去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用

doi:10.12307/2022.137

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (7): 1012-1019.doi: 10.12307/2022.137

• 牙髓及牙周膜干细胞 Dental pulp and periodontal ligament stem cells • 上一篇下一篇

去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用

周颖1，张幻2，廖松3，胡凡琦3，易静1，刘玉斌1，靳继德1

1中国人民解放军军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京市 100850；2广西医科大学附属肿瘤医院乳腺及骨、软组织肿瘤内科，广西壮族自治区南宁市 530021；3中国人民解放军总医院，北京市 100853

收稿日期:2021-03-30 修回日期:2021-04-01 接受日期:2021-04-19 出版日期:2022-03-08 发布日期:2021-10-29
通讯作者: 靳继德，博士，副研究员，中国人民解放军军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京市 100850
作者简介:周颖，女，1995年生，福建省宁德市人，汉族，2021年中国人民解放军军事科学院军事医学研究院毕业，硕士，主要从事干细胞的研究。
基金资助:
全军后勤重点项目(BWS17J021)，项目参与人：周颖

Immunomodulatory effects of deferoxamine and interferon gamma on human dental pulp stem cells

Zhou Ying1, Zhang Huan2, Liao Song3, Hu Fanqi3, Yi Jing1, Liu Yubin1, Jin Jide1

1Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Science, Academy of military Sciences, Beijing 100850, China; 2Department of Breast and Bone and Soft Tissue Oncology, Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 3General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China

Received:2021-03-30 Revised:2021-04-01 Accepted:2021-04-19 Online:2022-03-08 Published:2021-10-29
Contact: Jin Jide, MD, Associate researcher, Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Science, Academy of military Sciences, Beijing 100850, China
About author:Zhou Ying, Master, Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Science, Academy of military Sciences, Beijing 100850, China
Supported by:
Key Military Logistics Project, No. BWS17J021 (to ZY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
去铁胺：作为一种铁离子螯合剂，是一种很好的低氧模拟剂，可抑制需要铁离子参与的低氧诱导因子1α降解。
干扰素γ：是一类糖蛋白，具有抗病毒、抑制细胞增殖、调节免疫及抗肿瘤作用。
背景：免疫排斥是组织和器官移植面临的巨大挑战，免疫抑制剂的使用常给患者带来严重的不良反应，间充质干细胞的免疫抑制作用为免疫排斥的治疗带来新的希望。
目的：探讨去铁胺和干扰素γ对人牙髓干细胞免疫调节能力的影响。
方法：用去铁胺、干扰素γ以及二者联合预处理人牙髓干细胞，CCK-8检测细胞增殖能力，Q-PCR检测相关基因mRNA的表达，ELISA检测培养上清中炎性因子水平；预处理后的人牙髓干细胞与CFSE标记的小鼠脾淋巴细胞共培养，流式细胞术检测脾淋巴细胞的增殖能力。建立小鼠异体皮肤移植模型，经尾静脉注射PBS或不同预处理的人牙髓干细胞，记录移植皮肤存活时间，进行组织病理学和免疫组化分析，检测移植小鼠脾脏Treg细胞比例。
结果与结论：①去铁胺和干扰素γ预处理均抑制了人牙髓干细胞的生长，去铁胺生长抑制作用更为明显；②去铁胺联合干扰素γ预处理明显提高了血管内皮生长因子、白细胞介素6、转化生长因子β1、环氧合酶2、人类白细胞抗原G、肿瘤坏死因子Α诱导蛋白6和白细胞介素10基因表达，促进了白细胞介素6、转化生长因子β1和前列腺素E2的分泌；③体内实验结果证实，去铁胺联合干扰素γ预处理的人牙髓干细胞可以延长小鼠异体移植皮肤存活时间，减轻了移植皮片处CD4+T、CD8+T以及巨噬细胞的浸润，促进了受体小鼠脾脏中Treg细胞增加；④研究结果表明，经去铁胺联合干扰素γ预处理后，人牙髓干细胞的免疫调节作用明显增强，减轻了皮肤移植免疫排斥反应。

https://orcid.org/0000-0003-1443-8874(周颖)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 人牙髓干细胞, 去铁胺, 干扰素γ, 皮肤移植, 免疫调节, 免疫排斥

