急性脊髓损伤后48 h内外周血细胞因子的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1154

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (15): 2409-2414.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1154

• 组织构建与生物活性因子 tissue construction and bioactive factors • 上一篇下一篇

急性脊髓损伤后48 h内外周血细胞因子的变化

黄建华1，曾高峰2，岑忠喜1，邓贵营1，高云兵1，宗少晖1

(1广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科，广西壮族自治区南宁市 530021；2广西医科大学公共卫生学院，广西壮族自治区南宁市 530021)

收稿日期:2018-12-07 出版日期:2019-05-28 发布日期:2019-05-28
通讯作者: 宗少晖，教授，主任医师，博士生导师，广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科，广西壮族自治区南宁市 530021 并列通讯作者：曾高峰，教授，博士生导师，广西医科大学公共卫生学院，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:黄建华，男，1989年生，广西壮族自治区崇左市人，壮族，广西医科大学在读硕士，主要从事脊柱外科学方面的研究。
基金资助:
广西重点研发计划(桂科AB18221021)，项目负责人：宗少晖；广西高等学校高水平创新团队及卓越学者计划，项目负责人：宗少晖

Changes of cytokines in peripheral blood within 48 hours after acute spinal cord injury

Huang Jianhua1, Zeng Gaofeng2, Cen Zhongxi1, Deng Guiying1, Gao Yunbing1, Zong Shaohui1

(1Department of Spine Osteopathia, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2School of Public Health, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China)

Received:2018-12-07 Online:2019-05-28 Published:2019-05-28
Contact: Zong Shaohui, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Spine Osteopathia, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Corresponding author: Zeng Gaofeng, Professor, Doctoral supervisor, School of Public Health, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Huang Jianhua, Master candidate, Department of Spine Osteopathia, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the Major Research and Development Project of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. AB18221021(to ZSH); the High-Level Innovation Group and Leading Scholar Program of Guangxi Universities (to ZSH)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脊髓损伤：按病理机制可分为原发性与继发性损伤。前者指脊髓遭受外力冲击下直接导致的脊髓机械性损伤，属永久性损伤；后者指在原发性损伤基础上引发瀑布式级联反应而导致的组织进行性、自毁性破坏过程，属可逆性损伤。
脊髓损伤微环境改变：脊髓损伤后，早期病理变化为结构破坏、局部组织水肿、神经元损伤及脊髓组织缺血损害等，继而产生一系列病理生理改变。一方面脊髓损伤后刺激机体产生各类免疫炎症因子，诱导炎症级联反应、加重其损伤的程度，加快神经细胞死亡及脱髓鞘，最后神经胶质增生及瘢痕形成；另一方面，脊髓损伤后也会刺激机体生成一系列神经营养因子，保护受损神经系统、促进其分化和再生，加快神经功能恢复。

摘要
背景：急性脊髓损伤后微环境的改变是引起继发性损伤的主要因素，因此探讨急性脊髓损伤后微环境的改变对临床诊疗具有重要意义。
目的：探讨急性脊髓损伤48 h内患者的外周血白细胞介素6、脑源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经营养因子3及神经营养因子4的表达水平及临床意义。
方法：选择2016年10月至2018年6月广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科收治的急性脊髓损伤48 h内的患者29例，按照ASIA神经功能分级标准分为：完全性脊髓损伤11例；不完全性脊髓损伤18例；选取股骨头缺血性坏死患者13例作为对照组。采用酶联免疫吸附法测定42例患者外周血白细胞介素6、脑源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经营养因子3及神经营养因子4的表达水平，并相互比较。
结果与结论：酶联免疫吸附测定显示，脊髓损伤组外周血白细胞介素6、脑源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经营养因子3及神经营养因子4表达水平明显高于对照组(P < 0.05)；其中完全性脊髓损伤组外周血中白细胞介素6、脑源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经营养因子3及神经营养因子4表达水平明显高于不完全性脊髓损伤组(P < 0.05)。结果证实，急性脊髓损伤后白细胞介素6、脑源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经营养因子3及神经营养因子4表达水平升高，提示这些细胞因子可能参与急性脊髓损伤后重要的病理生理过程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-8720-3737(黄建华)

