2.1  骨髓间充质干细胞的形态及鉴定结果  分离纯化的细胞体外培养贴壁生长，72 h后大多数细胞呈梭形，细胞核呈椭圆形，可以明显看见核仁，培养10 d后细胞形态相对均匀，胞体呈梭形，细长形，排列呈漩涡状，见图1。

2.2  吉姆萨染色和CD29免疫组化染色结果  骨髓间充质干细胞经吉姆萨染色后观察到细胞核染成紫色，见图2。免疫组化染色显示95%细胞高表达CD29，可以确定分离的细胞为骨髓间充质干细胞，见图3。

2.3  苏木精-伊红染色结果  从图4可以观察到模型组大鼠视网膜细胞染色质及核酸呈紫蓝色，而胞质及细胞外基质呈粉红色，可清楚观察到视网膜细胞的成分及分布，符合视神经病变的一般形态结构特点；假手术组视网膜神经节细胞排列规律，具有清晰的纹理；模型组少数细胞排列紊乱，视网膜神经节细胞层的细胞核数目显著减少；移植组视网膜细胞成分分布规整，纹理清晰，与假手术组相比无明显差异。

2.4  免疫组化结果  从图5可以看出，模型组视网膜细胞排列不整齐，且Ox-42阳性染色小胶质细胞数目与假手术组和移植组相比明显增多和加深。假手术组、移植组有少量的小胶质细胞特异性标志物Ox-42和炎性因子TNF-α阳性表达，模型组视神经、视网膜中Ox-42和TNF-α高表达，阳性颗粒呈现棕黄色。

从图6可以看出，与假手术组相比，模型组视神经和视网膜中Ox-42、TNF-α高表达，差异有显著性意义(P < 0.05)。与模型组相比，移植组视神经和视网膜Ox-42、TNF-α表达明显降低，差异有显著性意义(P < 0.01)。

外伤性视神经损伤是指外伤时瞬间外力造成的视神经撕裂^[1]，表现为患者的视力呈现进行性下降的趋势，甚至引起视力永久性丧失，一半以上的患者双目失明。目前的治疗方法比较局限，现临床上主要采用激素冲击疗法^[2]，虽然这一疗法能够产生一定的作用，但仍缺乏相应依据^[3]，而且激素治疗会导致人体免疫力下降，因此需要去探索更好的治疗方法。

小胶质细胞(microglia，MG)是中枢神经系统中休眠的巨噬细胞^[4]，其在中枢神经系统中参与免疫和炎症反应^[5]。在神经病理条件下，小胶质细胞能够激活来维持中枢神经系统的稳定^[6-9]，但小胶质细胞过度活化会产生大量的炎症因子^[7]，使损伤进行性加重。

视神经作为中枢神经系统的一部分，其损伤是否也会引起小胶质细胞活化的类似反应，还需要进一步探究。由于小胶质细胞的过度活化可引起炎症反应加速视网膜损伤，因此需要对视神经损伤这一疾病更加深入探讨，力求从病理生理学方面解释其发病机制，并寻找出有效的治疗方法。视神经由视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)的轴突汇聚而成，因此视神经损伤即视网膜神经节细胞轴突损伤^[10-11]。研究证实，视网膜神经节细胞一旦损伤便不能正常再生，该实验拟从阻断神经节细胞的损伤进程展开研究，探讨损伤是否使小胶质细胞过度活化，力求通过特定方法阻断炎症损伤进程。

目前，干细胞移植技术的治疗方法获得了当今医学研究的重视^[10]，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有很多优点，如无免疫排斥反应、体外培养能够迅速增殖、分化潜能多种多样等^[12]，是较为理想的种子细胞^[13]。将骨髓间充质干细胞移植入眼球玻璃体后，是否能够发挥免疫调控作用，阻滞小胶质细胞的过度活化，从而减轻视神经损伤，对此课题组应用免疫组织化学等手段观察视神经损伤后所发生的一系列形态学及病理学方面的改变，探讨视神经损伤后小胶质细胞活化的机制以及骨髓间充质干细胞对其的调节作用，以改善视神经修复的内环境，使视力恢复成为可能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年7月至2018年12月在沈阳医学院动物部及中心实验室完成。

