2.1  实验动物数量分析  实验选用50只SD大鼠，分为5组，其中5只用于模型鉴定，实验过程无脱失，45只大鼠进入结果分析。

2.2  苏木精-伊红染色下椎间盘组织退变形态学鉴定  与假手术组相比，椎间盘模型组中的髓核出现破裂，其中髓核细胞呈粉红色，无核，髓核细胞死亡。整个髓核内正常髓核细胞减少，髓核细胞形态不规则，空泡消失，髓核中出现大量增生血管。而在纤维环退变中，纤维环破裂，纤维环呈曲折状，苏木精-伊红染色结果见图1。

2.3  骨碎补总黄酮对NF-kB信号通路中P-IkBa蛋白表达的影响  模型组P-IkBa蛋白表达与假手术组相比，其表达明显升高(P < 0.01)；骨碎补总黄酮各组的P-IkBa表达与模型组比较，显著降低(P < 0.01)，骨碎补总黄酮低剂量组的抑制效应最为明显，western-blot结果见图2。

2.4  骨碎补总黄酮对退变椎间盘中肿瘤坏死因子α mRNA和基质金属蛋白酶3 mRNA表达的影响  与假手术组相比较，模型组基质金属蛋白酶3 mRNA和肿瘤坏死因子α mRNA表达增加(P < 0.01)；骨碎补总黄酮药物干预各组基质金属蛋白酶3mRNA和肿瘤坏死因子α mRNA与模型组比较表达降低(P < 0.01)，以骨碎补总黄酮低剂量组的抑制效应最为明显，见图3。

2.5  骨碎补总黄酮对退变椎间盘细胞中基质金属蛋白酶3蛋白表达的影响  基质金属蛋白酶3阳性在显微镜下为细胞质中的棕色颗粒，模型组基质金属蛋白酶3的表达与假手术组相比较，其表达量增加(P < 0.01)；骨碎补药物干预各组与模型组比较，基质金属蛋白酶3表达降低(P < 0.01)，以骨碎补总黄酮低剂量组的抑制效应最为明显见图4。

2.6  骨碎补总黄酮对退变椎间盘细胞中肿瘤坏死因子α蛋白表达的影响  模型组与假手术组相比，其肿瘤坏死因子α蛋白表达增加(P < 0.01)，骨碎补总黄酮干预的各组肿瘤坏死因子α蛋白表达显著低于模型组(P < 0.01)，以骨碎补总黄酮低剂量组降低最为明显，见图5。

椎间盘退变以及其继发的病理改变是颈椎病发病的重要病理基础^[1]。目前临床上针对颈椎病治疗药物主要以缓解患者颈部疼痛症状为主，而干预椎间盘退变的药物则相对缺乏^[2--3]。因此，寻找有效治疗颈椎病的药物越来越受到关注。

骨碎补总黄酮是从水龙骨科植物的干燥根茎中提取出来的黄酮类化合物，现代药理研究表明其具有促细胞增殖分化、抗骨质疏松、抗炎、促进骨折愈合、促进细胞基质合成的作用^[4]，并且其抗炎作用可能与抑制NF-kB信号通路激活有关，而在椎间盘退变过程中，NF-kB信号通路激活与炎症因子的表达及胞外基质代谢失衡关系最为密切^[5-9]。有报道骨碎补对骨性关节炎具有抗炎作用^[10]，但国内外有关骨碎补能否干预椎间盘退变的相关研究未见报道。此次研究基于骨碎补总黄酮具有抗炎和促进细胞基质合成作用，通过建立大鼠的动静力失衡性颈椎间盘退变模型，探究骨碎补总黄酮干预椎间盘退变的作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  分组对照动物组织学实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年7月至2019年6月在安徽医科大学中心实验室完成。

1.3  材料 

1.3.1  实验动物  50只SD大鼠，雌雄各半，6-8周龄，体质量190-220 g，由安徽医科大学动物实验中心提供，实验动物使用许可证，SYXK(皖)2017-006。50只SD大鼠分于10个笼内，每笼饲养5只，适应性饲养1周后开始实验。整个实验过程中(包括适应性饲养阶段)大鼠饮用去离子水。

1.3.2  实验药品及制备  强骨胶囊，规格250 mg，北京岐黄制药有限公司，Z20030007。将强骨胶囊按比例溶于 100 mL生理盐水配药，搅拌器混匀后放置于4 ℃冰箱中备用。

