高压氧联合NgR基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤

doi:10.12307/2022.003

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (1): 12-19.doi: 10.12307/2022.003

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高压氧联合NgR基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤

梅运运1，张建军2，王东2

1天津医科大学第四中心临床学院，天津市 300070；2天津市第四中心医院，天津市 300140

收稿日期:2020-10-15 修回日期:2020-10-17 接受日期:2020-11-21 出版日期:2022-01-08 发布日期:2021-10-23
通讯作者: 王东，主任医师，硕士生导师，天津市第四中心医院神经外科，天津市 300140
作者简介:梅运运，男，1995年生，天津医科大学在读硕士，主要从事脊髓损伤研究。
基金资助:
天津市自然科学基金项目(17JCYBJC27300)，项目负责人：王东

Hyperbaric oxygen combined with NgR gene silencing bone marrow mesenchymal stem cells transplantation for spinal cord injury in rats

Mei Yunyun1, Zhang Jianjun2, Wang Dong2

1Fourth Clinical College of Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 2Tianjin Fourth Central Hospital, Tianjin 300140, China

Received:2020-10-15 Revised:2020-10-17 Accepted:2020-11-21 Online:2022-01-08 Published:2021-10-23
Contact: Wang Dong, Chief physician, Master’s supervisor, Tianjin Fourth Central Hospital, Tianjin 300140, China
About author:Mei Yunyun, Master candidate, Fourth Clinical College of Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
高压氧治疗：是一种物理性疗法，通过将患者置于比大气压高的气压仓环境内进行吸氧，从而增加患者血液中含氧量来实现治疗的目的，能够减少继发性脊髓损伤，最大限度地保留受损脊髓残存的结构和功能；同时高压氧改善脊髓损伤区域的微环境，有利于移植细胞的增殖和分化。
RNA干扰：是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默。

背景：高压氧治疗和Nogo-A/NgR-RhoA/ROCK信号通路的抑制有助于移植细胞的增殖、分化。
目的：探讨高压氧联合携带miRNA沉默NgR基因的大鼠骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤修复的影响。
方法：靶向NgR的miRNA重组质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞，RT-qPCR和Western blot检测转染后NgR的表达。80只SD大鼠，随机选取15只大鼠作为假手术组，其余65只大鼠构建脊髓损伤模型，将造模成功的60只大鼠随机分为脊髓损伤组、高压氧组、骨髓间充质干细胞组和高压氧+骨髓间充质干细胞组。骨髓间充质干细胞组和高压氧+骨髓间充质干细胞组于造模24 h后注射5×106个转染重组质粒的大鼠骨髓间充质干细胞(5 μL)，脊髓损伤组和高压氧组注射等体积的PBS，随后高压氧组和高压氧+骨髓间充质干细胞组接受连续7 d高压氧治疗。细胞移植后采用BBB评分评估大鼠后肢运动功能，每周1次，连续4周；造模后第4周，检测感觉诱发电位评估神经传导恢复情况，苏木精-伊红染色、TUNEL染色和荧光金逆行追踪观察脊髓组织损伤、细胞凋亡以及轴突再生情况。高压氧治疗后随即对损伤区脊髓组织中Nogo-A、NgR、RhoA、ROCK-1、Lingo-1、p75NTR mRNA相对表达进行RT-qPCR检测。
结果与结论：①骨髓间充质干细胞转染后NgR表达明显下降；②造模后2-4周BBB评分：高压氧+骨髓间充质干细胞组>骨髓间充质干细胞组、高压氧组>脊髓损伤组(P < 0.05)；③与其他治疗组相比，高压氧+骨髓间充质干细胞组感觉诱发电位的潜伏期缩短，波幅升高(P < 0.05)；骨髓间充质干细胞组与高压氧组差异无显著性意义(P > 0.05)；④与脊髓损伤组比较，高压氧组和骨髓间充质干细胞组的神经元数量有所增加，具有轴浆运输能力的轴突数量也明显增多，神经元再生效果明显，凋亡细胞减少，而高压氧+骨髓间充质干细胞组的修复效果优于其他2个治疗组；⑤与脊髓损伤组相比，3个治疗组对Nogo-A/NgR/RhoA-ROCK信号通路相关mRNA相对表达起到明显的抑制作用，骨髓间充质干细胞组与高压氧组差异无显著性意义(P > 0.05)；⑥结果表明，高压氧联合NgR基因沉默骨髓间充质干细胞移植可抑制Nogo-A/NgR-RhoA/ROCK信号通路基因的表达，促进损伤部位轴突再生，改善大鼠电生理及运动功能。
https://orcid.org/0000-0002-0924-7451(梅运运)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, miRNA干扰, NgR, 高压氧, 脊髓损伤, 电生理, 运动功能

