骨病损可能是在造模活动时受到了影响；也可能是因为单侧造模后，造成了右侧髌股关节的损伤，动物因疼痛将身体重心移到左侧，导致左侧关节承重增加，造成了另一种形式的劳损。未来的研究中需要改变造模方法，比如采用双侧造模法来规避这种影响，进行更深入的探究。
此次实验中也对实验动物进行了膝关节MRI的检查。将实验动物麻醉后，增加配重调整参数后，将其双侧膝关节固定于膝关节核磁线圈内进行图像采集；在采集到的图像中，可以看到右侧兔髌骨软骨信号不均匀，但是由于样本数量较少，还需要进一步的研究充实结果。
经典的模型研究需要反复的验证，运动的强度、时间、造模周期等多种因素都会影响实验的结果[38-39]。在对病理标本进行大体观察的过程中，发现有动物出现软骨下出血，提示可能存在运动量过大的情况。未来的实验研究中，还需要针对不同影响因素设置多水平的重复实验，摸索出最合适稳定的造模方案。
结论：顺轴疲劳运动可以对髌股关节软骨造成病损，这种软骨病损以软骨表面的肿胀、发泡、裂隙为主要表现，在光镜下可以观察到软骨细胞的坏死与反应性增殖。因顺轴疲劳运动造成的髌股关节软骨病损较为轻微，可经大体观察与组织学观察结果确认，将来可在此次研究的基础上进行发散性研究，或者更深入的探索。

顺轴疲劳运动对兔髌股关节软骨损伤的影响

Effect of uniaxial fatigue exercise on patellofemoral cartilage injury in a rabbit

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