不同诱导极化方式对大鼠骨髓来源巨噬细胞增殖、凋亡及吞噬能力的影响

doi:10.12307/2021.016

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (25): 4032-4037.doi: 10.12307/2021.016

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

不同诱导极化方式对大鼠骨髓来源巨噬细胞增殖、凋亡及吞噬能力的影响

李莉1，2，卓瑾1，2，郑玲3，周玲4，王启松1，2，罗岚2，骆凯2

1福建省口腔疾病研究重点实验室，福建省口腔生物材料工程技术研究中心，福建省高校口腔医学重点实验室，福建省福州市 350002；2福建医科大学口腔医学研究院，福建医科大学口腔组织工程研究中心，福建医科大学附属口腔医院，福建省福州市 350002；3福建武警总队医院，福建省福州市 350003；4福建省级机关医院，福建省福州市 350003

收稿日期:2020-07-13 修回日期:2020-07-13 接受日期:2020-08-22 出版日期:2021-09-08 发布日期:2021-03-27
通讯作者: 罗岚，硕士，医师，福建医科大学口腔医学研究院，福建医科大学口腔组织工程研究中心，福建医科大学附属口腔医院，福建省福州市 350002
作者简介:李莉，女，1994年生，福建省尤溪县人，汉族，博士研究生，主要从事牙周病方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81870766)，项目负责人：骆凯；福建省科技创新联合资金项目(2016Y9023)，项目负责人：骆凯；福建省卫生计生委青年科研项目(2016-1-72)，项目负责人：罗岚

Effects of different induced polarization methods on the proliferation, apoptosis and phagocytosis of rat bone marrow-derived macrophages

Li Li1, 2, Zhuo Jin1, 2, Zheng Ling3, Zhou Ling4, Wang Qisong1, 2, Luo Lan2, Luo Kai2

1Fujian Key Laboratory of Oral Diseases & Fujian Provincial Engineering Research Center of Oral Biomaterial & Stomatological Key Laboratory of Fujian College and University, Fuzhou 350002, Fujian Province, China; 2Institute of Stomatology, Fujian Medical University & Center of Oral Tissue Engineering, Fujian Medical University & Hospital of Stomatology, Fujian Medical University, Fuzhou 350002, Fujian Province, China;

Received:2020-07-13 Revised:2020-07-13 Accepted:2020-08-22 Online:2021-09-08 Published:2021-03-27
Contact: Luo Lan, Master, Physician, Institute of Stomatology, Fujian Medical University & Center of Oral Tissue Engineering, Fujian Medical University & Hospital of Stomatology, Fujian Medical University, Fuzhou 350002, Fujian Province, China
About author:Li Li, Doctoral candidate, Fujian Key Laboratory of Oral Diseases & Fujian Provincial Engineering Research Center of Oral Biomaterial & Stomatological Key Laboratory of Fujian College and University, Fuzhou 350002, Fujian Province, China; Institute of Stomatology, Fujian Medical University & Center of Oral Tissue Engineering, Fujian Medical University & Hospital of Stomatology, Fujian Medical University, Fuzhou 350002, Fujian Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81870766 (to LK); the Science and Technology Innovation Joint Fund Project of Fujian Province, No. 2016Y9023 (to LK); the Youth Scientific Research Project of Fujian Health and Family Planning Commission, No. 2016-1-72 (to LL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨髓源性巨噬细胞：人骨髓来源巨噬细胞分离自骨髓，骨髓细胞中存在未分化的巨噬细胞前体，通过加入巨噬细胞集落刺激因子来分化培养出巨噬细胞。巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在适宜条件下可生活两三周，多用做原代培养，难以长期生存。
吞噬作用：高等动物具有一些特化的吞噬细胞，包括巨噬细胞和中性粒细胞。它们通过吞噬菌体摄取和消灭感染的细菌、病毒、损伤的细胞、衰老的红细胞。吞噬作用是生物体最古老的，也是最基本的防卫机制之一。对于其要消灭的对象无特异性，在免疫学中称之为非特异性免疫作用。

