大鼠关节软骨来源祖细胞的分离鉴定及成软骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1756

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (21): 3364-3370.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1756

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

大鼠关节软骨来源祖细胞的分离鉴定及成软骨分化

沈序¹，陆英杰¹，路冬冬¹，方跃鹏¹，周乃慧²，朱雪松¹，朱月倩²

苏州大学附属第一医院，¹骨科，²皮肤科，江苏省苏州市 215006

修回日期:2019-03-10 出版日期:2019-07-28 发布日期:2019-07-28
通讯作者: 朱月倩，副主任医师，苏州大学附属第一医院皮肤科，江苏省苏州市 215006；并列通讯作者：朱雪松，研究员，苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006
作者简介:沈序，男，1992年生，江苏省苏州市人，汉族，在读硕士，主要从事软骨组织工程研究。并列第一作者：陆英杰，男，1992年生，江苏省昆山市人，汉族，2018年苏州大学毕业，硕士，医师，主要从事脊柱外科研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81772358)，项目负责人：朱雪松；国家自然科学基金(81703144)，项目负责人：周乃慧；江苏省自然科学基金青年基金项目(BK20160350)，项目负责人：朱月倩；国家重点研发计划(SQ2018YFA010178)，项目参与人：朱雪松

Isolation, identification and chondrogenic differentiation of rat articular cartilage-derived progenitor cells

Shen Xu¹, Lu Yingjie¹, Lu Dongdong¹, Fang Yuepeng¹, Zhou Naihui², Zhu Xuesong¹, Zhu Yueqian²

¹Department of Orthopedics, ²Department of Dermatology, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China

Revised:2019-03-10 Online:2019-07-28 Published:2019-07-28
Contact: Zhu Yueqian, Associate chief physician, Department of Dermatology, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; Zhu Xuesong, Researcher, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
About author:Shen Xu, Master candidate, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China. Lu Yingjie, Master, Physician, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China. Shen Xu and Lu Yingjie contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81772358 (to ZXS) and 81703144 (to ZNH); the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (the Youth Program), No. BK20160350 (to ZYQ); the National Key R&D Program of China, No. SQ2018YFA010178 (to ZXS)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
关节软骨来源祖细胞：是一种主要位于关节软骨表层的软骨细胞，占软骨细胞含量的0.1%-1%，同时具有间充质细胞和软骨细胞的特点。关节软骨来源祖细胞具有比其他间充质细胞更强的软骨分化能力，同时其成骨分化能力有限，是软骨组织工程的理想种子细胞。
纤连蛋白分选：纤连蛋白是从动物血清中提取的一种蛋白质，最早是将其铺板用于皮肤干细胞的分离提纯，后发现可通过纤连蛋白黏附从软骨细胞中获得一批具有强增殖能力的软骨来源祖细胞，其差异性黏附机制可能是由于软骨来源祖细胞表达更高水平的整合素α5和β1，可特异性地和纤连蛋白结合。

摘要
背景：关节软骨来源祖细胞具有较强的软骨分化能力，同时其成骨分化能力有限，但是经过扩增后其细胞特性是否会发生改变及如何改变目前仍没有相关报道。
目的：观察不同代次关节软骨来源祖细胞增殖、成骨和成软骨能力的改变情况，并与骨髓间充质干细胞相比较。
方法：利用纤连蛋白分选从关节软骨细胞中获得关节软骨来源祖细胞。通过克隆形成实验和CCK-8实验观察关节软骨来源祖细胞增殖能力改变；通过茜素红染色和成骨相关基因表达观察关节软骨来源祖细胞和骨髓间充质干细胞成骨分化潜能的变化；通过Ⅱ型胶原免疫组化染色和成软骨相关基因表达观察关节软骨来源祖细胞和骨髓间充质干细胞成软骨分化潜能的变化。
结果与结论：①通过纤连蛋白分选可从关节软骨细胞中获得具有干细胞特性的关节软骨来源祖细胞，其具有较强增殖能力以及成骨、成软骨分化潜能；②CCK-8和克隆形成实验结果显示随着细胞代次的增加，关节软骨来源祖细胞增殖能力略有下降；③骨髓间充质干细胞具有较强的成骨分化潜能，并且随着细胞扩增未有明显改变，成软骨分化潜能随着细胞扩增逐渐降低；④关节软骨来源祖细胞具有较强的成软骨潜能，并且随着细胞扩增未有明显改变，成骨分化潜能随着细胞扩增逐渐降低；⑤结果表明，关节软骨来源祖细胞的成骨潜能明显低于骨髓间充质干细胞并且随着细胞扩增逐渐减低，成软骨潜能高于骨髓间充质干细胞并且随着细胞扩增成软骨能力未有明显改变，说明关节软骨来源祖细胞可能是一种更加理想的软骨组织工程种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3579-2741(朱雪松)