1.3.3  实验主要试剂  PCR引物(上海生工生物工程服务技术公司)，总RNA提取试剂盒、Quant cDNA合成试剂盒、2xTaqPCR Master Mix试剂盒(天根生化科技有限公司)、Trizol(Life technogies)，DEPC、无水乙醇(上海苏懿化学试剂有限公司)，anti-p-IKBa(1∶1 000 Bioworld BS4105)、anti-MMP3(1∶200 bs-0575R)、DBA显色试剂盒，细胞裂解液、洗膜液、封闭液(碧云天公司)，辣根过氧化物酶结合的抗兔二抗(Abcom公司)，Elisa试剂盒(武汉基因美科技有限公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  模型建立  40只大鼠按文献报道建立动静力失衡性颈椎间盘退变大鼠模型^[11]：用3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，然后腹位固定于大鼠固定板上，切口处备皮，常规洗手后穿无菌衣戴手套，切口部位碘伏消毒后铺无菌巾；取颈背部正中切口，纵向切开皮肤及皮下组织2.0-2.5 cm，充分游离各层肌肉，横向切断深层颈夹肌和头、颈、寰最长肌，完全切除颈髂肋肌和头半脊肌，然后再依次切断C_2-7棘上和棘间韧带，缝合皮肤。其余10只大鼠作为假手术组，并做相应的假手术处理：术前准备及麻醉同上，取颈背部正中切口，纵向切开皮肤及皮下组织2.0-2.5 cm，无需切断颈部肌肉和韧带，直接缝合皮肤。造模术后每天肌肉注射20 000 IU的青霉素钠，以防术后感染，共注射3 d，然后继续予以同样标准饮食分笼喂养。5个月后分别处死4只颈椎间盘退变模型组大鼠和1只假手术组大鼠，切取C_3-4、C_4-5、C_5-6、C_6-7椎间盘组织，进行病理学检查并验证造模是否成功。

1.4.2  药物胃内给药  病理学鉴定造模成功后，将36只颈椎间盘退变模型组大鼠按体质量随机分组，每组9只，共4组，骨碎补总黄酮低剂量组、骨碎补总黄酮中剂量组、骨碎补总黄酮高剂量组和模型组，骨碎补总黄酮低、中、高剂量组分别用人体推荐剂量的5倍(62.5 mg/kg)、10倍(125 mg/kg)、20倍(250 mg/kg)的骨碎补供试液灌胃。假手术组与模型组每天予以4 mL生理盐水灌胃。各组大鼠灌胃1个月后，麻醉大鼠，取下C_3-4、C_4-5、C_5-6、C_6-7椎间盘组织处理备检。

1.4.3  Western Blot检测各组磷酸化IkBα蛋白表达  剪取椎间盘组织后称质量，每组样品质量在100 mg左右，加入RIPA细胞裂解液1 mL(内含1 mmol/L PMSF)进行裂解，       12 000 r/min离心10 min，收集上清组织总蛋白，沸水煮沸蛋白，变性后将各组蛋白样品加到SDS-PAGE胶加样孔内，以电压为80-120 V电泳，之后将其转到PVDF膜上，5%BSA封闭2 h后加入一抗(β-actin抗体、p-IkBα抗体，           1∶1 000)4 ℃孵育过夜，洗脱后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗 (1∶10 000)，孵育2 h，最后用增强化学发光(ECL)系统蛋白质带进行检测，Image-J软件对条带进行分析。

1.4.4  RT-PCR检测各组椎间盘基质金属蛋白酶3和肿瘤坏死因子α基因的表达  称取组织50 mg，剪碎，液氮研磨，加入1 mL TRIzol匀浆，加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡15 s，室温放置5 min。4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清(约500 μL)加入到另一EP管中。加入0.5 mL预冷的异丙醇，温和混匀，冰上孵育30 min。4 ℃ 12 000 r/min 离心   15 min，弃去上清。加入1 mL预冷的体积分数75℅乙醇。4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，弃上清，室温干燥RNA沉淀物即为总RNA，置于-20 ℃冰箱保存备用。建立反应体系合成cDNA：取1 μL cDNA产物，2×SYBR Green mixture 5 μL，Forward primer(10 μmol/L)1 μL，Reverse primer (10 μmol/L)1 μL，Cdna 1 μL，RNase Free water 2 μL，Total 10 μL。反应条件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共持续40个循环。数据采用2^-∆∆Ct法进行数据分析。引物序列见表1。

