2.1  实验动物数量分析  实验选用大鼠24只，分为3组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。 

2.2  骨骼肌湿质量  比目鱼肌4周中等强度运动组湿质量与对照组差距较小，4周大强度运动组湿质量较低，但均未表现出显著性差异；腓肠肌4周中等强度运动组湿质量较低，4周大强度运动组湿质量更小，且均具有显著性的差异，见图1。



2.3  各组大鼠肌纤维横截面积  通过免疫荧光技术统计比目鱼肌、腓肠肌各组肌纤维横截面积，比目鱼肌4周中等强度运动组与对照组相比，肌纤维横截面积差异无显著性意义(P > 0.05)，而4周大强度运动组与对照组对照相比，其肌纤维横截面积明显较小(P < 0.01)，见图2。而腓肠肌肌纤维横截面积表现为：4周的中强度运动肌纤维横截面积比对照组大，但其幅度小于4周大等强度运动组，且均具有显著性差异(P < 0.01)，见图3。







2.4  BNIP3蛋白表达量  经过4周不同强度的运动，大鼠比目鱼肌中的BNIP3蛋白表达量相对对照组发生了显著变化(P < 0.05)，4周中等强度运动组的BNIP3蛋白表达量增加，4周大强度运动组的BNIP3蛋白表达降低，见图4。4周中等强度运动组中大鼠腓肠肌BNIP3的蛋白表达与对照组相比显著上调(P < 0.01)；4周大强度的运动则使BNIP3表达与对照组相比显著下调(P < 0.05)，见图5。







2.5  透射电镜下的自噬体检测结果  各组在透射电镜下所能观测到的自噬体结果显示见图6，7。比目鱼肌及腓肠肌4周中等强度运动组与4周大强度运动组在镜下均可观测到自噬泡的存在，且4周大强度运动组自噬泡数量多于4周中等强度运动组。







2.6  LC3及p62蛋白表达量  4周不同强度运动中p62、LC3蛋白在比目鱼肌中的表达情况见图8。4周中等强度运动组比目鱼肌p62蛋白表达量下调(P < 0.05)，LC3-Ⅰ的表达量一定幅度下调，而LC3-Ⅱ的表达大幅度的升高，最终使代表自噬水平的参照值LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ大幅度增高(P < 0.05)。4周大强度运动组中的p62蛋白表达量相对对照组下调，且其下调幅度大于4周中等强度运动组(P < 0.05)，LC3-Ⅰ的下调幅度(P < 0.01)、LC3-Ⅱ的升高幅度(P < 0.05)也均大于4周中等强度运动组，最终可使4周大强度运动组中的LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ值高于4周中等强度运动组(P < 0.05)。



       经过4周运动，腓肠肌中表达情况(见图9)与对照组相比，中等强度运动组p62表达下降(P < 0.05)，LC3-Ⅰ表达下降(P < 0.05)，LC3-Ⅱ表达升高幅度较大，而使自噬水平的参照指标LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ较对照组大幅度提高(P < 0.05)。而4周大强度的运动组中腓肠肌的p62蛋白较4周中等强度运动下降幅度更加明显(P < 0.05)，LC3-Ⅰ下调幅度、LC3-Ⅱ上调幅度也均加大(P < 0.05)，而4周大强度的运动组中二者比值即LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高幅度大于4周中等强度运动组(P < 0.05)。



2.7  BNIP3蛋白与自噬因子LC3、p62蛋白表达的相关分析  BNIP3蛋白与自噬因子LC3、p62等共同作用，能在运动影响下介导调控骨骼肌的线粒体自噬。4周中等强度运动及4周大强度运动的比目鱼肌、腓肠肌中各蛋白的表达相对值见表1。在比目鱼肌与腓肠肌中，中等强度运动组中BNIP3蛋白表达量整体呈上升趋势，p62下调，且LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ的比值升高，大强度运动组BNIP3蛋白整体呈下降趋势，4周大强度运动组中p62下调程度与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ上调程度均大于4周中等强度运动组。

在骨骼肌稳态调节过程中，激活自噬可以一定程度上弥补溶酶体功能的不足，缓解蛋白聚集导致的生理功能失调，维持肌肉质量。线粒体自噬是指在应激条件下细胞内的线粒体出现去极化损伤，损伤的线粒体被特异性包裹入自噬体中，并与溶酶体融合，从而完成损伤的线粒体降解，维持细胞内环境稳定，可防治细胞中因为活性氧(ROS)等造成的线粒体内容物的释放和线粒体途径的细胞凋亡或坏死^[1-2]，对于维持骨骼肌质量具有重要作用。其特征蛋白为微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)，为Ⅰ型和Ⅱ型，通常LC3在细胞质中以LC3-Ⅰ的形式存在^[3]，自噬发生时LC3-Ⅱ的表达增加。研究发现，LC3-Ⅱ含量与自噬泡的数量成正比^[4]，被认为是自噬体的标志分子。