关键词: 关节软骨来源祖细胞, 骨髓间充质干细胞, 成骨潜能, 成软骨潜能, 软骨组织工程, 纤连蛋白分选, ；细胞增殖, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Articular cartilage-derived progenitor cells have strong chondrogenic differentiation ability and limited osteogenic differentiation ability. However, it is unclear whether and how the cellular characteristics of articular cartilage-derived progenitor cells after amplification change.
OBJECTIVE: To observe the proliferation, osteogenesis and chondrogenesis ability of articular cartilage-derived progenitor cells in different generations as compared with bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Articular cartilage-derived progenitor cells were sorted from chondrocytes by using differential adhesion to fibronectin. Cell counting kit-8 and colony formation assay were used to observe the proliferative capacity of articular cartilage-derived progenitor cells. Osteogenic differentiation potential of articular cartilage-derived progenitor cells and bone marrow mesenchymal stem cells were measured by alizarin red staining and determination of osteogenic gene expression. Collagen II immunohistochemical staining and determination of chondrogenic-related gene expression were used to measure the change in the chondrogenic ability of articular cartilage-derived progenitor cells and bone marrow mesenchymal stem cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Articular cartilage-derived progenitor cells sorted by fibronectin had strong proliferation ability, osteogenic and chondrogenic differentiation potential. The results of cell counting kit-8 and colony formation assay showed that articular cartilage-derived progenitor cells had a slight decrease in cell proliferation during cell expansion. Bone marrow mesenchymal stem cells presented with strong osteogenic potential throughout cell expansion, while the chondrogenic potential of the cells decreased gradually during cell expansion. Articular cartilage-derived progenitor cells had strong chondrogenic potential with no considerable change during cell expansion, while the osteogenic potential of the cells decreased gradually significantly during cell expansion. To conclude, the osteogenic potential of articular cartilage-derived progenitor cells was significantly lower than that of bone marrow mesenchymal stem cells, and it gradually decreased during cell expansion. The chondrogenic potential of articular cartilage-derived progenitor cells was higher than that of bone marrow mesenchymal stem cells, but there was no significant change during cell expansion. These findings indicate that articular cartilage-derived progenitor cells may be an ideal kind of seed cells for cartilage tissue engineering.

Key words: articular cartilage-derived progenitor cells, bone marrow mesenchymal stem cells, osteogenic potential, chondrogenic potential, cartilage tissue engineering, fibronectin sorting, cell proliferation, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

沈序，陆英杰，路冬冬，方跃鹏，周乃慧，朱雪松，朱月倩. 大鼠关节软骨来源祖细胞的分离鉴定及成软骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(21): 3364-3370.

Shen Xu, Lu Yingjie, Lu Dongdong, Fang Yuepeng, Zhou Naihui, Zhu Xuesong, Zhu Yueqian. Isolation, identification and chondrogenic differentiation of rat articular cartilage-derived progenitor cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(21): 3364-3370.

图/表（结果） 2

2.1 ACPCs的细胞形态和细胞活性 在倒置显微镜下观察，经过纤连蛋白分选后的ACPCs均为中间宽两边细长的短梭形，与间充质细胞的典型细胞形态类似。随着细胞代次的增加，在相同时间内ACPCs的细胞密度逐渐降低，但在细胞形态上未有明显改变，见图1A。

CCK-8结果显示，同一代次ACPCs的吸光度值随着培养时间延长持续升高；同一时间ACPCs的吸光度值在原代最高，其次是第1代，最后是第2代，培养1，3，5，7，9 d时原代与第1代，第1代与第2代差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图1B。