背景：经典激活巨噬细胞和替代激活巨噬细胞具有不同的表型和功能，目前尚鲜有研究探讨不同诱导方式对骨髓来源巨噬细胞生物学功能的影响。
目的：探讨不同诱导极化方式对大鼠骨髓来源巨噬细胞生物学行为的影响。
方法：通过原代细胞形态学观察、瑞氏染色和流式细胞术对体外分离培养的大鼠骨髓来源巨噬细胞进行鉴定。经γ-干扰素和脂多糖、白细胞介素4分别诱导激活24 h，倒置显微镜观察细胞形态，Real time-PCR检测细胞表面标记物Nos2和Arg1的表达，CCK-8法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡水平，中性红染色鉴定细胞吞噬功能。
结果与结论：经γ-干扰素和脂多糖联合刺激的骨髓来源巨噬细胞高表达M1型细胞表面标记物Nos2，可促进细胞凋亡并且降低细胞的吞噬功能；而经白细胞介素4刺激的骨髓来源巨噬细胞则高表达M2型细胞表面标记物Arg1，提高细胞增殖和吞噬能力，抑制细胞凋亡。结果表明，不同诱导极化方式可影响骨髓来源巨噬细胞的生物学行为。
https://orcid.org/0000-0003-4940-1203(李莉)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨髓, 巨噬细胞, 1型巨噬细胞, 2型巨噬细胞, 极化, γ-干扰素, 脂多糖, 白细胞介素4

Abstract: BACKGROUND: Classically activated and alternative activated macrophages have different phenotypes and functions, and there are few studies to explore the effect of different induction methods on the biological functions of bone marrow-derived macrophages.
OBJECTIVE: To explore the effect of different induced polarization ways on biological behaviors of bone marrow-derived macrophages from rats.
METHODS: Rat bone marrow-derived macrophages were isolated and cultured in vitro, and identified by morphological observation, Wright Giemsa staining and flow cytometry. After being induced and activated by interferon-γ, lipopolysaccharide and interleukin-4 for 24 hours, the morphology of bone marrow-derived macrophages was observed by inverted microscope. The expression levels of cell surface markers Nos2 and Arg1 were detected by real time-PCR. CCK8 assay was performed to determine the proliferation ability of bone marrow-derived macrophages. Flow cytometry was performed to detect the apoptosis, and neutral red staining was performed to identify the phagocytic function of bone marrow-derived macrophages.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow-derived macrophages that stimulated by interferon-γ and lipopolysaccharide were highly expressing the cell surface marker Nos2 of M1, and apoptosis of bone marrow-derived macrophages can be slightly promoted as well as the phagocytic function of bone marrow-derived macrophages is reduced; while bone marrow-derived macrophages stimulated by interleukin-4 are highly expressing the cell surface marker Arg1 of M2. Cell proliferation and phagocytosis of bone marrow-derived macrophages are promoted, and apoptosis of bone marrow-derived macrophages is inhibited. The results confirm that the biological behavior of bone marrow-derived macrophages can be affected by different methods of induced polarization.

Key words: bone marrow, macrophages, type 1 macrophages, type 2 macrophages, polarization, γ-interferon, lipopolysaccharide, interleukin-4

中图分类号:

李莉, 卓瑾, 郑玲, 周玲, 王启松, 罗岚, 骆凯. 不同诱导极化方式对大鼠骨髓来源巨噬细胞增殖、凋亡及吞噬能力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 4032-4037.

Li Li, Zhuo Jin, Zheng Ling, Zhou Ling, Wang Qisong, Luo Lan, Luo Kai. Effects of different induced polarization methods on the proliferation, apoptosis and phagocytosis of rat bone marrow-derived macrophages[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(25): 4032-4037.

图/表（结果） 7

2.1 大鼠BMMs的体外分离培养及鉴定
2.1.1 大鼠原代BMMs体外分离培养及形态观察巨噬细胞集落刺激因子诱导7 d后，倒置显微镜下可见到大量星形的贴壁细胞，部分有伪足和突起。瑞氏-姬姆萨染色结果显示：BMMs形态多样，以圆形为主，但也可见部分梭形、多边形和煎蛋样细胞，边界清晰有突起，细胞核着色较深，呈圆形、卵圆形或者肾形，偏居于细胞一侧；细胞质着色较浅，内含丰富的颗粒状物质，也可见空泡状的结构，见图1。

2.1.2 流式细胞术检测细胞表面抗原由图2可见，细胞表面抗原CD11b阳性率为97.4%，结合倒置显微镜下形态学观察及瑞氏-姬姆萨染色结果，其符合巨噬细胞的特征[8]。