在哺乳动物体内，线粒体自噬相关途径主要有BNIP3、Nix、FUNDC1、PINK1/Parkin等，其中大多数途径均与低氧有关。Bcl-2与腺病毒E1B 19 kDa相互作用蛋白3(bcl-2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein3，BNIP3)是低氧诱导因子1的靶基因，在低氧时能被低氧诱导因子1转录激活，使BNIP3上调。对多种肿瘤细胞株进行缺氧实验研究，结果发现BNIP3在缺氧条件下表达上调5-10倍^[5]。DAIDO等^[6]通过神经酰胺诱导发现了BNIP3表达增高引起线粒体去极化和自噬。Vasagiri等^[7]提出细胞在低氧条件下通过激活低氧诱导因子1和P12K/Akt/p53途径诱导线粒体自噬，促进细胞的存活和低氧适应，而且p53可直接抑制BNIP3的表达以应对低氧诱导的细胞死亡^[8-9]。同时，有研究表明p62可以与细胞自噬的关键分子LC3相互作用。在自噬功能缺陷的小鼠体内p62累积，从而证实了p62参与自噬调节过程^[10-11]。因此，BNIP3蛋白与自噬因子LC3、p62等共同作用，能在运动、低氧等条件影响下介导调控骨骼肌的线粒体自噬，从而对维持骨骼肌功能产生重要意义。

运动可以增强线粒体功能，适宜的运动训练还可以提高自噬水平，降解运动刺激所积累的破损和衰老的细胞器以及合成或折叠错误的蛋白质，抑制骨骼肌和心肌细胞凋亡或死亡^[12-13]。GRUMIA等^[14]研究发现，运动训练可以促进骨骼肌细胞自噬。还有研究表明8周的不同强度耐力训练均可缓解小鼠自噬降解障碍以维持肌细胞正常生理功能，中等强度的耐力运动对小鼠骨骼肌自噬水平的激活更为有效^[15]。但对于不同运动强度影响BNIP3对线粒体自噬的调控未见报道，其具体机制尚未明确。因此以不同的运动强度为变量，观测其对BNIP3介导的骨骼肌线粒体自噬具有重要意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年5月至2018年12月在北京体育大学动物实验中心完成。

1.3  材料  8周龄健康雄性SD大鼠24只，体质量约为300 g，购于维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001。按照处理条件随机分为3组：空白对照组(n=8)；中等强度运动组(n=8)；大强度运动组(n=8)。单笼喂养，确保大鼠自由活动与进食、进水。室温保持在20-25 ℃，自动控制动物室内照明，每昼夜均保持12 h光明与黑暗交替循环。

1.4  实验方法

1.4.1  各组处理方法  空白对照组不进行任何处理；中等强度运动组熟悉运动跑台后，进行(5°，15 m/min，1 h，60%VO_2max)中等强度运动；大强度运动组熟悉运动跑台后，进行(5°，35 m/min，20 min，85%VO_2max)大强度运动。共运动4周，每周6次。

1.4.2  实验动物取材及包埋  达到饲养既定天数后，禁食12 h，麻醉，取血液处死。取双侧小腿比目鱼肌和腓肠肌保存，同时取少量上述骨骼肌除去可见血液、筋膜等，将肌肉置于胶囊中，用OCT进行包埋，迅速置于液氮中，随后转入-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.4.3  肌肉湿质量  调节好天平，取材后即刻，测量小鼠比目鱼肌和腓肠肌的质量并记录。

1.4.4  免疫荧光检测Laminin比较肌纤维截面积  制作好冰冻切片后做如下操作：①选取在-80 ℃保存带有样本的防脱载玻片，用PBST摇床洗3次，每次5 min，滤纸吸水后用画圈笔标示样本范围，用含有0.3%Triton的PBS摇床破膜30 min；②用羊血清原液稀释成体积分数5%的羊血清封闭样本2 h，并用体积分数5%的羊血清溶液配一抗，混匀后在标识内适量滴加，Laimini比例为1∶300；③PBST 摇床洗3次，每次5 min；④画圈笔巩固标识，在避光条件下，体积分数5%的羊血清溶液配二抗，混匀后在标识内适量滴加二抗，其中羊血清与Laminin比例为1∶300，二抗2 h；⑤PBST摇床洗3次，每次10 min；⑥准备泡酸清洁后的盖玻片，DAPI封固，4 ℃避光保存；⑦开启激光共聚焦显微镜，打开软件并设置条件及光的颜色；⑧确定样本后调节焦距和背景，确定后拍摄、储存。经过洗片、破膜、封闭、一抗、二抗等步骤后封固4 ℃避光保存。开启激光共聚焦显微镜，打开软件并设置条件及光的颜色。确定样本后调节焦距和背景，确定后拍摄、储存，进行肌纤维横截面半径的测量。