2.2 ACPCs的流式细胞鉴定结果 纤连蛋白分选后获得的大鼠ACPCs进行流式细胞鉴定，流式细胞仪计数结果显示：间充质细胞标志物CD29、CD73表达为强阳性，分别为96.8%和94.2%，CD90、CD105表达为阳性，分别为40.6%和67.0%，软骨来源祖细胞备选特异性标志物Notch-1表达为阳性，为33.7%；非干细胞标志物CD31、CD44、CD45表达弱阳性或阴性，分别为3.17%，5.15%和1.85%，见图1C。

2.3 ACPCs克隆形成实验结果 在各个代次细胞培养皿底部均有多个ACPCs单细胞克隆形成，见图2A。随后对不同代次细胞形成的克隆数进行比较，可见随着细胞代次的增加，ACPCs克隆数明显下降。对直径大于2 mm的克隆进行计数，不同代次之间差异有显著性意义(P < 0.000 1)，见图2B。

2.4 成骨诱导结果 在肉眼下观察，ACPCs成骨诱导组橙红色范围随着代次增加逐渐减少。原代橙红色范围为孔中心及周围，颜色较深；第1代仅孔周围有部分橙红色区域，中心为蓝色区域；第2代孔内基本为浅蓝色区域。BMSCs成骨诱导组在原代、第1代和第2代均可见孔内区域为橙红色，橙红色范围随着细胞代次增加未见明显改变，见图3A。

在倒置显微镜下观察，ACPCs成骨诱导组在原代可见多个钙结节，第1代1个视野中仅可见1个钙结节，第2代无钙结节形成。BMSCs成骨诱导组在原代、第1代和第2代视野内基本均为橙红色钙结节，3个代次之间的差异不明显，见图3A。

ACPCs的RT-PCR结果显示，成骨诱导组的成骨相关基因AKP、osteocalcin均明显高于非诱导组，差异有显著性意义(P < 0.05)，成骨相关基因在不同代次之间是逐渐降低的，在原代与第1代之间的降低幅度尤为明显，AKP、osteocalcin的表达在原代与第1代之间差异无显著性意义(P > 0.05)，在第1代与第2代之间差异无显著性意义(P > 0.05)，但原代与第2代之间差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3B。

BMSCs的RT-PCR结果显示，AKP、osteocalcin的表达在原代与第1代、第1代与第2代之间差异无显著性意义(P > 0.05)，原代与第2代之间差异也无显著性意义(P > 0.05)，见图3C。

2.5 成软骨诱导结果 在成软骨诱导21 d后，对细胞团块进行组织学染色分析，ACPCs成软骨诱导组细胞团块中有软骨组织典型结构，即软骨陷窝产生；Ⅱ型胶原染色可见ACPCs构建的团块全部为棕色阳性染色，不同代次之间阳性染色没有明显差异。BMSCs成软骨诱导组细胞团块中仅有部分区域有软骨陷窝产生；Ⅱ型胶原染色可见BMSCs构建的团块大部分组织为棕色阳性染色，且阳性染色区域随着细胞代次的增加而减少，到第2代时Ⅱ型胶原染色明显降低，见图4A。

ACPCs的RT-PCR结果显示，成软骨诱导组成软骨相关基因Aggrecan、COLⅡ、SOX9均明显高于非诱导组，差异有显著性意义(P < 0.05)，Aggrecan、COL-Ⅱ、SOX9的表达在原代与第1代之间及第1代与第2代之间表达有减低，但基因表达差异无显著性意义(P > 0.05)，原代与第2代之间差异也无显著性意义(P > 0.05)，见图4B。

BMSCs的RT-PCR结果显示，成软骨诱导组成软骨相关基因Aggrecan、COL-Ⅱ、SOX9均明显高于非诱导组，差异有显著性意义(P < 0.05)，Aggrecan、COL-Ⅱ、SOX9的表达在原代与第1代及第1代与第2代之间表达有减低，基因表达差异均无显著性意义(P > 0.05)，但在原代与第2代之间差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4C。

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引言

骨关节炎是最常见的肌肉骨骼系统疾病，其主要病理改变是关节软骨的进行性丢失、软骨下骨硬化、骨赘形成和滑膜炎症^[1-5]。在骨性关节炎的发病过程中，关节软骨是最早和主要的病变部位。

