β-磷酸三钙/聚乳酸-聚羟基乙酸/异烟肼/左氧氟沙星缓释材料的成骨检测

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.03.001

摘要/Abstract

摘要：

背景：在聚乳酸-聚羟基乙酸中加入β-磷酸三钙可调控其降解速率和强度。
目的：观察β-磷酸三钙/聚乳酸-聚羟基乙酸/异烟肼/左氧氟沙星缓释材料修复兔股骨髁骨缺损的效果。
方法：制作兔右股骨髁直径5 mm、长10 mm的圆柱形骨缺损模型，随机分3组，其中两组分别于骨缺损处植入β-磷酸三钙/聚乳酸-聚羟基乙酸材料和β-磷酸三钙/聚乳酸-聚羟基乙酸/异烟肼/左氧氟沙星缓释材料，空白对照组不植入任何材料。通过影像学、大体标本、组织学检查评价骨缺损修复效果。
结果与结论：术后12周时，β-磷酸三钙/聚乳酸-聚羟基乙酸材料组和β-磷酸三钙/聚乳酸-聚羟基乙酸/异烟肼/左氧氟沙星缓释材料组骨缺损都得到修复，两组新骨占缺损区面积差异无显著性意义(P > 0.05)，空白对照组骨缺损未修复。表明β-磷酸三钙/聚乳酸-聚羟基乙酸/异烟肼/左氧氟沙星缓释材料可以很好修复兔股骨髁缺损。

关键词: 生物材料, 组织工程骨材料, 聚乳酸-聚羟基乙酸, β-磷酸三钙, 骨缺损, 骨结核, 骨组织工程, 国家自然科学基金, 生物材料图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The degradation rate and strength of poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) can be regulated by the addition of beta-tricalcium phosphate (β-TPC).
OBJECTIVE: To test the effect of β-TPC/PLGA/isoniazid (INH)/levofloxacin (LVFX) composite on the repair of femoral condyle bone defects in rabbits.
METHODS: Thirty New Zealand rabbits were used for preparing a rabbit model of bone defects with the diameter of 5 mm and the depth of 10 mm. The rabbits were randomly divided into three groups: group 1, group 2 and group 3. The former two groups were implanted with β-TPC/PLGA and β-TPC/PLGA/INH/LVFX, respectively. The group 3 was untreated as the blank control group. The repair effects of each group were detected by imaging, gross specimen and histological examination.
RESULTS AND CONCLUSION: At week 12 after treatment, bone defects in the two experimental groups were both radiographically repaired, and there was no significant difference between these two groups in the ratio of new bone area to bone defects area (P > 0.05). The blank control group failed to restore bone defects. These results suggest that the PLGA/TCP/INH/LVFX material can effectively repair femoral condyle bone defects in rabbits.

Key words: biomaterials, tissue-engineered bone materials, poly(lactic-co-glycolic acid, beta-tricalcium phosphate, bone defects, bone tuberculosis, bone tissue engineering, National Natural Science Foundation of China, biomaterial photographs-containing paper