2.2 不同表型大鼠BMMs的形态脂多糖和γ-干扰素处理24 h后的BMMs形态多样，由原本的以圆形细胞为主转变为以多样性细胞为主，大部分细胞伸出伪足，呈棒状、放射状和树枝状，伪足较为细长，细胞折光性降低。经白细胞介素4处理24 h后的BMMs呈聚集性生长，细胞黏附性增加，体积略微增大，伪足相对较短，见图3。

2.3 诱导极化后大鼠BMMs的生物学行为
2.3.1 大鼠BMMs表面标记物的表达 Real-time PCR结果显示，经脂多糖和γ-干扰素处理24 h后的BMMs高表达M1型巨噬细胞表面标记物Nos2，而M2型巨噬细胞表面标记物Arg1的表达与未处理组相比没有明显差异。经白细胞介素4处理24 h后的BMMs高表达M2型巨噬细胞细胞表面标记物Arg1，而Nos2则基本不表达，见图4。

2.3.2 大鼠BMMs的增殖能力 CCK-8法检测结果显示，经脂多糖和γ-干扰素处理24 h，BMMs的增殖能力与对照组相比没有显著差异；而经白细胞介素4处理24 h后可提高BMMs的增殖能力，与对照组比较差异有显著性意义，见图5。

2.3.3 大鼠BMMs的凋亡情况流式细胞术检测结果显示，脂多糖和γ-干扰素处理24 h均可促进BMMs的凋亡；而白细胞介素4处理24 h则抑制BMMs的凋亡，差异有显著性意义，见图6。

2.3.4 大鼠BMMs的吞噬能力倒置显微镜下观察中性红染色后的未激活、脂多糖和γ-干扰素激活、白细胞介素4激活的BMMs都表现出良好的吞噬活性，经脂多糖和γ-干扰素处理24 h，BMMs的吞噬能力降低，而经白细胞介素4处理24 h，BMMs的吞噬能力较未处理组增加，差异有显著性意义，见图7。