关节软骨无血管及神经分布，细胞含量少，损伤后无法通过自我完全修复，临床上常用微骨折、骨软骨移植术、自体软骨细胞植入等方法修复关节软骨损伤，但是这些技术尚存在不足，例如微骨折修复的软骨缺损多为纤维软骨组织，骨软骨移植术常常会发生移植物的松动，自体软骨细胞移植在体外扩增时软骨细胞会逐渐失去其软骨细胞特性，因此这些治疗方法仍不能实现理想的软骨缺损修复^[6-13]。近年来应用组织工程方法修复软骨缺损的研究受到了越来越多人的关注。

种子细胞、生物材料和生长因子是软骨组织工程的三要素。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)来源丰富且易于获得，是现阶段最常用的软骨组织工程种子细胞^[14-15]，但是BMSCs构建的软骨组织植入体内后容易发生软骨肥厚和软骨内骨化^[16-18]，极大地限制其临床应用。关节软骨来源祖细胞(articular cartilage-derived progenitor cells，ACPCs)来自关节软骨，同时具有间充质细胞和软骨细胞的特点^[19]，是软骨组织工程的理想种子细胞来源之一。目前比较成熟的获取ACPCs的方法是纤连蛋白黏附法^[20-24]。由于软骨组织构建需要大量有功能的种子细胞，此实验拟通过纤连蛋白分选获取高纯度大鼠ACPCs，比较ACPCs与BMSCs的成骨及成软骨分化能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 干细胞培养实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年3月至2018年7月在苏州大学附属第一医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 雄性SD大鼠，5 d龄，SPF级，用于ACPCs的提取与培养；雄性SD大鼠，4周龄，SPF级，用于BMSCs的提取与培养；大鼠均由昭衍苏州新药研究中心提供，实验动物机构许可证号：SCXK(苏)2018-0006。

1.3.2 实验试剂 胎牛血清、青链霉素、0.25%EDTA-胰蛋白酶、α-MEM(Gibco公司)；DMEM/F12(1∶1)、高糖DMEM(Hyclone公司)；CD29-PE、CD31-APC、CD44-APC、CD45-FITC、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、Notch-1-PE (Biolegend公司)；碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1(R&D公司)；CCK-8(东仁化学)；Trizol(Invitrogen公司)；反转录试剂盒(Takara公司)；纤连蛋白、地塞米松、β-磷酸甘油、L-抗坏血酸-2-磷酸酯(Vc)(Sigma公司)；结晶紫(碧云天)；茜素红S染色试剂盒(天恩泽)；Ⅱ型胶原一抗(Abcam公司)；RT-PCR引物(金唯智)；胶原酶(Serva公司)。

1.3.3 实验仪器 PCR仪(Bio-Rad公司)；全波长酶标仪(BioTek公司)；流式细胞仪(Guava easyCyte HT)；倒置显微镜、正置显微镜(蔡司)。

1.4 实验方法

1.4.1 ACPCs的提取与培养

(1)纤连蛋白铺板：将预先配好的10 mg/L纤连蛋白加入10 cm培养皿中铺满培养皿底部，密封后置于4 ℃冰箱过夜。

(2)软骨组织消化：在超净台中无菌条件下取5 d龄SD大鼠各大关节软骨，PBS冲洗3遍，0.25%胰酶消化10 min，DMEM/F12(1∶1)完全培养基中和，PBS冲洗3遍，加入0.2%Ⅳ型胶原酶，置于37 ℃恒温床震荡消化6-8 h。

(3)ACPCs的纤连蛋白分选：将消化好的组织混合液用40 μm单细胞滤器过滤，1 500 r/min离心5 min，加入DMEM/F12(1∶1)完全培养基重悬。以1×10⁶/皿接种于表面铺有纤连蛋白的培养皿中，37 ℃、体积分数为5%CO₂条件下培养18 min。将上层液体吸去，用DMEM/F12(1∶1)完全培养基冲洗1遍后，每皿加入10 mL DMEM/F12(1∶1)完全培养基培养，细胞长到80%-90%融合后传代，分别使用原代、第1代、第2代细胞进行以下实验。