Abstract: BACKGROUND: Immune rejection is a great challenge for tissue or organ transplantation, and immunosuppressors often bring serious side effects to patients. The immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells brings new hope for the treatment of immune rejection.
OBJECTIVE: To explore the effect of combined action of deferoxamine and interferon-γ on the immunomodulatory ability of human dental pulp stem cells.
METHODS: After pretreatment of human dental pulp stem cells with deferoxamine or interferon-γ or their combination, the proliferation of cells was detected with cell counting kit-8. The mRNA expression of some gene mRNA was examined by Q-PCR. The secretion of some immune regulatory factors was determined using ELISA. Thereafter, pretreated human dental pulp stem cells were co-cultured with mouse spleen lymphocytes, and then the proliferation of lymphocytes was detected by CFSE labeling by flow cytometry. After allogenic skin transplantation, mice were injected with PBS, human dental pulp stem cells or pretreated human dental pulp stem cells into tail vein immediately. The survival time of skin grafts was recorded. The pathology and immunohistochemistry of skin grafts were examined. Moreover, the proportion of Treg cells in spleen of transplanted mice was measured.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Deferoxamine or interferon-γ pretreatment inhibited the growth of human dental pulp stem cells, and the inhibition of deferoxamine was more significant than interferon-γ. (2) Pretreatment of deferoxamine combined with interferon-γ significantly increased the gene expression of vascular endothelial growth factor, interleukin 6, transforming growth factor β1, cyclooxygenase 2, human leukocyte antigen G, tumor necrosis factor A inducible protein 6 and interleukin 10, and promote secretion of interleukin 6, transforming growth factor β1 and prostaglandin E2. (3) The results of in vivo experiments confirmed that human dental pulp stem cells pretreated with deferoxamine combined with interferon-γ prolonged the survival time of mouse allograft skin, reduced the infiltration of CD4+T, CD8+T and macrophages at the grafted skin, and increased the proportion of Treg cells in the spleen of recipient mice. (4) It is concluded that deferoxamine combined with interferon-γ pretreatment enhanced the immunomodulatory effect of human dental pulp stem cells, and inhibited the immune rejection of skin allografts.

Key words: stem cells, human dental pulp stem cells, deferoxamine, interferon-γ, skin transplantation, immunomodulation, immune rejection

中图分类号:

周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.

Zhou Ying, Zhang Huan, Liao Song, Hu Fanqi, Yi Jing, Liu Yubin, Jin Jide. Immunomodulatory effects of deferoxamine and interferon gamma on human dental pulp stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(7): 1012-1019.

图/表（结果） 9

2.1 去铁胺和干扰素γ对人牙髓干细胞形态的影响如图1所示，各组人牙髓干细胞均贴壁生长，形态均一，呈纺锤状。对照组的细胞密度高于去铁胺预处理组和干扰素γ预处理组，去铁胺联合干扰素γ预处理组细胞密度最低。

2.2 去铁胺联合干扰素γ对人牙髓干细胞增殖的影响如图2所示，与对照组相比，去铁胺和干扰素γ预处理都抑制了人牙髓干细胞生长，去铁胺联合干扰素γ预处理组的抑制作用更为明显，说明去铁胺与干扰素γ都抑制了人牙髓干细胞增殖。

2.3 去铁胺和干扰素γ对人牙髓干细胞相关基因表达的影响由图3可知，血管内皮生长因子在去铁胺处理后24 h表达开始升高，并持续到48 h；在干扰素γ处理后仅在4 h时表达高于对照组；而联合处理后24 h表达明显高于对照组，并持续到48 h。白细胞介素6的表达在4 h时各预处理组均高于对照组，并持续到48 h(但在24 h去铁胺组显著降低)。肝细胞生长因子和吲哚胺2，3-双加氧酶的表达只有干扰素γ预处理组和联合预处理组高于对照组，由4 h持续到48 h。转化生长因子β1、环氧合酶2、白细胞介素4和白细胞介素10的表达则只有去铁胺预处理组和联合预处理组在24 h和48 h高于对照组。肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的表达在处理后4 h和48 h高于对照组(但在24 h去铁胺预处理组显著降低)，而联合预处理组在3个时间段均高于对照组。人类白细胞抗原G的表达在24 h只有联合预处理组高于对照组，48 h 3个预处理组均高于对照组。
相比其他组，去铁胺预处理组对血管内皮生长因子、白细胞介素6、转化生长因子β1、环氧合酶2、人类白细胞抗原G、白细胞介素4和白细胞介素10等基因的表达上调作用较显著；干扰素γ预处理组对白细胞介素6、肝细胞生长因子、吲哚胺2，3-双加氧酶和肿瘤坏死因子α诱导蛋白6等基因的表达上调较显著，而二者联合预处理后血管内皮生长因子、白细胞介素6、转化生长因子β1、环氧合酶2、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α诱导蛋白6、人类白细胞抗原G等基因的表达均出现显著上调，但肝细胞生长因子与吲哚胺2，3-双加氧酶基因的表达在干扰素γ预处理组上调更显著。