Abstract: BACKGROUND: Hyperbaric oxygen therapy and inhibition of Nogo-A/NgR-RhoA/ROCK signaling pathways are conducive to the proliferation and differentiation of transplanted cells.
OBJECTIVE: To explore the effects of hyperbaric oxygen plus rat bone marrow mesenchymal stem cells transplantation carrying miRNA silencing NgR gene on repair of rat spinal cord injury.
METHODS: Rat bone marrow mesenchymal stem cells were transfected using constructed miRNA recombinant plasmid targeting NgR. The expression levels of NgR were detected by real-time quantitative PCR and western blot assay after transfection. The 15 of 80 Sprague-Dawley rats were randomly selected as sham group and the remaining 65 rats were used to construct models of spinal cord injury; and 60 successful models were randomly divided into spinal cord injury group, hyperbaric oxygen group, rat bone marrow mesenchymal stem cells group and rat bone marrow mesenchymal stem cells plus hyperbaric oxygen group. The rat bone marrow mesenchymal stem cells group and hyperbaric oxygen plus rat bone marrow mesenchymal stem cells group were injected with 5 μL rat bone marrow mesenchymal stem cells suspension (5×106 cells) after 24 hours, respectively, and the spinal cord injury and hyperbaric oxygen groups were injected with PBS of the same volume. The hyperbaric oxygen and hyperbaric oxygen plus rat bone marrow mesenchymal stem cells group received continuous treatment for 7 days. The hind limb motor function was evaluated by Basso Beattie Bresnahan score before and after the modeling, once a week, for 4 consecutive weeks. After 4 weeks of modeling, somatosensory evoked potential testing was performed to detect the recovery of neural conduction. The histopathological damage, apoptosis of cells and axon regeneration in spinal cord tissues was observed by hematoxylin-eosin staining, TUNEL staining and fluorescent gold retrograde tracing, respectively. After hyperbaric oxygen therapy, the mRNA relative expression levels of Nogo-A, NgR, RhoA, ROCK-1, Lingo-1 and p75NTR were detected by real-time quantitative PCR around the injured region.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) An obvious decrease was found in NgR expression levels after rat bone marrow mesenchymal stem cells transfection. (2) Basso Beattie Bresnahan score of 2 to 4 weeks after modeling: hyperbaric oxygen plus rat bone marrow mesenchymal stem cells group > rat bone marrow mesenchymal stem cells group and hyperbaric oxygen group > spinal cord injury group (P < 0.05). (3) The latency of somatosensory evoked potential was shortened and the amplitude of somatosensory evoked potential was increased in hyperbaric oxygen plus rat bone marrow mesenchymal stem cells group compared with other treatment groups (P < 0.05). There was no significant difference in latency and amplitude of somatosensory evoked potential between the rat bone marrow mesenchymal stem cells group and the hyperbaric oxygen group (P > 0.05). (4) Compared with the spinal cord injury group, the number of neurons increased; the number of axons increased; the regeneration effect of neurons was obvious and the apoptosis was reduced in the hyperbaric oxygen group and rat bone marrow mesenchymal stem cells group. The repair effect was better in the hyperbaric oxygen plus rat bone marrow mesenchymal stem cells group than that in other two treatment groups. (5) The mRNA relative expression of Nogo-A/NgR/RhoA-ROCK signaling pathway was significantly inhibited in hyperbaric oxygen plus rat bone marrow mesenchymal stem cells group, rat bone marrow mesenchymal stem cells group and hyperbaric oxygen group compared with the spinal cord injury group, but there was no significant difference between hyperbaric oxygen group and rat bone marrow mesenchymal stem cells group (P > 0.05). (6) In summary, hyperbaric oxygen combined with NgR gene silencing rat bone marrow mesenchymal stem cells transplantation can inhibit the gene expression of Nogo-A/NgR/RhoA-ROCK signaling pathway, promote axon regeneration and improve the electrophysiological function and locomotor function of rats.