1.3  材料  

1.3.1  实验动物  健康1周龄SD大鼠2只，体质量15-   25 g，雌雄不限，用于骨髓间充质干细胞的分离；8周龄SD大鼠18只，体质量250-300 g，雌雄不限，用于构建模型，动物生产许可证号为SCXK(辽)2015-0001。

1.3.2  实验试剂和仪器  DMEM培养基、胎牛血清、磷酸盐缓冲液(Hyclone)；青霉素、链霉素(南京诺唯赞)；Ox-42、TNF-α多克隆抗体(ABclonal公司)；CO₂培养箱(Thermo)；倒置显微镜(XSZ-D2型，重庆)；MINI离心机(TOMY SEIKO)；医用低速离心机(安徽嘉文)。

1.4  实验方法

1.4.1  大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定  在无菌环境中取1周龄SD大鼠胫骨和股骨，切除其干骺端，用PBS冲洗骨髓腔，直至骨干发白，收集冲洗液反复吹打，置于离心管内，室温静置15 min，离心弃上清，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液重悬沉淀^[14]，以2×10⁸ L^-1细胞浓度接种至培养瓶内，放入37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱内常规培养，前3 d每天半量换液，弃掉不贴壁细胞，以后每2 d换液1次，每日观察细胞的生长情况，待7-9 d贴壁细胞将近90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养。

1.4.2  CD29免疫组化染色  取第3代细胞，待细胞长满70%融合后，吸去培养液，PBS冲洗3次，每次3 min，加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，加入1% Triton X-100 30 μL室温孵育10 min，PBS冲洗3次，每次5 min，吸去PBS，用油笔圈定细胞范围，滴加1滴内源性过氧化酶阻断剂，室温孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min，滴加1滴非特异性阻断剂，室温孵育10 min；加入1∶200比例稀释兔抗鼠CD29抗体，置于湿盒，4 ℃过夜，次日用PBS冲洗3次，每次3 min，滴加生物素标记的羊抗兔IgG聚合物室温孵育 1 h，PBS冲洗二抗，滴加链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶室温孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min；滴加DAB显色试剂，显微镜下控制反应时间，待细胞着色浅棕色时，吸去显色液，流水冲洗5 min，苏木精复染细胞核，1%盐酸乙醇分化5 s，自来水冲洗返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。

1.4.3  吉姆萨染色  取第3代70%融合的细胞爬片，多聚甲醛固定，吉姆萨母液按1∶10的倍数加入蒸馏水混合滴在染色片上染色20 min，弃染色液，PBS漂洗干净，系列乙醇脱水，每次3 min，二甲苯透明，中性树脂封固。

1.4.4  视神经损伤动物模型制作、骨髓间充质干细胞移植及取材  将8周龄SD大鼠分为移植组、模型组和假手术组，每组6只，模型组选取左眼进行视神经钳夹造模，视神经钳夹术后15 d全部处死，在灌流固定后取视网膜连带视神经用于免疫组织化学检测；假手术组只分离视神经，术后正常饲养，至上述同一时间后处死。

视神经损伤动物模型制作：按3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉，在手术显微镜下进行手术操作，在大鼠上眼睑中心垂直切入向上延伸1 cm左右，再向两侧横向切开，同样长约1 cm，使眼睑上缘的切口呈“T”字形^[15]，缓慢剪开穹窿处结膜，向上逐渐分离，寻找视神经鞘膜并将其剪开，暴露出视神经，长度约2.5 mm，用反向镊于球后约2 mm处以40 g的夹持力垂直于视神经水平轴夹持视神经10 s，构建视神经损伤模型。结膜切口不缝合可自行愈合。术后可见瞳孔散大，直接镜检显示无视网膜出血，无其他部位损伤，即完成造模。手术结束后涂抹迪可罗眼膏，将大鼠置于无污染环境下，于37 ℃保温垫上至大鼠意识恢复可自行进食饮水。