2.4 去铁胺和干扰素γ对人牙髓干细胞相关细胞因子分泌的影响如图4所示，经去铁胺和干扰素γ预处理后，人牙髓干细胞分泌的白细胞介素6较对照组有所升高且差异有显著性意义，而转化生长因子β1、前列腺素E2较对照组也有所升高，但差异无显著性意义，并且联合预处理组白细胞介素6、转化生长因子β1和前列腺素E2增高最为明显，但3个预处理组对吲哚胺2，3-双加氧酶的分泌影响均不明显。

2.5 去铁胺联合干扰素γ对人牙髓干细胞抑制淋巴细胞增殖的影响不同预处理的人牙髓干细胞与CFSE预染的小鼠脾淋巴细胞共培养3 d后，通过流式细胞术检测脾淋巴细胞的增殖。如图5所示，与抗CD3抗体活化的脾细胞共培养后，去铁胺或干扰素γ预处理人牙髓干细胞均抑制了脾淋巴细胞的增殖，且去铁胺联合干扰素γ预处理人牙髓干细胞抑制脾淋巴细胞的增殖作用最强。
2.6 小鼠异体移植皮片的存活时间空白对照组小鼠移植皮片在术后7 d即开始有动物出现脱落，至观察期14 d结束所有小鼠的移植皮肤均发生脱落，平均存活时间仅为(9.25±3.20) d；单纯干细胞治疗组移植皮片的存活时间较空白对照组有所延长，平均存活时间为(11.75±2.21) d；去铁胺联合干扰素γ预处理干细胞治疗组至观察期14 d结束，仅有1只小鼠的移植皮肤在第14天发生脱落。结果表明，人牙髓干细胞可以延长小鼠异体移植皮肤的存活时间，但去铁胺联合干扰素γ预处理人牙髓干细胞的作用更为明显。

2.7 移植皮片大体外观移植后第3，7，14天，移植皮肤外观如图6所示。移植后第3天，3组小鼠移植皮肤均存活良好。移植后第7天，空白对照组约2/3的动物移植皮肤发黑坏死，开始发生脱落；单纯干细胞治疗组小鼠移植皮肤大部分存活良好，仅少量出现发黑坏死，术后第9天开始发生脱落；去铁胺联合干扰素γ预处理干细胞治疗组动物移植皮肤成活良好，无发黑、坏死出现，甚至出现毛发的生长。移植后第14天，空白对照组和单纯干细胞治疗组所有小鼠的移植皮片均脱落。而去铁胺联合干扰素γ预处理干细胞治疗组至观察期14 d结束，仅有1只小鼠的移植皮肤发生脱落，其他小鼠移植皮肤无发黑、坏死，并出现毛发的正常生长。

2.8 移植皮片苏木精-伊红染色结果如图7所示，移植后第3天，空白对照组小鼠移植皮片出现大量炎细胞浸润，出现急性脓肿，炎症反应显著，表皮和真皮均出现坏死，评分为4级；单纯干细胞治疗组移植皮片可见局灶性炎细胞浸润，有轻微表皮变性，评分为2级；去铁胺联合干扰素γ预处理干细胞治疗组移植皮片的皮肤附属器尚存完好，仅有少量炎细胞浸润，评分为1级。移植后第7天，空白对照组皮片仍显示大量炎细胞浸润，组织水肿，表皮、真皮坏死，出现慢性肉芽肿，评分为3级；单纯干细胞治疗组移植皮片可见局灶性炎性细胞浸润，有轻微表皮变性，评分为2级：去铁胺联合干扰素γ预处理干细胞治疗组移植皮片没有发现表皮变性，但可见局灶炎症细胞浸润，皮肤附属器尚存完好，评分为1级。移植后第14天，空白对照组和单纯干细胞治疗组小鼠移植皮片已完全脱落；去铁胺联合干扰素γ预处理干细胞治疗组移植皮片仅有少许炎细胞浸润，表皮、真皮结构完整，附属器尚存完好，瘢痕修复好，评分为1级。尽管在皮肤移植后，3组动物所有的移植皮片均出现被排斥现象，但人牙髓干细胞治疗减轻了对移植皮片的排斥作用，而这种作用在联合处理组更加明显，这提示去铁胺联合干扰素γ预处理促进了人牙髓干细胞诱导免疫耐受。