Key words: stem cells, bone marrow mesemchymal stem cells, miRNA interference, NgR, hyperbaric oxygen, spinal cord injury, electrophysiology, motor function

中图分类号:

梅运运, 张建军, 王东. 高压氧联合NgR基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 12-19.

Mei Yunyun, Zhang Jianjun, Wang Dong. Hyperbaric oxygen combined with NgR gene silencing bone marrow mesenchymal stem cells transplantation for spinal cord injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(1): 12-19.

图/表（结果） 14

2.1 BMSCs体外培养及鉴定结果原代细胞生长48 h后，有大量梭形细胞开始贴壁生长，见图1A。几次半量换液后，待细胞融合度达到90%，传代培养24 h后细胞多呈梭形或扁平样，见图1B。细胞纯度鉴定结果显示CD54、CD90阳性，CD45阴性(细胞比例> 97%)，达到实验所需的BMSCs纯度，见图2。

2.2 NgR干扰效果的分子验证 RT-qPCR结果显示，重组质粒组的NgR mRNA 表达明显低于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3；Western blot结果显示，重组质粒组的NgR蛋白表达也显著低于对照组，见图4；结果说明miRNA对NgR干扰抑制成功。

2.3 实验动物数量分析参加实验大鼠共80只，随机选取15只为假手术组，其余65只大鼠进行脊髓损伤模型构建，造模后观察大鼠运动情况，剔除造模失败的大鼠5只，造模成功60只大鼠。
2.4 BBB评分高压氧+BMSCs组在造模后2周开始BBB评分且明显高于其他治疗组，说明高压氧联合NgR基因沉默的BMSCs移植对脊髓损伤大鼠起到较好的治疗作用；从时间趋势上看，脊髓损伤大鼠有自身恢复的趋势，但与假手术组比较，损伤仍很严重。虽然BMSCs组BBB评分要比高压氧组略高，但两组数据差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.5 体感诱发电位各组大鼠体感诱发电位测量及统计分析结果，见图5和表3。脊髓损伤组与假手术组比较，体感诱发电位的潜伏期增加，波幅下降，差异有显著性意义(P < 0.01)；与脊髓损伤组相比，高压氧组、BMSCs组和高压氧+BMSCs组体感诱发电位的潜伏期缩短，波幅升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；高压氧+BMSCs组与其他治疗组相比，体感诱发电位的潜伏期缩短，波幅升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；高压氧组与BMSCs组相比，差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.6 荧光金逆行示踪结果应用IPP对阳性细胞做半定量统计，结果见图6。假手术组神经元被大量标记，提示神经纤维与脊髓神经元结构保持正常，具有完整的轴浆运输能力；脊髓损伤组被标记的神经元数量较假手术组显著降低，提示神经纤维与脊髓神经元之间的联系较差，轴浆运输能力减弱，轴突数量减少；与脊髓损伤组比较，高压氧组和BMSCs组的神经元数量有所增加，具有轴浆运输能力的轴突数量也明显增多，而高压氧+BMSCs组的修复神经元数量较其他2个治疗组更多，见图7。