关键词: 脊髓损伤, 细胞因子, 白细胞介素6, 脑源性神经营养因子, 碱性成纤维细胞生长因子, 神经营养因子3, 神经营养因子4

Abstract:

BACKGROUND: Change of microenvironment after acute spinal cord injury is the main factor causing secondary injury, so it is of great significance to investigate the changes of microenvironment after acute spinal cord injury for clinical diagnosis and treatment.
OBJECTIVE: To investigate the expression levels and clinical significance of interleukin-6, brain derived neurotrophic factor, basic fibroblast growth factor, neurotrophin-3 and neurotrophin-4 in peripheral blood within 48 hours after acute spinal cord injury.
METHODS: Twenty-nine patients with acute spinal cord injury admitted at the Department of Spinal Osteopathia, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University from October 2016 to June 2018 were enrolled, and were divided into two groups according to American Spinal Injury Association impairment scale: complete spinal cord injury (n=11) and incomplete spinal cord injury (n=18). Thirteen patients with avascular necrosis of the femoral head were selected as controls. The expression levels of interleukin-6, brain derived neurotrophic factor, basic fibroblast growth factor, neurotrophin-3 and neurotrophin-4 in peripheral blood of 42 patients were determined by ELISA and compared.
RESULTS AND CONCLUSION: The ELISA results showed that the expression levels of interleukin-6, brain derived neurotrophic factor, basic fibroblast growth factor, neurotrophin-3 and neurotrophin-4 in peripheral blood in the spinal cord injury group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05). The expression levels of all above cytokines in the complete spinal cord injury group were significantly higher than those in the incomplete spinal cord injury group (P < 0.05). In summary, increased expression of interleukin-6, brain derived neurotrophic factor, basic fibroblast growth factor, neurotrophin-3, neurotrophin-4 after acute spinal cord injury indicates that it may participate in the important pathophysiological process after acute spinal cord injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Spinal Cord Injuries, Cytokines, Tissue Engineering

中图分类号:

R446
R604

黄建华，曾高峰，岑忠喜，邓贵营，高云兵，宗少晖. 急性脊髓损伤后48 h内外周血细胞因子的变化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(15): 2409-2414.

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图/表（结果） 3

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引言

脊髓损伤是一种常见的、高发性及高致残率的中枢神经系统损伤性疾病，临床主要表现为严重的四肢运动、感觉及括约肌功能性障碍，严重影响患者生活质量。而随着社会经济的快速发展，全球每年遭受脊髓损伤折磨的患者呈逐年增高趋势，这给患者、家庭及社会造成沉重的经济负担^[1]。

脊髓损伤后的神经病理改变主要包括原发性和继发性损伤，前者指脊髓遭受外力冲击下直接造成的脊髓解剖结构机械性损伤，属永久性损伤；而后者指在原发性损伤基础上引发瀑布式级联反应而导致的组织进行性、自毁性破坏过程，属可逆性损伤^[2]。

急性脊髓损伤后引发的继发性脊髓损伤涉及一系列复杂的病理、生理过程，一方面脊髓损伤后刺激机体产生各类免疫炎症因子，引起组织水肿、血管破坏、免疫及炎症细胞浸润，进而诱导炎症级联反应、加重脊髓损伤的程度^[3]，加快神经细胞死亡及脱髓鞘，最后神经胶质增生及瘢痕形成^[4]；另一方面，脊髓损伤后也会刺激机体生成一系列神经营养因子，保护受损神经系统、促进其分化、再生，加快神经功能恢复^[5]。急性脊髓损伤后微环境会发生显著改变，而在其发生的病理、生理过程中血白细胞介素6、脑源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经营养因子3及神经营养因子4具有关键的调节作用。