骨髓间充质干细胞移植：移植组选取左眼进行视神经钳夹造模，在损伤后立即向左眼玻璃体内注入第3代骨髓间充质干细胞(注入细胞1×10⁸，细胞量为2 μL)，模型组、假手术组玻璃体内注入等量的PBS，术后15 d全部处死。

取材：术后15 d大鼠麻醉后以仰卧位固定，取出眼球，注意留存视神经。制作冰冻切片：取出视网膜后将其浸泡在40 g/L多聚甲醛中固定24 h^[15]，然后放至20%蔗糖溶液中脱水24 h，再转移至30%蔗糖溶液中脱水24 h，可见标本沉底，放入-20 ℃冰箱里保存24 h。待标本冻好后，使用OCT冰冻切片包埋剂包埋，提前2 h预冷冰冻切片机至-25 ℃，将包埋好的标本放入冰冻切片机冷室内固定装置上，使用一次性刀片缓慢匀速切片，直至将组织切完，获得3组冰冻切片标本。

1.4.5  苏木精-伊红染色  冰冻切片室温放置30 min，加入4 ℃ 40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS冲洗2次，每次  5 min；梯度乙醇脱水5 min，滴入二甲苯20 min，PBS冲洗2次，每次5 min；苏木精染色7 min，自来水冲洗5 min，1%盐酸乙醇分化1 min，自来水冲洗5 min，伊红染色     2 min；系列乙醇脱水2 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明5 min，中性树胶封固，光镜下观察。

1.4.6  免疫组化检测  冰冻切片室温放置30 min，加入4 ℃ 40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS冲洗2次，每次    5 min；滴加体积分数为3% H₂O₂避光孵育20 min，PBS冲洗2次，每次5 min；滴加山羊血清封闭液20 min；分别滴加Ox-42、TNF-α抗体，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗3次，每次5 min；置于摇床，滴加羊抗兔二抗37 ℃孵育1 h，PBS冲洗3次，每次5 min；DAB显色液显色5 min，显微镜观察至出现棕色，苏木精复染2 min，自来水冲洗15 min，系列乙醇脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱脂5 min，中性树胶封固，光镜下观察。在显微镜100倍视野中随机取4个视野，采用Image J软件进行平均灰度值扫描。

1.5  主要观察指标  ①苏木精-伊红染色观察各组视神经和视网膜结构特点；②免疫组化染色及灰度扫描检测各组视神经和视网膜中Ox-42、TNF-α的表达。

1.6  统计学分析  采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，两组之间采用配对t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

当中枢神经系统稳态环境被打破，小胶质细胞过度活化的同时分泌大量促炎因子和毒性因子，加速神经元的损伤^[20-22]。将体外培养的骨髓间充质干细胞植入视神经损伤大鼠左眼玻璃体内，观察小胶质细胞活化状态及炎症因子的表达，结果显示移植骨髓间充质干细胞可以抑制小胶质细胞过度活化，抑制抗炎递质的产生，以减轻神经元损伤并有利于组织修复，从而对机体起到保护作用。

研究结果证明视神经损害后小胶质细胞活化的数量逐步增加^[23]，并促进释放大量炎症递质，使视神经损伤更加严重，而骨髓间充质干细胞则可抑制小胶质细胞的过度活化以及炎症因子的释放，能降低其对中枢神经系统的侵害，降低视神经的损伤程度。另外关于骨髓间充质干细胞发挥神经保护作用的具体机制^[24]，目前尚未完全清楚，可能有以下几个方面机制：①骨髓间充质干细胞通过抑制自身免疫炎症反应，减轻神经毒性物质对中枢神经系统的损害^[25]；②骨髓间充质干细胞通过分泌大量神经保护因子，启动中枢神经系统内源性修复机制，阻碍神经组织退行性变；③骨髓间充质干细胞可以透过血脑屏障，向病灶区迁移定居后转分化为脑细胞，替代功能障碍的神经元发挥作用^[26]。研究证明这种转分化功能替代作用是很微弱的^[27]，因为最终能进入中枢神经系统的骨髓间充质干细胞数量很少^[28]，主要集中在肺、肾等器官。结合该研究结果，小胶质细胞的活化与视神经损伤相关，并且骨髓间充质干细胞可以抑制其过度活化，从而在一定程度上保护视神经免受损伤。