2.9 移植皮片的免疫组化结果如图8所示，空白对照组小鼠移植皮片中可见大量CD4+、CD8+和CD68+的免疫细胞浸润，单纯干细胞治疗组3种阳性细胞均略有减少，去铁胺联合干扰素γ预处理干细胞治疗组阳性细胞的表达最少，显著低于其他两组。移植后第14天细胞浸润情况略少于第7天。结果说明单纯人牙髓干细胞对淋巴细胞和巨噬细胞有抑制作用，减轻了免疫排斥反应，而去铁胺联合干扰素γ预处理增强其抑制作用，进一步减轻免疫排斥反应。

2.10 受体小鼠脾脏调节性T细胞的比例移植后第3，7天，采用流式细胞术检测小鼠脾脏中CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例。如图9所示，单纯干细胞治疗组受体小鼠脾脏中Treg细胞比例略高于空白对照组，去铁胺联合干扰素γ预处理干细胞治疗组Treg细胞比例最高，但差异无显著性意义。
2.11 生物相容性间充质干细胞是一种低免疫原性的细胞，不会产生免疫排斥反应。

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引言

器官移植是治疗终末期器官衰竭最有效的方法之一，但移植物的长期存活受到移植物排斥反应的限制。目前治疗免疫排斥的主要方法是使用免疫抑制剂，如环孢素、硫唑嘌呤和西罗莫司[1]。虽然这些免疫抑制剂在很大程度上改善了器官移植患者的预后，但由于缺乏特异性，长期使用会导致许多不良反应，包括肾毒性、机会性感染、糖尿病甚至恶性肿瘤，这限制了器官移植技术的发展[2]。因此，减少免疫抑制剂导致的并发症，诱导移植后的免疫耐受，对器官移植患者具有至关重要的意义。
近几十年来，随着免疫调节相关研究的深入，细胞治疗已成为减轻移植后排斥反应的新途径。间充质干细胞由于其可塑性、迁移能力强，具有旁分泌活性、免疫调节和再生特性等，目前已广泛用于多种疾病的治疗研究，同时也被用于移植后的免疫排斥治疗。人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)主要从脱落的乳牙、智齿、正畸牙的牙髓中分离获取，具有间充质干细胞的生物学特征和功能，与骨髓、脂肪源等间充质干细胞相比，它的再生潜能和增殖能力较强，而且来源丰富，易于获得，可通过无创性常规临床操作获取，伦理问题较少。此外，它还具有较低的免疫原性和较强的免疫调节功能，在抗自身免疫反应和抗炎等领域有广泛的应用潜能[3-5]。
间充质干细胞虽然可以调节机体的免疫状态，但在临床应用中它们的免疫抑制作用常很难达到满意的治疗效果，并存在较大的个体差异。提高间充质干细胞的临床治疗效果，是一个很重要的研究方向。目前正在开发多种不同的预处理策略以增强间充质干细胞的免疫调节作用，例如通过基因修饰或用不同物理或化学因素对间充质干细胞进行预处理。研究发现，干扰素γ可以通过上调骨髓间充质干细胞中吲哚胺2，3-双加氧酶的表达增强其免疫调节能力，缓解实验性结肠炎，降低血清淀粉样蛋白A水平和结肠组织局部促炎细胞因子水平[6]。此外，一种铁离子螯合剂——去铁胺可以模拟细胞的低氧状态，能增加抗炎因子的分泌，去铁胺处理后间充质干细胞的白细胞介素4 mRNA表达和分泌增加[7]。然而，去铁胺联合干扰素γ对间充质干细胞的生物学功能，特别是对其免疫调节能力的影响还未见报道。
由于预处理过程简单可行，通过预处理增强间充质干细胞的生物学功能和疾病的治疗效果成为近年来的研究热点。因此，该研究将去铁胺与干扰素γ联合应用于人牙髓干细胞，希望可以提高其免疫调节能力，为间充质干细胞治疗免疫相关疾病的研究提供依据或参考。