白细胞介素6是一种多功能、重要的促炎因子，主要由神经元和星形胶质细胞产生^[6]。有研究报道其可作为急性脊髓损伤后炎症反应损伤程度的早期指标，其在中枢神经系统损伤后即表达上升，且损伤程度越重，血中白细胞介素6的水平越高，在脊髓损伤后的免疫炎性反应中起促进作用，可能是导致局部炎症反应扩大，造成继发性损害的重要因素^[7]。脑源性神经营养因子作为体内水平最多的神经营养因子，对脊髓损伤组织及神经具有较强的修复和再生功能^[8]。Zhou 等^[9]研究发现脑源性神经营养因子作为目的基因转入受体细胞中对脊髓损伤后神经的保护、再生及功能的恢复具有明显的促进作用。碱性成纤维细胞生长因子是作为一种具有广泛生物学活性的神经营养因子，主要存在神经系统内，对神经细胞的发育、生长、分化及再生有重要调节作用^[10]；Fahmy等^[11]发现碱性成纤维细胞生长因子对脊髓损伤的再生和修复具有重要意义。神经营养因子3和神经营养因子4也是神经系统重要的生物活性因子，具有明显神经营养作用的蛋白分子，在神经系统的生长、发育、正常分化、功能的维持及损伤修复中均具有重要生物学作用^[12]。

多年来，脊髓损伤的治疗一直是医学界的难题，而对其研究也在不断深入，但其发病的病理生理机制仍尚未完全阐明。目前对于脊髓损伤的研究主要集中于继发性损伤的恢复，急性脊髓损伤后导致受损局部微环境恶劣，是引起中枢神经系统继发性损害、轴突再生及功能恢复困难的主要因素，而解决的关键在于如何抑制脊髓损伤后的免疫炎症反应、减少神经细胞死亡，而促进中枢神经再生及功能恢复^[13]。因此，如何控制神经生长的促进因素、抑制因素，创造稳定的生长环境是目前研究的热点。研究发现，中枢神经存在再生能力，而脊髓损伤后炎症反应及神经营养因子缺乏是影响神经再生及功能恢复的主要因素^[14]。

为此，实验通过采用酶联免疫吸附法测定外周血白细胞介素6、脑源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经营养因子3及神经营养因子4的表达水平，初步探讨这些细胞因子在急性脊髓损伤后的改变情况及其临床意义，从而进一步探讨这些因子在急性脊髓损伤的发病机制中可能起到的作用。

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材料方法

1.1 设计酶联免疫吸附法测定脊髓损伤患者细胞因子水平变化的研究。
1.2 时间及地点病例均收集自2016年10月至2018年6月广西医科大学第一附属医院脊柱外科，于广西医科大学实验中心完成。
1.3 对象病例均收集自2016年10月至2018年6月广西医科大学第一附属医院脊柱外科。试验经广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准。
急性脊髓损伤患者29例(男20例、女9例)，其中完全性损伤组11例，男9例、女2例，年龄41-72岁，平均(53.91±9.14)岁；不完全性损伤组18例，男12例、女6例，年龄30-76岁，平均(49.72±10.70)岁。高处坠落伤为6例，车祸伤3例，跌伤(摔伤)17例，重物砸伤3例。损伤部位为颈髓段21例，胸髓段6例，腰髓段2例，受伤至就诊48 h内。均进行X射线、CT及MRI等影像学检查并保存有完整的病历资料。

对照组：股骨头缺血性坏死患者13例，男7例，女6例，年龄25-67岁，平均(49.00±13.96)岁。

1.3.1 脊髓损伤患者纳入标准 ①患者均符合急性脊髓损伤的临床诊断标准^[15-16]；②影像学资料提示有相应节段脊髓受损，且与临床表现一致；③签署知情同意书者。

1.3.2 脊髓损伤患者排除标准 ①既往有传染性疾病、感染性疾病、自身免疫疾病患者；②既往有中枢神经系统疾病；③接受过脊髓手术及激素、免疫治疗者及其他不符合实验者。

1.3.3 对照组纳入标准 ①股骨头缺血性坏死者；②签署知情同意书者。

1.3.4 对照组排除标准 ①股骨骨折者；②糖尿病者；③妊娠者。

1.3.5 ASIA脊髓损伤分类标准^[16] A级(完全性损伤)：损伤神经平面以下以及骶段S₄_-₅(鞍区)无任何运动及感觉功能保留；B级(不完全性损伤)：损伤神经平面以下以及骶段S₄_-₅区尚有感觉功能保留，但无任何运动功能保留；C级(不完全性损伤)：损伤神经平面以下有运动功能保留，但一半以上的关键肌肌力 < 3级；D级(不完全性损伤)：在脊髓损伤神经平面以下有运动功能保留，而至少有一半的关键肌肌力大于或等于3级；E级(正常)：感觉和运动功能正常。