1.4.5  透射电镜检测自噬体形态  将固定并置于缓冲液内于4 ℃保存的标本按照以下步骤进行操作：①0.1 mol/L磷酸缓冲液浸洗30 min；②1%固定液(固定液内含有磷酸缓冲液)4 ℃固定2 h；③0.1 mol/L磷酸缓冲液浸洗10 min；④乙醇梯度脱水：体积分数30%，50%，70%乙醇各10 min；⑤体积分数70%乙醇醋酸双氧铀块染2 h或过夜；⑥体积分数90%乙醇10 min×2；体积分数100%乙醇10 min×3；⑦环氧丙烷置换10 min；⑧环氧树脂EMbed浸透、包埋、聚合；⑨作1.0-2.0 μm的半超薄切片，美蓝染色后光学显微镜下定位，超薄切片机制作60 μm的超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色后，透射电镜下观察、拍照。观察比目鱼肌自噬泡形态变化。

1.4.6  Western blotting检测蛋白表达  采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测大鼠骨骼肌自噬特征蛋白LC3、p62以及介导蛋白BNIP3。具体操作主要步骤为：①电泳；②转膜；③免疫反应；④光学发光系统曝光条带；⑤Image Lab等软件进行蛋白质相对定量分析。BNIP3、LC3和p62抗体均购自Abcam公司(美国)。

1.5  主要观察指标  ①各组大鼠骨骼肌湿质量；②肌纤维横截面积；③比目鱼肌BNIP3蛋白表达；④透射电镜下的自噬体检测结果；⑤比目鱼肌LC3及p62蛋白表达；⑥BNIP3蛋白与自噬因子LC3、p62蛋白表达的相关分析。

       近年来国外关于运动对线粒体自噬影响的研究主要是运动中BNIP3与线粒体自噬的关系。LIRA等^[16]指出运动诱导的骨骼肌适应和运动能力的增强需要自噬参与，并且基础状态下与氧化能力强的肌纤维及其线粒体自噬水平高。国内学者发现大鼠脊髓损伤后可以激活神经元自噬以及相关蛋白LC3及BNIP3表达增加^[17]，研究则主要集中探讨低氧结合运动对线粒体自噬受体Nix与BNIP3的影响^[18]，证实了低氧结合运动可通过低氧诱导因子1α途径促进低氧诱导的BNIP3介导的线粒体自噬保护机制，高效清除低氧损伤的线粒体，从而提高骨骼肌线粒体健康水平。HE等^[19]报道8周的跑台训练可提高小鼠骨骼肌Bcl-2介导的线粒体自噬，表明自噬激活是运动训练改善机体能量代谢的必要条件。

已知运动可以提高骨骼肌线粒体功能水平，同时通过介导骨骼肌线粒体自噬保证骨骼肌细胞中线粒体的数量及功能，以维持并提高骨骼肌的运动水平。肌肉的湿质量与肌纤维的横截面积可以在一定的程度上反映骨骼肌的形态功能或运动能力。此次实验通过比较4周不同强度运动后骨骼肌湿质量发现，中等强度运动组的腓肠肌湿质量小于对照组，而大强度运动组腓肠肌和比目鱼湿质量均小于各自对照组，这可能是由于运动过程中各种能源物质以及水的丢失造成的。而通过免疫荧光统计肌纤维横截面积的变化则表现为中等强度运动组均大于对照组，大强度运动组中以慢肌纤维为主导的比目鱼肌横截面积下降，大强度运动组中以快肌纤维为主导的腓肠肌横截面积大于对照组，但小于中等强度运动组，这种差异可认为是由于不同强度运动动用的肌纤维类型差异造成的。

迄今为止，已在骨骼肌细胞中验证BNIP3能够促进自噬的发生^[20]。自噬是许多细胞发生的基本现象，自噬通过清除蛋白质和线粒体来维持细胞存活，清除受损的线粒体对细胞的生存是必要的，抑制自噬将引起坏死样的细胞死亡^[6]。BNIP3可以在不改变线粒体通透性和不依赖于凋亡的前提下，介导线粒体的氧化磷酸化而破坏线粒体，且BNIP3减少了线粒体氧化呼吸过程中必须蛋白质的含量，因而减少线粒体磷酸化和细胞ATP水平，促进线粒体翻转，可引起自噬^[21]。