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验与动物体内实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2020年5月至2021年3月在军事科学院军事医学研究院完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞人牙髓干细胞来自军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所实验血液学与生物化学研究室冻存细胞株，后续实验使用的细胞均为复苏的4-6代细胞，其生长特性、细胞表型、分化能力均符合间充质干细胞鉴定标准。人牙髓干细胞在培养过程中状态良好，具有贴壁的生长特性，细胞形态稳定，呈纺锤状、鱼群样或漩涡状生长。
1.3.2 实验试剂去铁胺(Sigma公司)；人重组干扰素γ
(Peprotech公司)；α-MEM培养基及胎牛血清(Gibco公司)；0.25%胰蛋白酶(EallBio公司)；CCK-8检测试剂盒及RNA-Quick purification Kit(奕杉生物公司)；Starscript II First-strand cDNA及2×RealStar Green Fast Mixture(GenStar公司)；人转化生长因子β1酶联免疫试剂盒、人白细胞介素6酶联免疫试剂盒、人前列腺素E2酶联免疫试剂盒、人吲哚胺2，3-双加氧酶酶联免疫试剂盒(R&D公司)；荧光染料CFSE(Biogems公司)。
1.3.3 实验仪器 ABI 7500 Fast Real-time PCR system(美国ABI公司)；Multiskan FC酶标仪(美国Thermo公司)；FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)。
1.3.4 实验动物 C57BL/6雄性小鼠30只，SPF级，8-10周龄，体质量18-22 g，购于斯贝福生物技术有限公司；BALB/c雄性小鼠10只，SPF级，8-10周龄，体质量18-22 g，购于斯贝福生物技术有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 去铁胺和干扰素γ对人牙髓干细胞的预处理取冻存的第4代人牙髓干细胞，以1×109 L-1接种于100 mm培养皿中，细胞生长到90%融合时，用胰酶消化收集人牙髓干细胞，实验分组：对照组、去铁胺预处理组、干扰素γ预处理组、去铁胺联合干扰素γ预处理组。细胞培养24 h贴壁后，分别更换含有去铁胺(250 μmol/L)、干扰素γ(50 μg/L)或去铁胺联合干扰素γ的完全培养基，每天观察预处理后的细胞形态及生长趋势变化。
1.4.2 CCK-8检测预处理对人牙髓干细胞增殖的影响第5代人牙髓干细胞浓度为5×107 L-1，吹打混匀后接种于96孔板，每孔100 μL细胞悬液，细胞培养24 h贴壁后更换含有去铁胺(250 μmol/L)、干扰素γ(50 μg/L)或去铁胺联合干扰素γ的完全培养基继续培养，设立4个复孔，每隔24 h检测1次，连续检测5 d，在相应的时间点，吸弃96孔板中的培养基，每孔加入100 μL反应液(含90 μL α-MEM和10 μL CCK-8试剂)，孵育3 h，使用酶标仪检测450 nm处的吸光度值，根据记录的数据进行统计分析并绘制生长曲线。
1.4.3 ELISA检测细胞培养上清液中相关炎症因子水平第5，6代人牙髓干细胞接种于6孔板，细胞浓度为2×108 L-1，每孔2 mL，培养过夜后，实验组细胞上清中分别添加去铁胺
(250 μmol/L)、干扰素γ(50 μg/L)或去铁胺联合干扰素γ作用4，24，48 h，采用ELISA法检测细胞培养上清中相关炎性因子转化生长因子β1、吲哚胺2，3-双加氧酶、前列腺素E2和白细胞介素6水平。
1.4.4 Q-PCR检测人牙髓干细胞相关基因的表达利用Trizol 法提取细胞总RNA，按照反转录试剂盒说明书合成 cDNA，通过Q-PCR法检测人牙髓干细胞相关基因血管内皮生长因子、白细胞介素6、肝细胞生长因子、转化生长因子β1、环氧合酶2、吲哚胺2，3-双加氧酶、肿瘤坏死因子α诱导蛋白6、人类白细胞抗原G、白细胞介素4和白细胞介素10的表达变化。基因引物序列见表1。

