缺血再灌注联合慢性不可预知刺激构建卒中后抑郁新模型

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1107

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
卒中后抑郁：是脑卒中常见的并发症之一，是与脑卒中事件相关的，临床表现抑郁心境的情感障碍性疾病。严重影响患者及家属的生活质量，阻碍神经功能的恢复，主要表现为情绪低落、兴趣丧失、睡眠障碍、食欲减退、悲观厌世、妄想、甚至产生自杀倾向等。
慢性温和不可预知应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)模型：是一种经典抑郁症动物模型，其常与孤养模型相结合，制作轻度不可预见的应激抑郁模型，其理论依据与人类抑郁症中慢性、低水平的应激源导致抑郁症的发生并加速抑郁症发展的机制更为接近，利用孤养模拟人类失去社会和家庭支持的孤独状态，轻度不可预见应激模拟抑郁症发病的压力源，造成孤养动物的抑郁状态。

摘要
背景：国内外卒中后抑郁动物模型主要以脑卒中叠加抑郁造模方式构建，但其各种造模方式都有其优缺点，在此基础上对卒中后抑郁造模方式进行新的探讨。
目的：采用行为学评估及脑组织神经介质检测，探究一种稳定、可复制的卒中后抑郁造模方式。
方法：雄性SD大鼠90只，体质量(200±20) g，由西安交通大学动物实验中心提供。①将60只大鼠随机分为3组，行30，60，90 min的缺血再灌注，24 h后观察大鼠存活率，并行神经功能缺损评分及脑梗死体积的评定，确定最佳缺血再灌注的时间点；②另将30只大鼠随机分为假手术组、大脑中动脉栓塞组、卒中后抑郁组，于刺激前及刺激的第1，2，3周进行强迫游泳实验、敞箱实验、糖水消耗实验、新奇抑制摄食实验、体质量变化评价大鼠的抑郁行为；运用ELisa法检测脑组织中的5-羟色胺、去甲肾上腺素及脑源性神经营养因子水平。
结果与结论：①确定了60 min为后续缺血再灌注的时间点；②行为学评估显示，与大脑中动脉栓塞组相比，卒中后抑郁大鼠的体质量、糖水消耗实验和敞箱运动垂直及水平运动得分均于第2周开始降低(P < 0.05)，新奇抑制摄食实验潜伏时间、强迫游泳实验不动时间出现明显升高(P < 0.05)；③Elisa检测显示，与大脑中动脉栓塞组相比，卒中后抑郁组大鼠的5-羟色胺、去甲肾上腺素及脑源性神经营养因子水平均降低(P < 0.05)；④结果说明，采用60 min的缺血再灌注联合慢性不可预知的刺激，建立卒中后抑郁模型，可表现出明显的抑郁状态，同时，模型稳定、存活率高，符合卒中后抑郁的多种临床特征，可能成为研究卒中后抑郁一种新的、可靠的造模方式。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-0830-6613(赵兵兵)

关键词: 卒中后抑郁, 缺血再灌注, 抑郁模型, 大脑中动脉栓塞, 慢性不可预知刺激, 抑郁样行为

Abstract:

BACKGROUND: Animal models of post-stroke depression are established by stroke combined with depression induction, and each modeling method has its own advantages and shortcomings. A new modeling method is needed.
OBJECTIVE: To explore a stable and replicable model of post-stroke depression through behavioral assessment and brain tissue neurotransmitter detection.
METHODS: Ninety male Sprague-Dawley rats weighting (200±20) g provided by Laboratory Animal Center of Xi’an Jiaotong University were enrolled. Sixty rats were randomly divided into three groups and then underwent 30, 60 and 90 minutes of ischemia/reperfusion. The survival rate of rats was observed after 24 hours, and the scores of neurological function deficit and the volume of cerebral infarct were evaluated. The optimal time points of ischemia/reperfusion were determined. The remaining 30 rats were randomly divided into sham, middle cerebral artery occlusion, and post-stroke depression groups. Forced swimming test, open field test, the novelty-suppressed feeding test, sucrose preference test and body mass change were used to evaluate rat depression behaviors before and 1, 2, and 3 weeks after stimulation. The levels of 5-hydroxytryptamine, norepinephrine, and brain-derived neurotrophic factor in brain tissue were detected by ELISA.
RESULTS AND CONCLUSION: The optimal time point 60 minutes was determined for subsequent ischemia/reperfusion. Behavioral evaluation showed that compared with the middle cerebral artery occlusion group, body mass, sucrose preference test and the vertical and horizontal movement scores of the open field test began to decrease at 2 weeks in the post-stroke depression group (P < 0.05). The latency of the novelty-suppressed feeding and the time of forced swimming test were significantly increased (P < 0.05). The results of ELISA showed that 5-hydroxytryptamine, norepinephrine, and brain-derived neurotrophic factor levels in the post-stroke depression group were significantly lower than those in the middle cerebral artery occlusion group (P < 0.05). Our findings imply that the post-stroke depression model can be established by 60-minute ischemia/reperfusion combined with chronic unpredictable mild stress. The models are stable, have a high survival rate and many clinical characteristics of post-stroke depression. It may become a new and reliable model for the study of post-stroke depression.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Stroke, Infarction, Middle Cerebral Artery, Tissue Engineering