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引言

既往研究认为，在组织工程骨替代物植入后应尽可能避免引发宿主的免疫反应，但现有的观点认为，工程化植入物应充分利用免疫细胞的免疫反应使其在骨组织修复中发挥积极作用[1]。巨噬细胞是免疫系统中的重要组成细胞之一，也是植入物免疫反应中的主要效应细胞，巨噬细胞的高度异质性使其成为免疫系统中增强骨骼修复和再生的主要靶标[2-3]。研究表明，生理状态下的巨噬细胞很容易被激活，机体普遍存在不同亚群的巨噬细胞[4]。目前被学者们广泛认可的激活巨噬细胞的途径包括经典激活途径和替代激活途径，其中由γ-干扰素和脂多糖激活巨噬细胞的途径称为经典激活途径，激活后的巨噬细胞能够提高细胞免疫功能，增强其抗感染、抗肿瘤的能力；由白细胞介素4、白细胞介素13、糖皮质激素、免疫复合物以及白细胞介素10激活巨噬细胞的途径称为替代激活途径，激活后的巨噬细胞能够提高体液免疫功能，增强其抗炎、抗寄生虫的能力，并且有利于组织的修复与再生[5-6]。经典激活和替代激活的巨噬细胞又被称1型巨噬细胞(M1)和2型巨噬细胞(M2)，它们具有不同的表型和功能[7]，目前尚鲜有研究探讨不同诱导方式对骨髓来源巨噬细胞(bone
marrow-derived macrophages，BMMs)生物学功能的影响。该实验通过体外培养大鼠BMMs，比较未激活、γ-干扰素/脂多糖激活以及白细胞介素4激活的BMMs生物学行为的差异，为后续探讨如何调控巨噬细胞使其通过组织工程技术来实现骨组织再生。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。
1.2 时间及地点实验于2018年3月至2019年12月在福建省高校口腔医学重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物同批次4周龄雄性SD大鼠18只，体质量120-150 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005，大鼠饲养于中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院比较医学科，环境温度(23±2) ℃，湿度50%-60%，通风良好，12 h白昼和黑夜循环更替，按啮齿类动物标准饲料喂养，自由饮水摄食，适应性喂养1周后进行实验。该实验严格遵循福建医科大学动物伦理委员会准则。
1.3.2 实验试剂及仪器 DMEM培养液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(Hyclone，美国)；巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4、γ-干扰素(Pepro Tech，美国)；大肠杆菌055:B5的脂多糖、0.05%中性红(Sigma，美国)；链霉素、青霉素、红细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司，中国)；快速瑞氏-姬姆萨染液(南京建成科技有限公司，中国)；CD11b-FITC及同型对照抗体、总RNA抽提试剂(Invitrogen，美国)；CCK-8(同仁化学研究所，日本)；细胞凋亡检测试剂盒YF®488-Annexin V and PI Apoptosis Kit(苏州宇恒生物科技有限公司，中国)；反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM Kit(Takara，日本)；引物合成(上海生工工程股份有限公司，中国)；HEAL FORCE超净工作台(苏州净化设备有限公司，中国)；生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司，中国)；冷冻高速离心机、细胞培养箱(Heraeus，德国)；倒置荧光相差显微镜(Olympus，日本)；iMARK酶标仪(Bio-Rad，美国)；AccuriTM C6 Plus流式细胞仪(BD，美国)；实时荧光定量PCR仪(Roche LightCycler 480，德国)。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠BMMs的体外分离培养经腹腔注射氯胺酮
(100 mg/kg)麻醉处死大鼠，参照文献[8]方法于无菌操作下快速取出完整股骨及胫骨，去除附着的骨膜及筋肉，剪除干骺端，DMEM培养液从两端交替冲洗骨髓腔并收集冲洗液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重悬，经细胞筛过滤后离心，加入适量红细胞裂解液重悬，静置5 min，再次离心，重悬，PBS洗3遍，以含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素及30 μg/L巨噬细胞集落刺激因子的DMEM完全培养液重悬，置于培养箱中常规培养，每3 d更换培养液，倒置相差显微镜下观察并拍照，细胞生长达80%-90%融合时，以0.25%胰酶+0.02%EDTA消化细胞进行后续实验。
1.4.2 大鼠BMMs的鉴定
(1)流式细胞术检测细胞表面抗原：将大鼠BMMs以1×106个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞长至80%-90%融合，以0.25%胰蛋白酶消化，1 000×g离心5 min；加入PBS重悬，1 000×g离心5min，重复2次；加入PBS重悬，全自动细胞计数仪计数，每个 EP管中加入1×106个细胞；每个EP管中分别加入CD11b-APC及同型对照抗体，并加PBS补足100 μL，4 ℃冰箱中避光孵育30 min；1 000×g离心
5 min，弃上清，加入PBS重悬，1 000×g离心5 min，重复2次，去除未结合的抗体；100 μL PBS重悬后上机检测，并使用Flowjo软件对结果进行分析。
(2)瑞氏-姬姆萨染色：将大鼠BMMs以1×105个/孔的密度接种于24孔板中，待细胞贴壁后，40 g/L多聚甲醛于室温下固定20 min，按照瑞氏-姬姆萨染液操作说明：滴加试剂一3-5滴，使其迅速盖满皿底，染色1 min左右；不要丢弃试剂一，直接滴加试剂二6-10滴，轻摇孔板使染液充分混合，染色5-8 min，水洗30 s，待干后倒置相差显微镜下观察拍照。

1.4.3 大鼠BMMs的诱导极化使用100 μg/L脂多糖和30 μg/L
γ-干扰素诱导大鼠BMMs向经典活化的M1型巨噬细胞极化(γ-干扰素和脂多糖诱导激活组)；使用10 μg/L白细胞介素4诱导大鼠BMMs向替代活化的M2型巨噬细胞极化(白细胞介素4诱导激活组)；空白对照组大鼠BMMs正常培养。
1.4.4 诱导极化后大鼠BMMs的生物学功能
(1)大鼠BMMs表面标记物的表达：将生长状态良好的大鼠BMMs以4×105个/孔的密度接种于6孔板，待细胞长至80%-90%融合，更换极化诱导液(根据1.4.3配制)24 h后，吸弃培养液，PBS清洗3次，采用Trizol提取细胞的总RNA，经反转录合成cDNA。按照试剂盒说明书操作，采用Real-time PCR检测3组BMMs极化表面标志物基因Nos2和Arg1的表达量，以Gapdh为内参。引物序列见表1。