1.4.5 小鼠脾脏淋巴细胞增殖抑制实验分离C57BL/6小鼠脾淋巴细胞[8]，用CFSE进行荧光标记。先将第5代人牙髓干细胞接种于96孔板，12 h贴壁后加入去铁胺(250 μmol/L)、干扰素γ(50 μg/L)或去铁胺联合干扰素γ干预48 h，然后按5∶1的细胞比例将淋巴细胞(2.5×104/孔)加入到各组人牙髓干细胞(5×103/孔)培养体系中共培养3 d，实验分为对照组、去铁胺预处理组、干扰素γ预处理组、去铁胺联合干扰素γ预处理组。通过流式细胞仪检测CFSE的荧光值分析淋巴细胞的增殖情况。
1.4.6 小鼠异体皮肤移植模型的建立通过将BALB/c小鼠背部全层皮肤移植到C57BL/6小鼠的背部皮肤缺损处，建立小鼠异体皮肤移植模型[9]。建模成功后，30只C57BL/6小鼠随机分为3组：空白对照组、单纯干细胞治疗组、去铁胺联合干扰素γ预处理干细胞治疗组，每组10只。手术后立即通过尾静脉输注5×105个人牙髓干细胞或去铁胺联合干扰素γ预处理的人牙髓干细胞进行治疗，空白对照组尾静脉输注等量PBS。
1.4.7 移植皮片的存活时间和存活状况移植后第3天拆包观察移植皮片的存活状况，之后每日记录受体小鼠一般情况，观察受体小鼠移植皮肤的质地、颜色、硬度以及有无结痂、脱落。如果移植皮肤出现以下情况则认为发生排斥现象：移植皮肤随时间逐渐变硬，变干坏死或者脱落、溃烂、结痂。如果移植皮肤质地比较柔软甚至有毛发长出被认为是存活或者是免疫耐受。若皮片出现90%及以上的结痂或脱落均视为皮片坏死。每天观察1次，直至皮片坏死，记录皮片存活时间用以绘制生存曲线。
1.4.8 移植皮片的病理和免疫组化分析移植后第3，7，14天，每组随机选取3只小鼠，麻醉后处死，完整剪取背部移植皮片，常规进行石蜡切片，苏木精-伊红染色，使用光学显微镜观察移植皮片的病理改变。通过Zdichavsky方法对移植皮肤排斥进行病理评分分级，将移植皮片分为5级：0级，表现为红润的皮色，镜下为正常的表皮和真皮结构，未见炎症细胞浸润；1级，皮色略暗红，镜下可观察到组织内存在少量的炎症细胞浸润，没有或仅有轻微的表皮变性；2级，皮色暗红，镜下观察组织内可见局灶性的炎症细胞浸润，可见表皮变性；3级，皮色暗或呈青紫色，镜下观察组织内可见广泛的炎症细胞浸润，可见较重的表皮变性甚至局灶性坏死；4级，皮色青紫或发黑，镜下观察可见严重的炎症细胞浸润或表皮、真皮的坏死。通过免疫组织化学染色观察移植皮片CD4+T、CD8+T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞的浸润情况。
1.4.9 流式细胞仪检测受体小鼠脾脏Treg细胞比例移植后第3，7，14天，每组随机取3只小鼠(与1.4.8相同的小鼠)，麻醉后处死，在无菌条件下完整分离出受体小鼠的脾脏，按EBioscience小鼠Treg细胞染色试剂盒说明书分别用抗CD4、CD25、FOXP3抗体对小鼠脾淋巴细胞进行标记，采用流式细胞仪检测脾脏CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例变化。
1.5 主要观察指标 ①人牙髓干细胞的形态变化及增殖情况；②人牙髓干细胞的相关基因表达；③人牙髓干细胞培养上清中相关细胞因子的分泌；④共培养后脾淋巴细胞的增殖情况；⑤移植皮片存活状况；⑥移植皮片评分；⑦移植皮片组织病理学和免疫组化分析；⑧移植小鼠脾脏Treg细胞比例。
1.6 统计学分析应用 GraphPad Prism software version 5进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近年来，同种异体移植排斥反应等相关研究取得了巨大的进展，移植物的短期存活率有了实质性的改善，然而，免疫抑制剂的长期使用会导致免疫缺陷，甚至心血管疾病和恶性肿瘤。新的研究表明，间充质干细胞可被用于治疗移植后的免疫排斥从而弥补免疫抑制剂的缺陷。