中图分类号:

R466，R318

赵兵兵, 李涛, 王豆, 周奇, 闫咏梅. 缺血再灌注联合慢性不可预知刺激构建卒中后抑郁新模型[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1107.

Zhao Bingbing, Li Tao, Wang Dou, Zhou Qi, Yan Yongmei. A new model of post-stroke depression established by ischemia/reperfusion combined with unpredictable stress[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1107.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠90只，其中60只大鼠用于确定最佳缺血再灌注的时间点；另30只大鼠分为3组，大脑中动脉栓塞组死亡1只，卒中后抑郁组死亡2只。每组大鼠样本均不少于8只。

2.2 缺血时间的确定分别给予大鼠30，60，90 min的大脑中动脉栓塞，观察不同缺血时间点、神经功能、存活率以及脑梗死体积的变化。结果发现，随着缺血时间的延长，大鼠神经功能障碍越来越严重，并表现出明显的时间依懒性。具体如下，30 min缺血时间点的大鼠神经功能缺损评分为0.20±0.42，脑梗死体积占(3.00±1.41)%，7 d存活率约80%；60 min缺血时间点的大鼠神经功能缺损评分为1.40±0.69，脑梗死体积占比为(22.00±8.16)%，7 d存活率约50%，与30 min相比其脑梗死体积及神经功能缺损评分均增加(P < 0.05)；90 min缺血时间点的大鼠神经功能缺损评分为(2.60±0.96)分，脑梗死体积占比为(33.75±5.31)%， 7 d存活率约30%，与60 min相比(P < 0.05)，但存活率仅有30%，不能为后续试验提供保证(见图1A-D)。综上，作者认为60 min的缺血时间比较适合该模型的第1步。

2.3 抑郁状态的评估所有组大鼠于刺激前及刺激的第1，2，3周均进行的行为学评估^[15-16]。结果显示，与大脑中动脉栓塞组比较，卒中后抑郁组大鼠的体质量、糖水偏好实验和敞箱运动垂直及水平运动得分均于第2周开始降低(P < 0.05)，新奇抑制摄食试验潜伏时间、强迫游泳实验不动时间出现升高(P < 0.05)。在刺激的第3周，行为学检测显示，与大脑中动脉栓塞组相比，卒中后抑郁组大鼠呈现显著抑郁状态(P < 0.01)。见图2A-F。

2.4 卒中后抑郁组大鼠脑组织中5-羟色胺、去甲肾上腺素及脑源性神经营养因子水平的降低为了证实该模型构建成功，于慢性不可预知的刺激结束后的第2天，取脑组织检测5-羟色胺与去甲肾上腺素水平。Elisa结果显示，卒中后抑郁组大鼠脑组织皮质与海马的5-羟色胺与去甲肾上腺素含量均显著下降(P < 0.05)，见图3A，B。此外，脑源性神经营养因子影响海马神经元的发生，有研究发现卒中后抑郁模型大鼠脑组织中的脑源性神经营养因子水平出现明显下降^[17-18]。为了证实海马与大脑皮质的脑源性神经营养因子水平在卒中后抑郁模型中变化，用Elisa法测定了大鼠脑组织中脑源性神经营养因子水平，结果显示卒中后抑郁大鼠海马与皮质中脑源性神经营养因子水平均降低(^*P < 0.05)，见图3C。