1.4.2 BMSCs的提取及培养 在无菌条件下，取4周龄雄性SD大鼠双侧股骨和胫骨，保持骨髓腔密闭，用无菌剪剪开长骨的两端，借助注射器，用α-MEM完全培养基冲洗骨髓腔，用10 cm培养皿收集冲洗液，在37 ℃、体积分数为5%CO₂条件下培养，48 h及72 h各换液1次，去除悬浮细胞。细胞长到80%左右融合后传代，分别使用原代、第1代、第2代细胞进行以下实验。

1.4.3 ACPCs及BMSCs成骨诱导分化 将收集到的原代、第1代、第2代ACPCs及BMSCs以每孔5×10⁴个种于6孔板中，在37 ℃、体积分数为5%CO₂条件下培养，待细胞长至70%-80%后，更换为成骨诱导培养基(含体积分数为10%胎牛血清、1%青链霉素、10 mg/L维生素C、2.16 g/L β-磷酸甘油、40 μg/L地塞米松的高糖DMEM培养基)，对照组为含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基。每3 d换1次液，在倒置显微镜下观察细胞状态和生长情况，诱导21 d后进行茜素红S染色，具体操作步骤：吸去6孔板中液体，每孔加入2 mL PBS，冲洗2遍；每孔加入2 mL无水乙醇，30 min后吸去液体自然晾干；每孔加入1 mL蒸馏水，冲洗2遍；每孔加入1 mL茜素红S染色液，20 min后吸去茜素红S染色液；每孔加入1 mL蒸馏水，冲洗4遍，完成茜素红S染色。倒置显微镜下观察钙结节，红色为阳性染色。

1.4.4 ACPCs及BMSCs成软骨诱导分化 将收集到的原代、第1代、第2代ACPCs和BMSCs以每管0.5×10⁶个置于15 mL离心管中，1 500 r/min离心5 min，静置3 d获得细胞团块，更换成软骨诱导培养基(含体积分数为10%胎牛血清、1%青链霉素、10 μg/L转化生长因子β1、50 μg/L胰岛素样生长因子1、40 μg/L地塞米松的高糖DMEM培养基)，对照组为含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，每3 d换1次液，诱导21 d后，细胞团块进行石蜡包埋，然后进行Ⅱ型胶原免疫组化染色，棕色为阳性结果。

1.4.5 流式细胞术鉴定 取原代ACPCs，用含体积分数为1%胎牛血清的PBS将ACPCs重悬成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1，分别加入CD29-PE、CD31-APC、CD44-APC、CD45-FITC、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE抗体，空白对照组无流式抗体。在4 ℃下孵育30 min，并每隔5 min晃动5次，在4 ℃下以1 800 r/min离心5 min，PBS冲洗2遍，用含体积分数为1%胎牛血清的PBS重悬，流式细胞仪检测表面标志物荧光表达。

1.4.6 细胞增殖能力检测 取原代、第1代、第2代ACPCs，以每孔1 000个种于96孔板中，分别在1，2，3，5，7，9 d加入含有10%CCK-8试剂的DMEM/F12(1∶1)完全培养基，在37 ℃下孵育2 h，吸取上层液体，在酶标仪上测定450 nm处吸光度值。

1.4.7 克隆形成实验 取原代、第1代、第2代ACPCs，以5 000个/皿种于培养皿中，每3 d换1次液，培养2周后行结晶紫染色，镜下观察集落细胞形态，计算直径大于2 mm的细胞集落数。

1.4.8 RT-PCR检测成骨(AKP、osteocalcin)、成软骨(Aggrecan、COL-Ⅱ和SOX9)基因的表达 上述ACPCs及BMSCs成骨、成软骨诱导21 d，采用Trizol法提取总RNA，用反转录试剂盒获得cDNA。1 μL cDNA混合液、各0.5 μL上下游引物、8 μL SYBR Green、12 μL DEPC水混匀后，进行RT-PCR检测。PCR扩增条件：95 ℃温度下预变性30 s，95 ℃温度下变性5 s，60 ℃温度下延伸30 s，用荧光法作定量分析，重复40次实验。GAPDH作为内参基因。引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 ①ACPCs的细胞形态、增殖能力、克隆数及克隆株细胞形态；②ACPCs及BMSCs茜素红染色结果；③ACPCs及BMSCs的Ⅱ型胶原免疫组化染色结果；④ACPCs及BMSCs成骨、成软骨相关mRNA表达。