(2)大鼠BMMs的增殖能力：将大鼠BMMs以3×103个/
孔的密度种于96孔板，待其贴壁后，更换极化诱导液，待大鼠BMMs诱导极化24 h后采用CCK-8检测各组细胞的增殖能力。即取3组细胞各6孔，根据CCK-8试剂盒操作说明，每孔加入200 μL新鲜配置CCK-8溶液，37 ℃孵育4 h后用酶标仪于450 nm波长处测定吸光度值。
(3)大鼠BMMs凋亡检测：将大鼠BMMs以1×106个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞长至80%-90%融合，更换极化诱导液24 h后，对消化后的细胞进行Annexin V和PI染色，并通过流式细胞仪进行检测。
(4)大鼠BMMs的吞噬能力：将大鼠BMMs以5×103个/
孔的密度接种于96孔板中，待细胞长至80%-90%融合，更换极化诱导液24 h后，将培养基替换为含有0.05%中性红的PBS，持续30-40 min，待细胞充分染色后，将其洗涤，倒置相差显微镜下观察拍照。然后用1∶1体积混合的乙酸和乙醇溶液裂解细胞，用酶标仪于540 nm波长处测定吸光度值。
1.5 主要观察指标各组大鼠骨髓巨噬细胞增殖、凋亡及吞噬能力。
1.6 统计学分析采用SPSS 21.0统计软件进行统计分析。数据以x±s表示，采用单因素方差分析，分析前检验各指标数据正态性和方差齐性。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