MAPK/ERK信号通路对神经系统小胶质细胞激活也起到一定的作用^[29]，该信号通路可能直接作用于炎症因子，使白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α等表达受到抑制，进而使神经系统的损伤作用减弱^[30-31]。研究发现，丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)是与小胶质细胞密切相关的通路^[32-33]，作为细胞外重要传递通路，可参与小胶质细胞的生长、凋亡、分化、信号传导等，与小胶质细胞功能密切相关^[34]。细胞外信号调节激酶(ERK1/2)通路是MAPK三大通路之一^[35]，对细胞生长因子和营养性因子的释放起到调控作用从而介导细胞保护作用，还可通过控制炎症免疫因子的释放而介导细胞损伤作用。因此，ERK1/2通路与视神经损伤的小胶质细胞变化亦可能相关^[36] 。

实验通过对中枢神经系统已有的认知初步探究视神经损伤中相关的病理机制，包括小胶质细胞的活化、炎症因子的释放以及骨髓间充质干细胞的保护作用。目前看来，该实验仍存在不足之处，如实验标本数量过少，导致实验结果可能不具有普遍性，一些鉴定指标不够充分，以及可能在实验操作中存在技术问题，引起实验结果的偏差，因此需进一步全面克服研究不足，进一步确定MAPK/ERK信号通路在大鼠视神经损伤后小胶质细胞活化中的作用及机制。研究视神经损伤后小胶质细胞的活化有助于更好地去探索视神经保护通路，小胶质细胞在中枢神经系统中的具体机制可作为一个探讨的切入点^[37-39]，衡量其过度活化的节点，使其在中枢神经系统中保持正常的免疫调节作用，并对其过度表达进行多方面合理的干预，使炎症因子减少，增强神经系统的抗损伤能力，使不可再生的神经细胞发挥最大的作用^[40-41]，为临床上中枢神经系统疾病的预防及治疗提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

小胶质细胞：是中枢神经系统中休眠的巨噬细胞，正常情况下在中枢神经系统中参与免疫调节和炎症反应。在神经病理条件下，它介导中枢神经系统损伤和疾病的内源性免疫反应，发挥神经保护作用或神经毒性作用，使损伤进行性加重。

骨髓间充质干细胞：干细胞即为起源细胞，是一类具有多向分化潜能并能自我复制的原始未分化细胞，可以分化为多种间质组织。骨髓间充质干细胞目前临床应用于多系统疾病，对神经系统修复方面具有长远的发展前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

实验对外伤性视神经损伤的治疗方法进行了一系列探究，初步证实小胶质细胞在视神经损伤后发挥着不可替代的作用，并探究出通过骨髓间充质干细胞移植有效干预小胶质细胞的活化进程，从而减轻视神经损伤的程度。另外，某些神经信号通路如MAPK/ERK通路对神经系统小胶质细胞激活也起到一定的作用，该信号通路可直接作用于炎症因子，使其表达受到抑制，进而使神经系统损伤减弱。关于视神经损伤的治疗是当今医学研究的热点话题，目前多用激素冲击疗法，但此方法会引起人体免疫力下降等多种不良反应，目前的研究更多倾向于视神经减压手术治疗。当CT检查证实有颅前窝底视神经管骨折时建议进行激素冲击治疗。该研究具有很大的发展前景，可继续深入探究病理机制及干预方法，为临床上视神经损伤治疗提供实验依据。

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