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引言

卒中后抑郁(post stroke depression，PSD)是脑卒中后常见的情感障碍类疾病之一，中国的发病率在20%-65%之间^[1]。其发病机制研究主要集中在神经解剖学、神经递质、神经内分泌、炎性反应、神经再生、氧化/硝化应激损伤等，但研究方法各异，确切发病机制不同学者也是各执一词。由于动物实验中没有稳定、可复制的模型，给卒中后抑郁的发病机制及干预研究带来了一定困难。目前卒中后抑郁动物模型主要以脑卒中叠加抑郁造模方式构建。实验中常用的脑卒中造模方法有线栓法、结扎法、电凝法、去皮质缺血手术法等，其中大脑中动脉栓塞法是应用最广泛的造模方法^[2]。大脑中动脉及其分支，是临床上脑梗死最常累及的颅内血管，其发病率约占70%^[3]，其栓塞引起脑梗死病灶与临床卒中后抑郁的病理存在一定的相似性。抑郁模型的建立有孤养法+利血平注射法，慢性不可预知的刺激及空间束缚应激等方法。作者的团队对于卒中后抑郁的发病机制及中医药治疗前期进行了大量研究^[4-8]：脑卒中的构建采用了单侧颈内动脉结扎法，然而梗死病理不明显；抑郁刺激采用了孤养/利血平法，但利血平法不契合临床发病特点。基于此，采用大脑中动脉栓塞联合慢性不可预知的刺激方法构建卒中后抑郁模型，为了克服大脑中动脉栓塞+慢性不可预知的刺激法复制模型不稳定、死亡率偏高的问题，实验对大脑中动脉栓塞+慢性不可预知的刺激进行了改良，采用大脑中动脉栓塞 60 min后行缺血再灌注联合慢性不可预知的刺激复制卒中后抑郁模型，该方法具有复制性强、模型稳定、死亡率低及更符合临床发病机制的优点。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2017年9月至2018年5月在陕西中医药大学中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物与分组雄性SD大鼠90只，体质量(200±20)g，由西安交通大学动物实验中心提供，动物质量合格证编号：SCXK(陕)2017-003。实验前将SD大鼠适应性喂养1周，涉及的所有动物使用程序均获陕西中医药大学动物伦理委员会批准。第1阶段在确定缺血时间点时，分为30 min、60 min、90 min组，每组20只；在第2阶段实验中，分为空白对照、大脑中动脉栓塞(MCAO)、卒中后抑郁3组，每组10只，除了空白对照组，大脑中动脉栓塞与卒中后抑郁组以60 min为缺血再灌注时间点进行抑郁刺激3周。空白对照组大鼠无死亡，大脑中动脉栓塞组死亡1只，卒中后抑郁组死亡2只。每组大鼠样本均不少于8只，后续检测具有可比性。

1.3.2 实验用主要试剂 TTC粉末(CAS:298-96-4)、PBS干粉(P1010)均购自北京索莱宝生物科技有限公司；大鼠大脑中动脉栓塞栓线(2534-50)购自河南平顶山豫顺生物科技有限公司；大鼠5-羟色胺Elisa试剂盒(SBJ-R0128)、去甲肾上腺素Elisa试剂盒(SBJ-R0025)、脑源性神经营养因子Elisa试剂盒(SBJ-R0021)均购自南京森贝伽生物科技有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 大脑中动脉栓塞大鼠模型建立按照Longa等^[9]描述的大脑中动脉闭塞模型诱导脑缺血损伤。沿颈部正中纵行切开，分离迷走神经、颈总动脉主干及分叉、颈内动脉和颈外动脉，用4-0手术线穿过颈总动脉下方，在距离分叉1 cm处结扎颈总动脉，再用双线从颈总动脉和颈内动脉之间穿过，结扎颈外动脉，颈内动脉不结扎，用血管钳牵拉以阻断血流，在距离颈总动脉分叉约1 cm处剪一斜口，插入线栓。于30，60，90 min后，拔出线栓，恢复大脑中动脉供血区的血流，实现再灌注。术后分别给造模大鼠连续 3 d腹腔注射青霉素(4×10⁴U/只)以预防感染。根据神经功能缺损评分及TTC染色结果，后续大脑中动脉栓塞模型的建立以60 min为缺血时间点。

1.4.2 TTC染色将大鼠麻醉后经生理盐水灌注，迅速取脑，保持大脑的完整性，取出后-20 ℃冰箱中速冻10 min左右，以2 mm的厚度切成5片。将切片置于常规浓度为2%的TTC中。用锡箔纸盖住后，放入37 ℃温箱15-30 min，翻动脑片，使均匀接触到染色液，取出脑片用生理盐水冲洗2次，体积分数4%甲醛固定后拍照，正常脑组织呈红色，梗死区呈苍白色，采用Image J(1.46r，USA)软件分析单个脑片的梗死面积。脑半球体积=面积×脑片厚度，脑梗死体积计算依据以下公式：