在此次实验结果中，中等强度运动组中BNIP3蛋白表达量整体呈上升趋势，大强度运动组BNIP3蛋白整体呈下降趋势，并未因肌肉类型的不同而有所差异。实验结果表明中等强度运动对不论是典型的慢肌纤维为主的比目鱼肌或快肌纤维为主的腓肠肌都可促进其自噬的发生，而大强度运动则使两种类型的肌肉中BNIP3途径的线粒体自噬产生停滞。

目前，已经证实运动训练是细胞自噬的诱导因素之一^[22]。通过在电镜下观察比目鱼肌及腓肠肌组织，中等强度运动组和大强度运动组中均发现了自噬泡的存在，且大强度运动组中数量更多，这证实了运动训练可诱导骨骼肌发生不同程度的自噬，大强度运动组的自噬程度大于中等强度运动组。

在正常情况下LC3蛋白以LC3-Ⅰ的形式存在于胞浆中，在自噬发生时被切割和磷脂化修饰形成 LC3-Ⅱ后，参与自噬前体膜的组装。LC3-Ⅱ定位并结合于自噬前体和自噬体膜中，直到自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体后将其降解，因此 LC3-Ⅱ的表达量常用来反映自噬的发生量。而p62蛋白是一种接头蛋白，它能与自噬体上的膜蛋白 LC3-Ⅱ相互作用，同时它又是一种泛素结合蛋白，能通过泛素结合结构域与泛素化的蛋白相结合，从而作为自噬受体将泛素化的蛋白连接到自噬体上，最终运送到溶酶体内降解。p62 因此也被视为自噬过程中的一个必要蛋白^[23]。因此在运动过程中，通过检测LC3-Ⅰ、p62、的含量下降，LC3-Ⅱ的含量上升，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值升高，可表明自噬的活性升高。

在此次的实验结果中不同强度运动对骨骼肌中LC3及p62蛋白均有显著影响。中等强度使骨骼肌中p62蛋白下调，大强度运动组中p62的下调幅度更大，并且此结果在比目鱼肌与腓肠肌中未显示出有所差异。由于p62蛋白作为线粒体自噬溶酶体途径的底物，可通过与LC3相互作用实现降解，因此其下降可证实4周大强度运动较4周中等强度运动更能有效诱导骨骼肌线粒体的自噬，这一点在LC3蛋白的表达上也可得到证实。此次实验结果中，LC3蛋白的表达在4周中等强度运动组及4周大强度运动组与对照组相比均表现为LC3-Ⅰ下调、LC3-Ⅱ上调，且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值升高，表明运动可诱导骨骼肌线粒体自噬水平提高，且4周大强度运动组高于中等强度运动组。

在4周中等强度运动组与对照组的比较中，BNIP3表现为上调，p62下调，且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值升高，证实了一段时间的中等强度运动可提高骨骼肌线粒体的自噬水平。在4周大强度的运动组与对照组的比较中，BNIP3表现为下调，但p62下调程度与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ上调程度均大于4周中等强度运动组，表明4周的大强度运动使骨骼肌线粒体的自噬水平有更大水平的提高，但发生作用的途径可能并非是实验设计中原本所设想的BNIP3途径。以上结果均未表现出由肌纤维类型不同的而造成明显差异。

结论：4周运动可使骨骼肌形态机能发生改变，肌纤维面积变化因肌肉类型而异。4周中等强度运动及4周大强度运动均可诱导骨骼肌线粒体自噬水平的提高，其中BNIP3途径的自噬作用在中等强度运动中更为明显。4周大强度运动诱导的自噬水平的提高程度大于4周中等强度运动，但其BNIP3表达情况与假设不同，有发生其他途径自噬的可能，仍需进一步探究。

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文题释义：
BNIP3：隶属于Bcl-2蛋白超家族，是一种线粒体促凋亡蛋白，可与腺病毒转录基因E1B编码的蛋白或Bcl-2蛋白结合。可起到促进细胞凋亡、引起线粒体去极化和自噬，在机体中发挥重要作用。
线粒体自噬：线粒体是细胞的能量工厂，其功能还涉及细胞代谢、信号传导、分化、生长、凋亡和死亡等重要过程。线粒体自噬(mitophagy)是细胞清除损伤或衰老的线粒体，并循环利用其组成元素的过程；与衰老、神经退行性疾病和癌症等诸多生理病理过程密切相关。

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迄今为止，已在骨骼肌细胞中验证BNIP3能够促进自噬的发生。自噬是许多细胞发生的基本现象，自噬通过清除蛋白质和线粒体来维持细胞存活，清除受损的线粒体对细胞的生存是必要的，抑制自噬将引起坏死样的细胞死亡。

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