2.7 苏木精-伊红染色结果脊髓损伤组可见明显脊髓空腔形成、病理性出血、水肿、坏死以及神经束间隙增加。与脊髓损伤组比较，高压氧组和BMSCs组损伤区脊髓空腔变小，神经束间隙减小；高压氧+BMSCs组较脊髓损伤组脊髓组织内细胞数目增多，空腔明显变小，见图8。

2.8 TUNEL染色结果对神经元和神经胶质细胞凋亡情况做半定量分析，见图9，10。假手术组只有少量神经细胞凋亡，脊髓损伤组神经元凋亡数量远大于假手术组，差异有显著性意义(P < 0.01)，高压氧组、BMSCs组的神经元凋亡数量较脊髓损伤组有所减少，差异有显著性意义(P < 0.05)，高压氧+ BMSCs组与脊髓损伤组比较，凋亡神经细胞数量显著降低，差异有非常显著性意义(P < 0.01)，高压氧+BMSCs组分别与高压氧组和BMSCs组比较，神经细胞凋亡数量也有所降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.9 RT-qPCR结果与假手术组比较，脊髓损伤组Nogo-A，NgR，ROCK-1，p75NTR，Lingo-1，RhoA mRNA的表达量显著升高，差异有显著性意义(P < 0.01)。与脊髓损伤组比较，3个治疗组Nogo-A，NgR，ROCK-1，p75NTR，Lingo-1，RhoA mRNA的表达量均显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。与高压氧组比较， BMSCs组的NgR mRNA表达量明显下降(P < 0.05)，而其余结果差异无显著性意义(P > 0.05)，见表4。

2.10 生物相容性见表5。

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(责任编辑：MZH，ZN，JY)

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2018年12月至2020年1月在天津市第四中心医院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 80只清洁级成年雌性SD大鼠(体质量280-320 g)和20只清洁级3周龄SD大鼠(体质量80-100 g)购自天津医科大学动物实验中心，前者用于模型制作，后者用于获取BMSCs。所有实验方案均通过天津医科大学动物伦理委员会讨论通过后实施。所有实验动物都采用独立笼位饲养，饲养室温度为20-25 ℃，湿度30%-70%，光照昼夜交替12 h。
1.3.2 实验试剂和仪器 Trizol试剂盒(BioTNT公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；苏木精-伊红染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；PCR仪(江苏和创生物科技有限公司)；胰蛋白酶(美国Sigma公司)；DMEM/F12培养基、胎牛血清、PBS(Hyclone公司)；兔抗鼠NgR抗体(艾康生物技术(杭州)有限公司)；台式离心机(德国SIGMA有限公司)；YKY-1200型倒置二激发荧光显微镜(上海永科光学仪器有限公司)；反转录试剂盒(杭州博日科技有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 BMSCs的分离、培养及鉴定无菌条件下取出3周龄SD大鼠股骨和胫骨，剪掉股骨和胫骨的骨骺端，露出骨髓腔，用注射器吸取含10%双抗的DMEM/F12培养基冲出骨髓，离心(1 000 r/min×5 min)，弃上清，用完全培养基(含体积分数为20%胎牛血清、2%双抗的DMEM/F12)将细胞浓度调整为108 L-1-109 L-1，接种至T25细胞培养瓶中，置于培养箱(37 ℃、体积分数为5% CO2)内培养。48 h后观察到部分细胞贴壁，细胞进行半量换液，之后每隔2 d进行半量换液，直至细胞融合度达到90%可进行消化传代。取第3代BMSCs利用流式细胞术进行表面标记物鉴定(CD45-PE-Cy7、CD54-PE、CD90-FITC)，流式细胞仪直接输出报告，阳性率90%以上为纯度较高的BMSCs。