脑梗死体积(%)=[左半球体积-(右半球体积-脑梗死体积)]/左半球体积×100^[10]

1.4.3 神经功能缺损评分制备脑卒中模型后的大鼠在术后24 h均采用下表进行评分，1-3分者表明造模成功，且评分越高，说明脑缺血越严重^[11]。见表1。

表1 神经功能缺损评分

Table 1 Scores for neurologic deficits

分值	神经功能
0分	无神经功能缺损，正常；
1分	神经功能轻度缺损，病灶对侧前爪舒展不完全；
2分	神经功能中度缺损，右前肢障碍活动，行走向对侧转圈；
3分	神经功能重度缺损，行走向肢体偏瘫侧倾斜；
4分	无意识，丧失自发行走能力。

1.4.4 慢性不可预知的刺激大脑中动脉栓塞术后第3天开始应激刺激，按照Willner等^[12]法略改进。总共7种不同的刺激，每日随机实施，同样的刺激不会连续出现。①禁食、禁水24 h；②昼夜颠倒24 h；③晃笼(200 Hz 5 min)；④湿笼100 mL水洒在笼子里24 h；⑤夹尾2 min；⑥电击足底(0.9 mA，15 s×4次)；⑦强迫游泳试验(4 ℃ 5 min)。

1.4.5 行为学评估

(1)强迫游泳试验：将每只大鼠置于玻璃圆柱体中 10 min，水温(25±1)℃，当大鼠漂浮或运动最小时，记录其不动时间，必须保持浮在水面上。

(2)糖水消耗^[13]：每笼同时放置2个水瓶，第1个24 h，2个瓶内均装有1%蔗糖水。24 h后，同时给予每只大鼠500 mL 2瓶水，1个瓶装1%蔗糖水，1个瓶装纯水，24 h后，取走糖水瓶，计算大鼠的总液体消耗、糖水消耗、纯水消耗、糖水偏爱(糖水偏爱=糖水消耗/总液体消耗×100%)，记录造模刺激前及刺激第1，2，3周的大鼠糖水偏爱值。

(3)敞箱实验：敞箱为80 cm×80 cm×50 cm 的自制无盖箱，内壁为黑色，底为白色，在底部用黑色笔划分25个等格，分别于造模开始前及造模第1，2，3周进行。将大鼠置于中心方格内，观察大鼠在5 min内穿越格数(四爪均进入的方格方可记数，为水平运动得分)及后肢直立次数(两前爪腾空或攀附墙壁，为垂直运动得分)。

(4)新奇抑制摄食试验^[14]：将大鼠置于50 cm×36 cm的聚乙烯盒子中，观测时光线强度大于饲养环境，中心放置一个大小相等的食丸，动物禁食24 h(不禁水)后，从敞箱的一角放入，记录5 min内第1次摄食的潜伏期(第1次咬食丸)。

1.4.6 样品制备在实验终点，各组大鼠称质量后，腹腔注射体积分数10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，仰卧位固定于无菌操作台上，胸腹部备皮，由胸骨游离缘向腋下方向逐层剪开皮质、皮下脂肪层、胸肌、肋骨、壁层胸膜，充分暴漏心脏。将灌注穿刺针沿左心室刺至主动脉根部，予以固定，剪开右心耳，快速灌注37 ℃0.9%氯化钠约150 mL，持续约20 min，待流出的液体清澈透且肝脏颜色变浅，四肢抽搐、肠道膨隆为成功。迅速断头在冰盒上分离皮质及海马组织，皮质在最外层，分离前额部位的皮质即为前额叶。称质量后分别置于4 mL EP管中，依据称质量等比加入PBS，匀浆机匀浆后，3 000 r/min离心10 min，取上清依据实验流程进行检测。