1.4.5  免疫组织化学测定基质金属蛋白酶3表达情况  取椎间盘组织，石蜡4 μm切片后常规脱蜡至水化，抗原高压修复后，自然冷却2 min，免疫组织化学笔画一个圆圈圈住组织，放在孵育盒上，组织上滴加体积分数3%H₂O₂，室温孵育20 min，PBS冲洗3遍，用正常羊血清工作液封闭 10 min，加入一抗稀释液37 ℃孵育1 h后PBS冲洗3次，甩干后用二抗37 ℃孵育20 min后PBS冲洗3次，再次甩干用DAB显色，蒸馏水冲洗，苏木精复染1 min，碳酸锂蓝化    1 min，经梯度乙醇脱水干燥、透明中性树胶封固。从每组9张组织切片中随机选取2张，光学显微镜×400视野下对椎间盘随机选取10个不同视野显微镜下拍照，采用 Imagepro- plus图像分析软件测定每张照片的平均吸光度值(IA)。

1.4.6  ELISA测定肿瘤坏死因子α蛋白表达情况  根据制造商试剂盒的说明书，用酶联免疫吸附测定试剂盒测定肿瘤坏死因子α的蛋白表达，用酶标仪读取数值后进行数据分析。

1.5  主要观察指标  ①骨碎补总黄酮干预治疗组蛋白P-IkBα表达；②肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶3基因和蛋白表达。

1.6  统计学分析  应用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，所有数据采用x(_)±s表示，组间计量资料采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

医学研究表明，骨碎补的主要有效成分是总黄酮，具有抗炎和促进基质合成的作用^{[11-13 ]}。有学者发现骨碎补总黄酮可抑制骨性关节炎的白细胞介素1、白细胞介素8及肿瘤坏死因子α表达，对骨性关节炎有积极的治疗作用，而骨性关节炎主要发病机制是由于软骨退变，与椎间盘软骨退变有着相似的发病基础，骨碎补总黄酮通过抗炎干预骨关节炎的机制已有相关的报道^[14]，但对椎间盘退行性变的研究目前尚不清楚。此次研究探讨了骨碎补总黄酮干预椎间盘退变的可能机制和可能的最适治疗剂量。

椎间盘退变主要与生物力学因素、营养、细胞凋亡、细胞炎症因子以及降解酶等有关^[15]，其中炎症因子表达在椎间盘退变中起到重要作用。近年来，大多研究表明退变的椎间盘组织可分泌大量致炎物质(包括 白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等)，这些炎性因子可在局部产生自身免疫炎症反应，促进椎间盘的退变，也对长入椎间盘的窦椎神经末梢产生炎性刺激进而引发神经根疼痛^[16]，其中肿瘤坏死因子α使椎间盘退变的蛋白多糖降解代谢及致炎因子合成活跃，且产生不可逆转的生物效应^[17]。有研究表明肿瘤坏死因子α也可诱导了椎间盘细胞产生基质金属蛋白酶3^[18-19]，而基质金属蛋白酶3表达增加可进一步降解基质中的蛋白多糖、糖蛋白、弹性蛋白以及胶原，导致基质金属蛋白酶组织抑制剂及基质金属蛋白酶代谢失衡，加速椎间盘退变。

因此，抑制椎间盘软骨细胞的炎症反应有利于控制或延缓椎间盘退变的进展，并可能成为治疗椎间盘退变的关键环节。此次实验显示，在破坏大鼠颈部动静力系统失衡造模成功后，退变椎间盘中的炎症因子肿瘤坏死因子α mRNA以及其蛋白的表达明显升高，而骨碎补总黄酮治疗组的肿瘤坏死因子α mRNA与其蛋白的表达受到抑制，其中低剂量组尤为显著，表明骨碎补总黄酮对椎间盘中的炎症因子的表达具有抑制效应。同时，在模型组中基质金属蛋白酶3 mRNA以及蛋白的表达明显升高，骨碎补总黄酮各治疗组的基质金属蛋白酶3 mRNA以及蛋白的表达也受到抑制。提示骨碎补总黄酮可抑制椎间盘退变中肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶3表达，其最适合的药物干预剂量可能是低剂量组的剂量。