1.4.2 靶向NgR基因的miRNA重组质粒构建并转染BMSCs
根据GeneBank中NgR的序列，合成特异性靶向NgR的miRNA序列，其上游序列为5'-TGC TGT CAG TGA GCT GAT TGG TCT GGG TTT TGG CCA CTG ACT GAC CCA GAC CAC AGC TCA CTG A-3'，下游序列为5'-CCT GTC AGT GAG CTG TGG TCT GGG TCA GTC AGT GGC CAA AAC CCA GAC CAA TCA GCT CAC TGA C-3'。将序列退火成双链，利用载体构建试剂盒BLOCK-iTTM pol II miRNAi Expression Vector Kit/EmGFP(Invitrogen公司)进行重组克隆，将双链oligo各自插入到miRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGPFmiR中，转化到感受态细胞DH5ɑ。取对数生长期的BMSCs接种于6孔板中，待细胞融合度达到85%，加入转染试剂Lipo-3000及质粒复合物(比例为5 µg∶10 µL)，4 h后加入新鲜的DMEM/F12培养液，实验分为2组：阴性质粒对照组和重组质粒组。转染48 h后，收集细胞，利用RT-qPCR和Western blot检测NgR的表达，具体操作参照以往发表的文献[9]。
1.4.3 大鼠脊髓损伤造模按30 mg/kg腹腔注射1%异戊巴比妥钠麻醉，俯卧位固定在操作台上，以T9棘突为中心行后背正中切口，长约3 cm，分离软组织并显露T9椎板，咬除T8-10棘突及椎板，充分暴露椎管及硬膜囊，剪开硬膜，用自制的Allen’s打击器对准T9表面进行打击，逐层缝合。如若见大鼠双下肢及尾巴在痉挛性摆动后呈迟缓性瘫痪、硬脊膜完整但出现局部淤血则表明大鼠脊髓损伤打击成功。术后当天开始，每只大鼠每天腹腔注射氨苄西林4万U，
连续注射3 d。术后辅助排尿，6-8 h/次，3次/d，直到恢复自主排尿为止。假手术组仅行T10椎板切除。
1.4.4 实验分组按随机数字表法将80只SD大鼠分为假手术组(15只)和脊髓损伤模型组(65只)。选取造模成功的60只大鼠，随机分为脊髓损伤组、高压氧组、BMSCs组与高压氧+BMSCs组，每组15只。预先准备好miRNA干扰后的BMSCs，调整细胞浓度为1012 L-1；术后24 h，BMSCs组与高压氧+BMSCs组采用33号汉密尔顿注射器鞘内注射5×106个转染重组质粒的BMSCs(5 μL)到T10节段脊髓，脊髓损伤组与高压氧组鞘内注射5 μL 0.01 mol/L PBS，随后高压氧组和高压氧+BMSCs组开始高压氧治疗。
1.4.5 高压氧干预将大鼠置于GB-150型钢制实验动物高压氧舱内，纯氧加压至0.02 MPa(表压)洗舱10 min，然后在20 min内匀速加压至0.2 MPa，稳压90 min，中间用氧通风5 min，舱内氧浓度保持在80%-85%水平，温度控制在22 ℃左右，相对湿度维持在60%-80%，实验大鼠经吸氧80 min后，在20 min匀速减压后出舱，1次/d，共治疗7 d。