1.4 实验方法

1.4.1 血样本收集患者的血样本在受伤后48 h内且未行治疗前采集，均用EDTA抗凝管采集外周静脉血样本，随后立即离心15 min(4 ℃，1 000 r/min)并收集血清，储藏于-80 ℃冰箱以备检测。

1.4.2 检测方法采用ELISA法检测外周血中白细胞介素6、脑源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经营养因子3及神经营养因子4水平，酶联免疫吸附试剂盒由上海斯信生物科技有限公司提供，检测仪器采用全自动酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

主要实验方法与步骤：按试剂盒说明书将标准品倍比稀释，加入相应的样本、抗体、酶，然后37 ℃温育60 min重复洗板5次，加入显色剂，37 ℃避光显色10 min，每孔加入终止液50 μL，然后酶标仪测定 450 nm波长下每孔吸光度值，根据吸光度值和标准品浓度做出标准曲线并计算出对应样品浓度。

1.5 主要观察指标各组外周血中白细胞介素6、脑源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经营养因子3及神经营养因子4表达水平。

1.6 统计学分析采用 SPSS 17.0软件进行数据分析，计量资料均采用x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析和LSD检测，计数资料用百分率表示，组间比较采用χ²检验，P < 0.05 表示两组差异有显著性意义。

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讨论

3.1 白细胞介素6在脊髓损伤发病机制中的作用炎症反应是脊髓损伤后产生继发性损伤的主要病理过程，各种炎性因子在炎症反应过程中起着重要的作用。其中，白细胞介素6是一种多功能、重要的促炎因子，可由多种免疫细胞刺激产生，在脊髓损伤后主要由神经元和星形胶质细胞产生^[6]。

白细胞介素6在脊髓损伤后的免疫炎性反应中起促进作用，有报道其可作为脊髓损伤后炎症反应损伤程度的早期指标，其在中枢神经系统损伤后即表达上升，且损伤程度越重，血中白细胞介素6的水平越高^[7]。白细胞介素6作为一种与中枢神经系统创伤、缺血相关的重要炎症反应分子可通过刺激B细胞产生多种炎症递质，聚集下游炎性因子，从而加剧组织及血管损伤^[17]；此外，有研究报道白细胞介素6自身也具有神经营养及保护的作用，其可促进星形胶质细胞神经营养因子，促进神经元修复^[18]，但其确切的病理机制仍有待探索。

实验结果表明，急性脊髓损伤组白细胞介素6表达明显高于对照组，提示可能参与急性脊髓损伤后重要的病理生理过程，诱发局部免疫炎症级联反应，而其具体机制有待进一步研究；根据其表达水平可初步判断急性脊髓损伤严重程度，为临床诊疗提供理论依据。

3.2 脑源性神经营养因子在脊髓损伤发病机制中的作用随着再生医学的发展，学者们通过多种方法尝试改变脊髓损伤后微环境来诱导其分化为神经元，进而达到修复脊髓损伤的作用^[19]。脑源性神经营养因子作为其家族中重要一员，是体内水平最多的神经营养因子，主要分布于中枢神经系统内，其在脊髓损伤后的神经细胞保护、促进神经元形成及可塑性、神经发生中有着重要作用^[20]。

有研究证实脑源性神经营养因子受体表达于神经干细胞膜上，可直接作用于神经干细胞膜上诱导其向神经元分化^[21]。脑源性神经营养因子是最具有神经元营养活性因子，不仅能为受损神经元提供营养支持，还能促进多种运动与感觉神经元的分化、生长及再生^[22-23]，从而提高脊髓运动、感觉神经元的存活率^[24]。高表达的脑源性神经营养因子可抑制神经元凋亡并增加神经细胞数量^[25]，从而促进神经元的再生和功能修复。还有研究脊髓损伤后脑源性神经营养因子可通过减少损伤部位一氧化氮的合成，从而降低脊髓神经的损伤^[26]。此外，Garraway等^[27]报道，外源性脑源性神经营养因子可促进脊髓神经细胞轴突的生长和生长锥延伸。实验结果表明急脊髓损伤组脑源性神经营养因子表达明显高于对照组，且与脊髓损伤程度有关。由此可推断脑源性神经营养因子在急性脊髓损伤恢复中产生重要的作用,但其具体机制仍需进一步研究，而根据其表达水平可初步判断急性脊髓损伤严重程度，为临床诊疗提供理论依据。