1.6 统计学分析 实验数据以x(_)±s表示，采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，用成组t 检验计算P值，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

ACPCs是主要位于关节软骨表层的一类具有干细胞特性的细胞，其同时具有间充质细胞和软骨细胞的特性，与骨髓和脂肪来源的间充质细胞相比，其具有更强的软骨分化能力，能够分泌更多的细胞外基质，在体外成软骨诱导时不会产生软骨终末分化相关的RUNX2，成骨分化倾向有限^[16^，^25-26]。

纤连蛋白分选ACPCs的机制：与软骨细胞相比，ACPCs表达更高水平的整合素α5和β1，ACPCs可以优先黏附于涂有纤连蛋白的培养皿上，并具有较强的细胞集落形成能力^[21^，^27]。

克隆形成实验和CCK-8实验检测结果说明经过纤连蛋白分选的细胞具有间充质细胞的强增殖能力；通过成骨、成软骨诱导的阳性结果，说明经过分选后的细胞具有多向分化能力；CD73、CD90、CD105阳性表达，其他造血系表面标志物为阴性，鉴定细胞为间充质细胞。根据以上多项检测表明采用纤连蛋白分选的方法从大鼠关节软骨中获得的细胞为ACPCs。

虽然ACPCs具有间充质细胞的增殖能力，但是由于其在软骨中含量少，占软骨细胞含量的0.1%-1%^[28]，现行的软骨组织工程体外构建软骨组织方法是模拟体内一系列细胞的募集、迁移、聚集、浓集以及软骨细胞分化的软骨生长过程。该方法需要大量的细胞用于构建软骨组织，因此需要进行体外扩增才能有足够的细胞用于软骨组织工程。已经有不少研究发现ACPCs具有很强的成软骨分化潜能，但是其在扩增后分化能力是否会产生改变尚不明确。该实验对不同代次ACPCs的增殖和成骨、成软骨能力进行研究，并与BMSCs进行了比较。

对不同代次的细胞进行比较，可以发现ACPCs增殖能力随着细胞代次的增加而降低，这也与之前的文献报道说明ACPCs在细胞倍增40-50次后出现衰老表型相符^[29]。

由成骨诱导茜素红染色和mRNA成骨相关基因表达的结果可以看出，BMSCs具有较强的成骨分化潜能，随着代次的增加其成骨能力未有明显降低，提示应用BMSCs修复软骨组织有更大的骨化倾向；ACPCs的成骨潜能随着代次的增加出现降低趋势。由成软骨诱导Ⅱ型胶原免疫组化染色和mRNA成软骨相关基因表达的结果可以看出，BMSCs经过成软骨诱导后，其Ⅱ型胶原表达随代次增加明显降低，而ACPCs经过成软骨诱导后，能稳定形成具有软骨陷窝的团块，并有大量的Ⅱ型胶原产生，不同代次Ⅱ型胶原表达未有明显差异，说明BMSCs在扩增过程中逐渐失去其成软骨分化潜能；而ACPCs的成软骨能力并未随细胞扩增而明显减弱，因此更适用于修复软骨组织缺损，维持软骨的正常功能。该研究主要评价了ACPCs与BMSCs的成骨和成软骨分化潜能，并未对ACPCs的成软骨潜能的机制进行深入探讨，这也是该研究的不足之处，在后续的研究中会进一步深入探讨相关机制。

综上所述，通过纤连蛋白分选可从大鼠关节软骨中获得具有增殖和多向分化能力的大鼠ACPCs。与BMSCs相比，ACPCs具有如下的优点：①ACPCs随着体外扩增代次增加，成骨能力逐渐下降；②ACPCs在扩增同时其成软骨潜能未有明显的改变。ACPCs可能是一种更加理想的软骨组织工程种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

大鼠关节软骨来源祖细胞的分离鉴定及成软骨分化

Isolation, identification and chondrogenic differentiation of rat articular cartilage-derived progenitor cells

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