1.4.6 行为测试采用Basso-Beattie-Bresnahan (BBB)评分量表评定脊髓损伤大鼠移植后运动功能恢复情况，移植后每周进行1次，连续4周。各组大鼠后肢运动功能评定由两人双盲评估，最后取两人评分的平均值(评定时间统一为每周上午9：00)。BBB评分总分21分，评分越高后肢运动功能恢复越好。
1.4.7 体感诱发电位检测造模后第4周，每组各取3只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，将其平放于水平面上，记录电极埋入前囟门皮下，参考电极埋入前囟门下5 mm处，刺激电极置于后肢上。在刺激电极上给予5-15 mA、0.5 ms波宽、3 Hz频率、叠加次数50-60次直流方波电脉冲刺激，并记录潜伏期及波幅的变化。体感诱发电位测定完毕，取下电极，缝合外皮，并用碘伏在缝合处消毒，放回笼内，注意保温，待苏醒后正常饲养。
1.4.8 荧光金逆行示踪造模后第4周，每组随机取5只大鼠，麻醉后显露坐骨神经，剥离腓总神经，组织钳夹断，在避光条件下，在神经断口末端注射4%荧光金溶液，吸收约50 min，每侧坐骨神经吸收总量约4 μL；注射完毕后，切口注射青霉素盐水，缝合切口，术后正常饲养。1周后取损伤远端新鲜脊髓样本制成冰冻切片，在荧光显微镜下观察荧光金标记细胞的分布情况。应用Image Pro Plus(IPP)图片分析软件对阳性细胞做半定量统计，计算吸光度值。
1.4.9 组织学观察造模后第4周，每组取5只大鼠，尾静脉注射致死剂量的10%水合氯醛处死实验动物，取损伤中心上下各 25.0 mm的脊髓标本，40 g/L多聚甲醛溶液固定，乙醇梯度脱水，石蜡包埋后5 μm连续切片，常规苏木精-伊红染色及TUNEL染色后镜下观察脊髓损伤部位的组织形态学变化。应用IPP图片分析软件对细胞凋亡情况进行分析，每张切片随机选取5个视野，计算吸光度值，最后求出平均值。
1.4.10 RT-qPCR检测脊髓损伤区周围Nogo-A，NgR，p75NTR，Lingo-1，RhoA及ROCK-1基因表达高压氧治疗后随即从每组中随机选取5只大鼠。在EP管中加入1 mL TriZol，做好标记后放入于冰盒内，将脊髓损伤组织剪碎，与液氮一起进行研磨，然后转到EP管，按照相关说明进行操作，得到总RNA，然后反转录为cDNA：首先取一灭菌的无RNA酶的EP管，加入以下组分：1 μL Oligo(dT)15引物，3 μL样本RNA，6 μL无核酸酶水，离心、振荡混匀，置于70 ℃预变性5 min，随即放入冰盒中，然后向每个样品管中加入10 μL配置好的RT-Mix(4 μL RT缓冲液，1 μL PCR Nucleotide Mix，1 μL GoScriptTM反转录酶，0.4 μL重组核糖核酸酶抑制剂，1 μL RT-Mix，6 μL无核酸酶水，2 μL MgCl2)，25 ℃退火5 min，42 ℃延伸60 min，70 ℃失活15 min，于4 ℃终止。将cDNA进行PCR扩增，整个过程按照试剂盒的说明进行。设计qPCR引物序列见表1。PCR反应条件为：95 ℃下预变性5 min，95 ℃下变性15 s，60 ℃下延伸1 min，共35-40个循环，最后72 ℃下延伸10 min，于4 ℃保存。采用2-ΔΔCT法对mRNA表达进行定量分析。