NF-kB蛋白是一类由其家族蛋白亚单位组成的同源或异源二聚体转录因子，最常见的是由p65和p50组成的异源二聚体，并与其IkBa结合形成三聚体而失活存在细胞质中。当细胞处于刺激环境可使IkBa磷酸化(P-IkB)，使IkBa从三聚体分离，而p65和p50组成的异源二聚体转入细胞核内，调节靶基因的表达，从而在炎症、细胞凋亡及肿瘤形成中起到重要的信号传导作用^[20-21]。有研究证实，在椎间盘退变过程中炎症和基质降解与NF-kB信号通路的激活有着重要联系，NF-kB信号通路是介导基质金属蛋白酶3和肿瘤坏死因子α表达增加，而加速降解基质的主要信号通路^[22-24]，并且表达增加的肿瘤坏死因子α可进一步激活NF-κB信号通路调节分解代谢相关酶的释放而进一步导致椎间盘退变^[25]。因此，通过检测P-IkBa蛋白的表达量可以反映NF-kB信号通路的激活情况。此次研究发现，模型组P-IkB蛋白的表达量和假手术组相比明显增加，提示了NF-kB信号通路在退变椎间盘中被激活。而与模型组相比，骨碎补总黄酮治疗各组中，P-IkBa表达降低，以低剂量组最为明显，据此可推测骨碎补总黄酮可抑制NF-kB信号通路的激活，低剂量组的药物浓度可能为抑制NF-kB信号通路的激活而延缓椎间盘退变的最佳浓度。

有研究发现骨碎补总黄酮可减少骨关节炎肿瘤坏死因子α的表达^[26]，其柚皮苷可抑制NF-KB信号通路激活，而NF-KB信号通路的激活对于炎症因子肿瘤坏死因子α、环氧合酶2、诱导型一氧化氮合酶、白细胞介素6等均有促进作用。因此，骨碎补柚皮苷可能通过抑制NF-KB信号通路激活而起到抗炎作用^[27]。另有学者研究发现低浓度骨碎补对骨细胞具有增殖分化作用，而较高浓度骨碎补会出现抑制现象，而使细胞发生凋亡^[28]。这些研究表明，骨碎补可能通过抑制NF-KB信号通路激活而起到抗炎作用，与此次研究的实验结果基本一致，而高浓度骨碎补可使骨细胞发生凋亡，因软骨细胞凋亡与椎间盘退变有着重要关系，高浓度骨碎补是否也会导致软骨细胞发生凋亡，并致使研究结果出现以低剂量组的干预效果最佳，其具体深层机制需要进一步研究。

此次研究针对骨碎补总黄酮对椎间盘退变的防治作用进行了初步探讨，发现骨碎补总黄酮对椎间盘软骨细胞NF-kB信号通路激活具有抑制作用，并能抑制退变椎间盘软骨细胞中炎症因子肿瘤坏死因子α以及基质金属蛋白酶3的表达，由此可认为骨碎补总黄酮对椎间盘软骨细胞的保护作用是通过抑制NF-kB信号通路激活和抑制炎症因子以及基质金属蛋白酶表达而实现的，为骨碎补用于防治椎间盘退变和临床治疗椎间盘退变新药的开发提供了新的参考依据。

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文题释义：

骨碎补总黄酮：是水龙骨科植物干燥根茎中提取出黄酮类化合物。

NF-kB信号通路：NF-kB是一种常见的细胞信号通路，p65-p50 二聚体是其主要的存在形式。当细胞处于静息状态时，p65-p50二聚体通过与抑制性蛋白IkBα 结合，并以无活性的形式存在于细胞质中。在多种外界因素刺激下，其活性可以被多种因子激活，这些因子导致IkBα 磷酸化，继而被降解，使p65-p50二聚体与IkBα脱离，转位至细胞核中，因此IkBα的磷酸化是NF-kB信号通路活化的重要标志。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

NF-kB蛋白是一类由其家族蛋白亚单位组成的同源或异源二聚体转录因子，最常见的是由p65和p50组成的异源二聚体，并与其IkBa结合形成三聚体而失活存在细胞质中。当细胞处于刺激环境可使IkBa磷酸化（P-IkB），使IkBa从三聚体分离，而p65和p50组成的异源二聚体转入细胞核内，调节靶基因的表达, 从而在炎症、细胞凋亡、及肿瘤形成中起到重要的信号传导作用。

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