去铁胺作为一种铁离子螯合剂，是一种很好的低氧模拟剂，可抑制需要铁离子参与的低氧诱导因子1α降解[10]。有研究证明，去铁胺可以增加核低氧诱导因子1α的积聚，上调间充质干细胞中血管内皮生长因子的表达，增加血管生长和组织灌注量[11-14]。用去铁胺处理细胞会抑制核糖核苷酸还原酶的活性，从而减少不同细胞中的DNA合成，抑制活化的T淋巴细胞增殖[15-16]。该实验结果也显示，去铁胺处理后，人牙髓干细胞增殖明显受到了抑制。前期实验探索了不同浓度去铁胺对人牙髓干细胞生物学特性的影响，选择了
250 μmol/L去铁胺进行后续实验。虽然250 μmol/L去铁胺处理抑制了细胞的增殖，但给细胞生长提供了一个低氧环境，与人牙髓干细胞的干细胞特性维持密切相关的蛋白因子如血管内皮生长因子和白细胞介素6的表达明显增加。血管内皮生长因子具有较强的促血管再生和促创伤愈合的作用[17]；白细胞介素6是一种对维持间充质干细胞干性具有重要作用的细胞因子，是间充质干细胞制备过程中维持不分化的关键因素[18]。上述结果表明去铁胺处理维持了人牙髓干细胞的干性特征，增强了它的生物学功能，有助于发挥治疗效果。
此外，有研究报道去铁胺处理后，间充质干细胞的白细胞介素4表达和分泌明显增加[7]，而白细胞介素4是一种已知的抗炎因子和M2巨噬细胞极化的诱导剂。在该实验中，经过去铁胺处理后，人牙髓干细胞中白细胞介素4表达明显增高，同时抑炎因子白细胞介素10和转化生长因子β表达也明显增加。白细胞介素10是一种重要的抗炎细胞因子，作用于天然免疫细胞和获得性免疫细胞，具有广泛的免疫抑制活性[19-20]。转化生长因子β对T细胞、B细胞、巨噬细胞的增殖和激活都有明显抑制作用，可以终止效应细胞和记忆性T细胞的免疫反应，下调黏附分子表达，抑制白细胞与内皮细胞的黏附[21-22]。该实验还发现，经过去铁胺处理后，抑制炎性反应蛋白人类白细胞抗原G和环氧合酶2的表达也明显增加，具有明显抑制炎性反应的前列腺素E2的分泌也明显增多。人类白细胞抗原G属于非经典的MHCⅠ类分子，具有明确的免疫抑制作用，可以通过诱导Treg的产生促进体内效应细胞分泌白细胞介素10，从而诱导机体出现免疫耐受[23]。
环氧合酶是合成前列腺素过程中的关键限速酶，环氧合酶2是一种诱导性酶，在炎症因子刺激下被诱导活化而产生前列腺素E2[24-25]，而前列腺素E2是重要的抗炎递质，通过抑制肿瘤坏死因子α和多种白细胞介素的产生，而激发机体的免疫抑制功能，从而帮助炎症消退、促进组织再生和体内稳态的恢复[26]。这些结果说明经过去铁胺处理，除了可以维持人牙髓干细胞的干细胞特性外，还明显促进了它对抑炎蛋白和抑炎因子的分泌，增强了它的免疫调控能力。
间充质干细胞的免疫调节具有两面性，既可增强机体的免疫功能，又可抑制机体过度的炎性反应，而间充质干细胞的免疫抑制活性需要炎性环境或炎性因子的刺激或诱导。干扰素γ对于间充质干细胞的免疫抑制活性的诱导发挥着关键的作用，干扰素γ预处理可诱导间充质干细胞抗炎分子的表达和分泌[27]。在该实验中，经过干扰素γ处理后，人牙髓干细胞表达肝细胞生长因子、吲哚胺2，3-双加氧酶、肿瘤坏死因子α诱导蛋白6和白细胞介素6都明显增多，这些蛋白和因子都具有不同程度的炎性抑制作用。肝细胞生长因子是来源于间质细胞的多效生长因子，可以促进多种细胞的分裂和生长，间充质干细胞通过旁分泌方式分泌肝细胞生长因子而发挥免疫调节作用[28]。吲哚胺2，3-双加氧酶对免疫系统具有重要的调控作用，高表达吲哚胺2，3-双加氧酶的间充质干细胞可导致细胞微环境中的色氨酸耗竭，抑制T细胞增殖[29]。肿瘤坏死因子α诱导蛋白6通过抑制局部炎症反应而发挥组织保护作用，将骨髓间充质干细胞移植到受损组织后，可大量分泌肿瘤坏死因子α诱导蛋白6，并通过抑制受损细胞内TLR2/NF-κB信号通路，抑制炎性因子的表达和分泌，从而发挥其抗炎及促进组织修复的作用[30]。