1.5 主要观察指标 ①大鼠后肢运动功能；②大鼠神经电生理恢复情况；③大鼠脊髓损伤部位的组织形态学变化；④大鼠脊髓损伤区周围Nogo-A，NgR，p75NTR， Lingo-1，RhoA，ROCK-1 mRNA表达量。
1.6 统计学分析实验结果以x±s表示。采用Graphpad prism 5
软件对实验数据进行统计分析，多组均数比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

由于脊髓损伤后人类中枢神经系统轴突无法自行修复，任何损伤对它来说都是永久性的，并可能造成损伤以下感觉和运动功能的丧失，对人类健康造成严重损害，也增加了患者及家属经济负担[10]。干细胞移植是修复损伤神经系统的研究热点，而BMSCs现已成为基因转染治疗脊髓损伤的首要载体，移植到损伤区可起到连接桥的作用，有利于损伤上下神经回路的重建。此外，间充质干细胞可以迁移到组织损伤部位，具有很强的免疫抑制特性，可以成功用于自体移植和异体移植，而不需要药理免疫抑制[11]。
许多研究表明脊髓损伤后功能恢复很大程度取决于损伤后抑制性环境的改变、重要的上下行纤维轴突再生、神经回路的重建以及抑制继发性损伤引起的炎症、细胞凋亡等[12-19]。如何控制细胞凋亡、神经胶质瘢痕形成和轴突再生仍是一个具有挑战性的课题。BMSCs联合治疗脊髓损伤的策略，例如基因修饰的BMSCs，可以专注于增加内在轴突的生长，同时减少轴突再生的抑制性环境[4]。这种抑制性环境主要与NgR介导的信号通路密切相关，脊髓损伤后髓鞘分泌各种轴突生长抑制剂，如Nogo-A等，与NgR/p75NTR/LINGO-1复合物结合，通过一系列信号级联通路和其他旁路激活RhoA/ROCK通路，导致生长锥塌陷和神经突生长抑制[20-22]。通过基因修饰的方法抑制NgR信号通路已经显示出可促进脊髓损伤后轴突再生和功能恢复[23-27]。前期的实验研究也表明，NgR基因沉默后神经干细胞移植与单纯神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤相比，无论从组织学上还是功能上疗效都有明显提高[28]。LI等[29]
研究证实了通过基因沉默来抑制间充质干细胞中NgR的表达，促进了间充质干细胞分化和增殖，提高了间充质干细胞移植修复中枢神经系统损伤的疗效。
高压氧治疗是一种安全的无创方式，增加组织和微血管的氧含量，有研究表明高压氧能促进内源性和外源性干细胞存活，增加多种神经营养因子和脊髓再生相关基因的表达，促进干细胞的分化并诱导它们向损伤部位迁移[30]。Nogo-A和MAG与NgR相互作用可抑制神经干细胞向神经元分化，可能的机制是通过激活mTOR-STAT3途径介导的[31-32]；药理实验表明，Nogo-66/NgR相互作用可抑制神经干细胞的增殖[33]。
上述结果说明了高压氧和抑制NgR表达可能有促进BMSCs增殖和向神经元分化的能力，该实验着重研究二者对于轴突再生以及微环境改善的作用，还需要进一步研究二者对BMSCs增殖和分化的影响。
通过对大鼠运动功能评分发现，NgR敲低的BMSCs移植对脊髓损伤具有很好的恢复作用，与高压氧疗法相比，效果似乎更明显，但二者并无显著差异。高压氧联合NgR敲低的BMSCs移植治疗效果却十分显著，大鼠的运动功能恢复很快，第2周开始，瘫痪的后肢便能大幅度灵活运动，且具备一定的行走能力。从各项检测结果中发现，高压氧联合细胞治疗后损伤区坏死、水肿、空腔明显减小，甚至消失，细胞凋亡明显减少，轴突数量明显增多，说明NgR敲低与高压氧联合治疗的效果要比单纯高压氧或者细胞移植疗法更显著。如前所述，NgR的表达会抑制神经轴突生长，且在各种脊髓损伤疾病中，Nogo-A，NgR、RhoA、ROCK-1，Lingo-1、p75NTR的表达显著上调，并在损伤后1周左右达到峰值[34-36]，结果显示除了移植组和联合组外，高压氧组对NgR信号通路相关mRNA表达也起到明显的抑制作用。
总之，在脊髓损伤大鼠模型中，将miRNA干扰抑制的NgR基因敲低BMSCs导入大鼠体内，并加以高压氧治疗，显著增加了脊髓神经纤维的修复能力与速度，促进神经元轴突生长，对大鼠运动功能的恢复起到强有力的作用，较单纯的高压氧疗法更有治疗和应用前景。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

高压氧联合NgR基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤

Hyperbaric oxygen combined with NgR gene silencing bone marrow mesenchymal stem cells transplantation for spinal cord injury in rats

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