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2010年12月至2011年6月在解放军第309医院结核研究所(国家重点学科，全军结核病研究所)完成。
材料：
实验动物：3月龄健康新西兰大白兔30只，雌雄不拘，体质量(2.5±0.5) kg，由解放军总医院实验动物中心提供。按抽签法将动物随机分配到两个实验组和空白对照组，每组10只。
实验材料：PLGA由山东省医疗器械研究所提供，β-磷酸三钙由中国上海贝奥路生物材料有限公司提供，异烟肼及左氧氟沙星由中国食品药品监督管理局提供，分别封装后60Co辐照消毒(解放军事医学科学院辐照中心)。
主要试剂及仪器：光学显微镜、图像采集系统(日本Olympus公司)；不脱钙骨切片机(德国Leica公司)；速眠新Ⅱ号(长春军需大学兽医研究所)。
实验方法：
β-磷酸三钙/PLGA、β-磷酸三钙/PLGA/异烟肼/左氧氟沙星缓释材料的制备：将PLGA溶于适量 1，4-二氧六环溶液中，根据预定的β-磷酸三钙、PLGA质量比(1/5)称取相应量的β-磷酸三钙和PLGA(制备β-磷酸三钙/PLGA材料)，根据预定的载药量称取异烟肼、左氧氟沙星粉末(制备β-磷酸三钙/PLGA/异烟肼/左氧氟沙星材料)，异烟肼、左氧氟沙星与PLGA的质量比均为6%，将4种粉末直接混入PLGA溶液中，超声混合均匀，将混浊液植入模具中，在-80 ℃冷冻2 h，将模具置于冻干机中冷冻干燥72 h，制备出直径4 mm，长12 mm的圆柱形人工骨载体材料，见图1。材料孔径在40-400 μm，孔隙率为92%，见图2。材料环氧乙烷消毒，4 ℃保存备用。

动物模型制备：兔取仰卧位，氯氨酮与速眠新肌肉注射麻醉。常规备皮、消毒铺单。取右侧膝关节外侧切口，长2 cm，切开皮肤、皮下组织、关节外侧支持带，显露股骨远端，于侧副韧带与兔腓侧韧带之间中点处，平行膝关节横轴钻一直径5 mm、长10 mm圆柱形骨缺损。生理盐水冲洗创面，清除骨屑和凝血块，干纱布填塞，使骨面保持干燥，两实验组分别植入β-磷酸三钙/PLGA材料、β-磷酸三钙/PLGA/异烟肼/左氧氟沙星缓释材料，空白对照组不植入任何材料。缝合深筋膜，最后缝合皮肤。术后分笼饲养，每日肌肉注射青霉素10×10⁴ U/kg，连续3 d。

影像学检查：术后4，8，12周行X射线检查观察骨缺损区骨修复情况。

组织学观察：术后12周处死动物取材行大体观察。5只兔标本予以体积分数10%中性甲醛溶液固定标本，石蜡包埋，切片，光镜下观察各组骨缺损的修复情况。

不脱钙切片钼靶X射线观察：5只兔标本行体积分数40%乙醇固定48 h，之后乙醇梯度脱水塑料包埋，将不脱钙切片切成50，200 μm厚。200 μm厚切片用乳腺钼靶X射线机曝光，从侧位观察缺损区骨修复情况。

骨组织计量学分析：将50 μm厚不脱钙切片，流水反复冲洗，表面超净，Giemsa染色。普通光学显微镜下观察缺损区骨修复情况，并进行骨组织计量学分析，比较各组间新骨占缺损区面积的差异。

主要观察指标：各组兔股骨标本影像学检查、组织学观察结果。

统计学分析：所有实验数据以x(_)±s形式表示，用Spass 15.0软件进行单因素方差分析，检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

Peltier等^[11]证明骨形成与骨替代材料吸收速度应相当，骨替代材料吸收太快新骨形成没有爬行支架；相反，骨替代材料吸收太慢会阻挡骨组织长入。β-磷酸三钙具有良好的生物相容性，钙磷比为1.5∶1，钙磷比为1.67∶1的羟基磷灰石在体内几乎不降解。β-磷酸三钙的降解能为新骨的形成提供更丰富的钙离子和磷离子，促进新骨形成，并逐步为新骨组织置换^[12]。