去铁胺和干扰素γ处理均可引起人牙髓干细胞的白细胞介素6和转化生长因子β1基因表达增高，二者联合处理后，白细胞介素6和转化生长因子β的基因表达水平进一步增高。此外，血管内皮生长因子、环氧合酶2、肿瘤坏死因子α诱导蛋白6、人类白细胞抗原G和白细胞介素10的表达也在二者联合处理后表达最高，说明去铁胺和干扰素γ对人牙髓干细胞作用具有协同性，可以进一步促进人牙髓干细胞表达以及分泌免疫调节蛋白和因子，增强它的免疫抑制能力，抑制小鼠淋巴细胞的增殖。但联合组肝细胞生长因子与吲哚胺2，3-双加氧酶的表达与干扰素γ组无显著差异，说明肝细胞生长因子与吲哚胺2，3-双加氧酶表达主要与干扰素γ具有相关性，后续还需要进一步去做相关验证。
皮肤作为一种抗原性较强的组织，其对异体移植物存在强烈的免疫排斥反应，导致异体皮肤移植后存活时间较短。小鼠异体皮肤移植实验结果表明，相较于空白对照组，单纯干细胞治疗组小鼠异体移植皮片的存活时间延长，而去铁胺联合干扰素γ预处理干细胞治疗组小鼠移植皮片的存活时间最长。CD4+T和CD8+T 淋巴细胞是参与器官移植反应的主要启动细胞，首先T细胞识别异体移植物后被激活，CD4+和CD8+效应T细胞从邻近组织向移植物迁移[31]。该实验结果也显示，空白对照组小鼠移植皮片中含有大量的CD4+T和CD8+T细胞，单纯干细胞治疗组小鼠移植皮片中上述细胞的含量明显减少，而去铁胺联合干扰素γ预处理干细胞治疗组上述细胞的含量最少。上述细胞含量的多少反映了受体小鼠对移植皮肤产生免疫排斥反应的严重程度，因此，该研究结果显示了去铁胺联合干扰素γ预处理促进了人牙髓干细胞对移植部位T细胞的抑制作用。目前认为组织或器官移植后，首先T细胞识别异体移植物后被激活，从邻近组织向移植物迁移，随之而来的是大量单核细胞渗入移植物。研究显示，器官或组织移植后发生免疫排斥反应的主要表现为T细胞和巨噬细胞对移植物的强烈浸润，激活后的巨噬细胞被认为是同种异体排斥反应后期的主要候选效应细胞[32]。该研究结果也显示，空白对照组小鼠移植皮片中CD68大量表达，而单纯干细胞治疗组的CD68表达有所下降，去铁胺联合干扰素γ预处理干细胞治疗组CD68+巨噬细胞的表达低于其他两组，说明去铁胺联合干扰素γ预处理促进了人牙髓干细胞对CD68+巨噬细胞的抑制，在一定程度上减轻了移植部位免疫排斥反应。此外，单纯干细胞治疗组、去铁胺联合干扰素γ预处理干细胞治疗组受体小鼠脾脏Treg细胞比例在移植后第3天和第7天均高于空白对照组，Treg细胞是CD4+T细胞的一个亚群，具有抑制效应性T细胞的特性[33]。
综上所述，去铁胺联合干扰素γ预处理增强了人牙髓干细胞的免疫调节作用，表现为抑制免疫反应的蛋白和细胞因子表达增多，对淋巴细胞的抑制作用增加，可延长小鼠异体移植皮肤的存活时间，减轻免疫排斥反应。这项研究结果提示，去铁胺和干扰素γ联合预处理人牙髓干细胞在治疗移植排斥、诱导免疫耐受方面具有潜在的应用价值，可为临床研究和应用提供依据和参考。

去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用

Immunomodulatory effects of deferoxamine and interferon gamma on human dental pulp stem cells

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