1.4.7 实验室指标的检测采用Elisa法测定大鼠皮质与海马组织的脑源性神经营养因子、5-羟色胺及去甲肾上腺素水平的变化。依据实验协议依次加入不同浓度的的标准品于空白孔中。分别标记样品编号，加入10 μL的样品。在标准品和样品孔中加入40 μL的酶标记溶液。加样完毕后，轻微摇动微孔反应条，以便使孔中的液体充分混匀。37 ℃孵育反应30 min。洗板机清洗5次，每次静置30 s。每孔加入底物 A、B液各 50 μL。37 ℃下避光孵育反应15 min。每孔加入50 μL终止液，终止反应。结果判断：①仪器值：于波长450 nm的酶标仪上读取各孔的A值；②以A值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，在对数坐标纸上绘线；③在标准曲线上查找对应的浓度范围。5-羟色胺和去甲肾上腺素具体操作步骤同上。

1.5 主要观察指标大鼠缺血时间、神经功能缺损评分、行为学评分，去甲肾上腺素、5-羟色胺及脑源性神经营养因子水平。

1.6 统计学分析实验结果以x(_)±s表示，运用SPSS 19.0进行统计分析。多组间采用方差分析，两组间差异性比较采用t 检验。P < 0.05认为差异有显著性意义。

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讨论

建立可靠稳定的动物模型对研究卒中后抑郁的发病机制及防治具有重要意义。卒中后抑郁动物模型的建立采用比较多的有永久性结扎单侧颈总动脉联合孤养、大脑中动脉栓塞联合慢性不可预知的刺激、双侧颈总动脉永久性结扎联合行为限制、大脑中动脉栓塞联合利血平耗竭等方法，但以上方法均各有不足。其中大脑中动脉栓塞与慢性不可预知的刺激的联合是卒中后抑郁建模最常用的方法，被用于研究卒中后抑郁的发病机制与防治^[19-20]。此次实验对大脑中动脉栓塞+慢性不可预知的刺激进行了改良，采用大脑中动脉栓塞不同的缺血时间(30，60，90 min)，发现90 min缺血组大鼠7 d存活率仅有30%，不能为后续模型的叠加提供保障。同时，60 min缺血组大鼠较30 min的缺血组能更稳定的引起大脑中动脉供血区的梗死改变，且引起的抑郁状态相对稳定。因此，选择大脑中动脉栓塞60 min作为脑卒中的造模方式。后续联合慢性不可预知的刺激构建卒中后抑郁模型，通过行为学评估及生物化学检测，证明该建模方式复制卒中后抑郁稳定性好，可用于卒中后抑郁的机制探索及药物干预研究。

强迫游泳实验、敞箱实验与新奇抑制摄食实验均广泛用于啮齿类动物抑郁模型的评估。虽然，目前这些行为学检测存在一定局限^[21-22]，卒中后抑郁大鼠出现好奇心及求生欲望降低明显，表现出典型的抑郁样行为。同时蔗糖水消耗实验、体质量变化也能够评估抑郁的核心症状。因此，此次实验通过观察大鼠体质量变化、蔗糖饮水实验、新奇抑制摄食实验、旷野实验、强迫游泳实验等行为学的改变，验证大鼠抑郁模型是否成功。大脑内的单胺类神经递质，如5-羟色胺和去甲肾上腺素，是神经细胞和效应细胞之间传递信息的重要生物胺，其降低会促使抑郁的发生^[23]。研究报道，抑郁症患者和有抑郁行为的动物，去甲肾上腺素和5-羟色胺等神经递质都有下降趋势^[24-25]。

脑源性神经营养因子是神经营养因子家族中的重要一员，参与皮质与海马部位神经元的存活、生长及损伤后的修复，与长时程增强、记忆及情绪活动密切相关。研究发现，长期慢性应激可造成大鼠脑内海马与前额叶皮质的萎缩及脑源性神经营养因子水平的显著下降^[26]。此次研究通过采用Elisa方法，检测卒中后抑郁大鼠的海马与皮质的5-羟色胺、去甲肾上腺素、脑源性神经营养因子水平，均出现下调，这些分子生物学指标更加客观地证实了实验改良的模型是稳定的卒中后抑郁模型。

目前，卒中后抑郁的发病机制在动物模型中很难被完全证实，研究者倾向于探索更接近临床发病特点的动物模型。此次，首先通过建立稳定可靠的脑梗死模型并行TTC染色加以证实，再行抑郁模型的叠加，尽可能满足多种标准，如行为绝望、神经内分泌紊乱，体质量变化。总之，采用60 min的缺血再灌注联合慢性不可预知的刺激会诱导大鼠出现抑郁样行为，该动物模型相对存活率高，符合卒中后抑郁的多重标准，可能成为研究卒中后抑郁一种新的、可靠的造模方式。

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