β-磷酸三钙植入骨组织后在其界面形成一种钙磷的固-液平衡。维持这种平衡的离子来自周围的骨组织和植入材料。这些钙磷离子“媒介”最终以生物性磷灰石的形式形成钙磷固体沉积在界面，形成β-磷酸三钙与骨组织的直接结合或骨性结合。但β-磷酸三钙脆性大，不易成型。该体系材料中PLGA是有机高分子材料，材料降解时间可调^[13]，载药量大，释药时间较长。但单纯PLGA并不是很好的植骨材料，材料中不含钙离子，且材料降解后有酸性代谢产物积聚。如果将PLGA与β-磷酸三钙复合，则可以合成韧性和硬度都很好的骨修复材料，而且β-磷酸三钙的弱碱性还可以中和聚乳酸类降解产物中的酸性产物，减少无菌性炎症[^14-16]。另外，由于PLGA类降解时间长，β-磷酸三钙的掺入可加快PLGA组分的降解，掺入比例不同，PLGA降解时间也不同，因此可以通过调整β-磷酸三钙的掺入比例调控材料的降解时间，使之与骨形成速度一致^[17-18]，本实验制备的材料中PLGA与β-磷酸三钙的质量比为1/5，实验表明无论在强度还是骨传导能力上均达修复兔股骨髁缺损的要求。

治疗脊柱结核理想的抗结核药物缓释/代骨材料系统的要求：①缓释材料降解时间长，药物作用维持二三个月以上。②联合用药，局部药物浓度稳定。③材料有一定的力学强度。④材料降解与骨爬行替代基本同步。⑤材料有骨诱导作用。

陈兴^[19]、余方圆等^[20]应用单一药物制备材料，前者采用异烟肼与赋形剂明胶制成海绵，后者制备利福平－陶瓷(羟基磷灰石)人工骨核，两种材料药物单一。有研究分别制备了异烟肼/PLGA缓释微球和利福平/PLGA缓释微球，材料平均粒径70 μm，直径过小无法作为植骨替代材料，缓释药物时间较短。由于结核在西方发达国家发病率很低，国外尚无这方面的研究报告。因此目前还没有较好的结核药物缓释/植骨替代材料。

对于材料中联合加载药物的选择，利福平和异烟肼都是杀结核杆菌的药物，显然是最佳联合用药方案^[17-18]。但由于利福平非常不稳定，在材料制备过程中可能出现药物氧化失效，目前喹诺酮类药物已经作为抗结核治疗的二线药物或准一线药物使用，抗结核全身用药方案中多数包括这类药物，特别是在耐药结核病的化疗方案中作为常规用药，因此实验选择异烟肼和左氧氟沙星作为局部联合用药方案。该材料具有三维多孔结构，加载异烟肼和左氧氟沙星后有利于药物的缓释，前期体外实验表明两种药物缓释持续二三个月以上，符合抗结核药物缓释材料的要求，实验中亦未影响修复节段性骨缺损修复。

实验中显示新骨形成紧贴材料，表明材料的降解速度与新骨形成趋于一致，而且说明是成骨细胞成骨；不脱钙切片也显示主要为成骨细胞成骨，材料与成骨细胞之间无间隙，新骨形态与正常骨相同，提示是引导性骨再生，12周时达到完全愈合；而空白对照组12周时骨缺损周边1/3有纤细的新生骨小梁与正常骨相连，但中心部分被纤维组织充填，无骨组织生长。复合抗结核药物异烟肼和左氧氟沙星无论在局部还是全身都未产生毒副作用，这可以从兔骨缺损修复情况、切口愈合情况及术后良好的一般状态得到证明。先期体外药物释放浓度、持续时间及抑菌能力实验已经证明了该材料缓释抗结核药物的良好效果，下一步实验还要从体内药物释放浓度及持续时间上证明该材料的抗结核效果，最后用其来治疗脊柱结核动物模型，更进一步证明该抗结核药物缓释/代骨材料的治疗效果。

基金资助：国家自然科学基金资助项目(81071454)，项目名称：抗结核药物缓释/代骨材料缓释系统的研制。
致谢：课题在研究过程中得到中国科学院化学研究所、全军结核病研究所工作人员的大力支持和指导，在此一并致谢。
作者贡献：课题由崔旭、马远征进行实验设计，实验实施为崔旭、李大伟，实验评估为薛海滨，资料收集为李大伟，崔旭成文，马远征审校并对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物处置符合相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。