3.3 碱性成纤维细胞生长因子在脊髓损伤发病机制中的作用碱性成纤维细胞生长因子是成纤维细胞生长因子家族成员中重要成员，是生物活性最强、最重要的神经营养因子之一^[28]。碱性成纤维细胞生长因子主要存在神经系统内，是一种对神经细胞的发育、生长、分化及再生有重要调节作用的蛋白质^[10]。

研究表明碱性成纤维细胞生长因子在脊髓损伤早期有显著作用，能强烈促进神经细胞增殖和有丝分裂，从而促进脊髓损伤的再生和修复^[29]；碱性成纤维细胞生长因子也可通过抑制内质网应激减少神经元凋亡^[30]；可通过抑制 Nogo-A信号蛋白的表达及胶质瘢痕的过度形成，从而促进脊髓损伤后的功能恢复^[31]。Aoyagi等^[32]报道在培养的胎鼠海马神经元中加入碱性成纤维细胞生长因子能神经元存活时间明显，神经细胞数量成倍增加。

有研究发现大鼠脊髓损伤3 d内碱性成纤维细胞生长因子持续性增高^[33]，且碱性成纤维细胞生长因子较其他神经营养因子的神经保护作用更大，予外源性碱性成纤维细胞生长因子干预治疗脊髓损伤大鼠后脊髓损伤区域明显减少，其神经功能的恢复明显。

实验结果表明，急性脊髓损伤组碱性成纤维细胞生长因子表达明显高于对照组，且与脊髓损伤程度有关。由此可推断碱性成纤维细胞生长因子在急性脊髓损伤恢复中产生重要的作用，但其具体机制仍需进一步研究，而根据其表达水平可初步判断急性脊髓损伤严重程度，为临床诊疗提供理论依据。

3.4 神经营养因子3和4在脊髓损伤发病机制中的作用神经营养因子3和4是神经系统重要的生物活性因子，具有明显神经营养作用的蛋白分子，在神经系统的生长、发育、正常分化、功能的维持及损伤修复中均具有重要生物学作用^[12^，^34-40]。研究证明神经营养因子3可通过激活TrkC受体促进神经干细胞的增殖，促进神经元的分化^[41]，还可促进体内脊髓轴突长距离生长^[42]；而神经营养因子4可通过诱导施万细胞包裹损伤部位轴突从而促进损伤脊髓运动神经元轴突生长^[43]。

Tobias等^[44]发现神经营养素在脊髓损伤后对完整的轴突其作用，可刺激其再生与发芽。Junger等^[45]发现在体外培养中，外源性神经营养因子3可延长大鼠胚胎神经元的存活时间，而神经元存活的数量却与加入的神经营养因子4水平有关。

实验结果也表明，急性脊髓损伤组神经营养因子3及神经营养因子4表达明显高于对照组，可推断神经营养因子3及神经营养因子4在急性脊髓损伤恢复中产生重要的作用，但其具体机制仍需进一步研究，而根据其表达水平可初步判断急性脊髓损伤严重程度，为临床诊疗提供理论依据。

因此，实验认为急性脊髓损伤后白细胞介素6、脑源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经营养因子3及神经营养因子4表达水平升高，提示这些细胞因子可能参与急性脊髓损伤后重要的病理生理过程。

由于脊髓损伤后续报道及病例数量有限，实验仍然缺乏相关病理、生理机制的基础研究，课题组下一步将完善相关基础研究，进一步研究其作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

急性脊髓损伤后48 h内外周血细胞因子的变化

Changes of cytokines in peripheral blood within 48 hours after acute spinal cord injury

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