免疫细胞在骨骼发育和修复中起着至关重要的作用[9]。现有研究认为，免疫细胞(特别是巨噬细胞)的免疫调节作用在利用组织工程技术实现骨修复再生过程中发挥重要的作用[10]。研究表明巨噬细胞具有高度异质性，可受细胞所处微环境中细胞因子和炎性分子的作用极化为不同的表型[11-12]。经典激活的巨噬细胞(M1)可分泌促炎因子和活性氧，并且可以迁移到炎症部位，成为宿主防御的一部分；替代激活的巨噬细胞(M2)则可通过产生抗炎细胞因子和吞噬凋亡细胞而在免疫稳态中发挥作用[13]。当前，通过调控巨噬细胞极化对炎性疾病进行防治的相关研究正为学者们所关注[14]。
鉴于M1型巨噬细胞在抗菌活性和M2型巨噬细胞在免疫调节中的作用，极化鉴定机制对于抵抗抗菌素耐药性和由免疫介导的病理过程也很重要[5]。研究显示牙周组织中 M1型和M2型巨噬细胞水平与牙周组织炎症密切相关，其中M2型向M1型巨噬细胞转换被认为可能是介导牙周组织破坏包括牙槽骨吸收的关键机制之一[15]。通过调控M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化可以调节组织过度炎症并促进组织再生修复[16]。已有研究开发了新型的靶向药物，通过将M1/M2型巨噬细胞调节至平衡状态来抑制成纤维细胞的过度活化，从而提高特发性肺纤维化疾病的治疗效果[17]。改变M1/M2型巨噬细胞的极化也被认为可以促进牙周组织的再生[18]。因此，课题组前期工作的基础上[8]，通过体外培养大鼠BMMs，比较未激活、γ-干扰素和脂多糖激活、白细胞介素4激活的BMMs生物学行为的差异。
细胞培养结果显示，所培养的细胞为椭圆形、马蹄形或者不规则形的单核细胞，细胞体形大并可观察到伪足，巨噬细胞集落刺激因子诱导7 d后流式细胞术检测结果显示细胞表面抗原CD11b的阳性率为97.4%，证实所培养的细胞为骨髓来源巨噬细胞[19]。使用γ-干扰素和脂多糖、白细胞介素4分别对BMMs进行刺激，使之分别极化为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。倒置显微镜下可见，经γ-干扰素和脂多糖作用后BMMs由原本的圆形细胞为主转变为以多样性细胞为主，大部分细胞伸出伪足，呈棒状、放射状和树枝状，伪足较为细长，细胞折光性降低；而经白细胞介素4作用的BMMs则表现为聚集性生长，细胞体积略微增大，伪足相对较短。
虽然Nos2和Arg1均可在活化的巨噬细胞中表达，但二者对L-精氨酸的代谢能力不同，Nos2可以将L-精氨酸代谢为瓜氨酸和一氧化氮，一氧化氮对破坏细胞内细菌DNA特别有效，有利于控制细胞内微生物病原体的复制，在细胞消灭微生物中发挥重要的作用，常作为M1型巨噬细胞的表面标记物之一[20-21]；而Arg1则可以将L-精氨酸代谢为尿素和鸟氨酸，后者通过产生多胺、谷氨酸和脯氨酸对胶原蛋白的合成至关重要，可促进细胞增殖、纤维化和伤口愈合，Arg1主要表达于M2型巨噬细胞中[22-23]。已有研究表明γ-干扰素和脂多糖激活的BMMs可增强细胞的抗菌能力，在促进急性炎症发生中发挥重要作用[24-25]；而白细胞介素4激活的BMMs则可抑制炎症的发生，同时有利于组织的修复和再
生[26-27]。该实验通过Real-time PCR检测发现，经γ-干扰素和脂多糖作用的BMMs高表达Nos2，其Arg1的表达量则未见明显改变，提示BMMs向M1型巨噬细胞极化；经白细胞介素4作用的BMMs则高表达Arg1，其Nos2的表达量显著降低，该结果提示经白细胞介素4作用后BMMs可向M2型巨噬细胞极化。
现有研究发现巨噬细胞产生的一氧化氮超过一定范围时，会抑制大多数细胞内病原体或附近细胞的功能或生存
力[28]。虽然巨噬细胞通过一氧化氮可抑制线粒体呼吸或细胞复制而对宿主起到保护的作用[20-21]，并且在某些情况下一氧化氮还可以诱导细胞凋亡[29]，但是也有学者指出，巨噬细胞自身也可能会受到其产生的一氧化氮的影响[30]。该实验通过CCK-8法和流式细胞术检测了未激活和不同方式诱导激活
24 h后BMMs的增殖能力和凋亡水平，结果显示，γ-干扰素和脂多糖激活的BMMs增殖能力未受到显著的影响，但细胞凋亡水平有略微的增加；而白细胞介素4激活的BMMs虽然在细胞增殖方面仅略高于未刺激组和γ-干扰素与脂多糖联合作用组，但在细胞凋亡方面则显著降低，这可能与一氧化氮对BMMs的作用有关。
巨噬细胞和嗜中性粒细胞以及树突状细胞一样，是专门的吞噬细胞，其在正常状态下就具有强大的吞噬功能，一方面通过吞噬异物发挥抗感染的作用，另一方面可通过吞噬和传递抗原进而介导适应性免疫应答过程[31-32]。该实验通过中性红染色发现，经典激活和替代激活BMMs在吞噬能力方面存在差异，γ-干扰素和脂多糖激活的M1型BMMs与未激活的BMMs相比，细胞的吞噬能力显著降低，而白细胞介素4激活的M2型BMMs的吞噬能力则有所提高，这与CHEN等[19]的实验结果一致。考虑到M1型巨噬细胞是炎症感染早期主要表达的巨噬细胞类型，而M2型巨噬细胞在组织修复阶段扮演重要的角色，作者推测机体在受到微生物感染的初期，BMMs可吞噬异物并释放促炎物质，这个过程可能会反过来抑制BMMs的吞噬功能，以避免炎症过度反应对机体造成损伤；而在炎症反应的末期，包括白细胞介素4在内的抗炎因子的产生可能是通过提高BMMs的吞噬功能在重建组织稳态方面发挥作用。
结论：经γ-干扰素和脂多糖、白细胞介素4诱导极化后的BMMs形态发生不同改变，经脂多糖和γ-干扰素处理24 h后的BMMs高表达M1型巨噬细胞细胞表面标记物Nos2，提高BMMs的凋亡水平并且抑制BMMs的吞噬功能；经白细胞介素4处理24 h后的BMMs高表达M2型巨噬细胞表面标记物Arg1，而Nos2则基本不表达，提高BMMs的增殖能力并且抑制其凋亡，促进BMMs的吞噬功能。综上所述，经γ-干扰素和脂多糖、白细胞介素4诱导极化后的BMMs在细胞增殖、凋亡及吞噬能力方面存在差异，如何利用上述差异应用组织工程技术实现骨再生仍需要进一步的深入研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

不同诱导极化方式对大鼠骨髓来源巨噬细胞增殖、凋亡及吞噬能力的影响

Effects of different induced polarization methods on the proliferation, apoptosis and phagocytosis of rat bone marrow-derived macrophages

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