二氮嗪对低氧环境下骨髓间充质干细胞增殖活力及凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0461

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (9): 1332-1337.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0461

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二氮嗪对低氧环境下骨髓间充质干细胞增殖活力及凋亡的影响

李红波¹，林诗炜¹，姚江凌²，卞阳阳²，曲野¹，王雷涛²，彭磊²

¹海南医学院第二附属医院；海南医学院研究生院，海南省海口市 570102；²海南医学院第一附属医院创伤中心，海南省海口市 570102

修回日期:2017-12-21 出版日期:2018-03-28 发布日期:2018-04-03
通讯作者: 彭磊，博士，主任医师，教授，海南医学院第一附属医院创伤中心，海南省海口市 570102
作者简介:李红波，男，1983年生，湖北省孝感市人，汉族，2017年海南医学院研究生院毕业，硕士，主治医师，主要从事干细胞成骨诱导分化及关节损伤研究。并列第一作者：林诗炜，男，1961年生，海南省琼海市人，汉族，1983年广州医科大学毕业，主任医师，主要从事骨关节外科、创伤骨科、运动创伤关节镜外科的工作。
基金资助:
国家自然科学基金(81460339)；海南省自然科学基金(30863)；海南医学院培育基金(HY2018-22)

Diazoxide effects on proliferation and apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells under hypoxic conditions

Li Hong-bo¹, Lin Shi-wei¹, Yao Jiang-ling², Bian Yang-yang², Qu Ye¹, Wang Lei-tao², Peng Lei²

¹The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570102, Hainan Province, China; ²The First Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570102, Hainan Province, China

Revised:2017-12-21 Online:2018-03-28 Published:2018-04-03
Contact: Peng Lei, M.D., Chief physician, Professor, the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570102, Hainan Province, China
About author:Li Hong-bo, Master, Attending physician, the Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570102, Hainan Province, China. Lin Shi-wei, Chief physician, the Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570102, Hainan Province, China. Li Hongbo and Lin Shi-wei contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81460339; the Natural Science Foundation of Hainan Province, No. 30863; the Culture Fund of Hainan Medical University, No. HY2018-22

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
Mito-K_ATP通道：线粒体内膜ATP依赖性K通道，Mito-K_ATP参与调节线粒体离子稳态，特别是在缺血再灌注损伤中，活性氧激活Mito-K_ATP通道可以提供内源性保护。
二氮嗪：Mito K_ATP 通道激活剂二氮嗪有助于减少氧自由基，有利于线粒体ATP能量转换，从而有利于细胞能量代谢和细胞分化。加入Mito K_ATP通道激活剂二氮嗪在一定浓度范围内对骨髓间充质干细胞的活力及增殖无明显影响，可以减少骨髓间充质干细胞凋亡的发生。

摘要
背景：如何有效干预骨髓间充质干细胞进行缺氧预适应使得其移植后发挥应有的疗效是目前急需解决的问题。
目的：探讨抗氧自由基药物Mito-K_ATP通道激活剂二氮嗪对低氧环境中小鼠骨髓间充质干细胞增殖活力及凋亡的影响。
方法：将购买的小鼠骨髓间充质干细胞分为4组：空白对照组、0.16 μmol/L二氮嗪组、0.8 μmol/L二氮嗪组、4 μmol/L二氮嗪组，各组在二氮嗪干预下放置于体积分数为10%O₂培养箱培养。分别干预1，2，4，6，8 d进行MTT检测细胞增殖活性。干预后第14天进行Hoechst 33258染色，观察细胞凋亡情况。
结果与结论：①建系的小鼠骨髓间充质干细胞纯度较高，形态均一，但增殖分化能力较弱；②不同浓度二氮嗪作用下骨髓间充质干细胞活力差异无显著性意义(P > 0.05)；③空白对照组细胞核浓缩，颜色深蓝，核聚集，发现数个类圆形凋亡小体，二氮嗪组偶发现凋亡小体，3个浓度二氮嗪组间无明显差异，3组均低于空白对照组；④一定浓度的抗氧自由基Mito K_ATP通道激活剂二氮嗪在低氧环境下(体积分数为10%O₂)不影响小鼠骨髓间充质干细胞增殖活力但可减少细胞凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-3588-2600(李红波)

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 低氧环境, 二氮嗪, 细胞活力, 细胞凋亡, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: It is an urgent problem to effectively make bone marrow mesenchymal stem cells exert proper effects under hypoxic preconditioning.
OBJECTIVE: To investigate the effects of diazoxide, a Mito-K_ATP channel activator, on the proliferation and apoptosis of mouse BMSCs in hypoxic environment.
METHODS: Mouse BMSCs were divided into four groups: blank control group, 0.16, 0.8, 4 μmol/L diazoxide groups. Cells intervened by diazoxide were cultured in a 10% O₂ incubator. MTT assay was performed to detect cell proliferation at 1, 2, 4, 6, 8 days after intervention, and Hoechst 33258 staining was performed to observe cell apoptosis at 14 days after intervention.
RESULTS AND CONCLUSION: High homogeneity and purity but low proliferation of BMSCs was found. There was no significant difference in the activity of BMSCs among 0.16, 0.8, 4 μmol/L diazoxide groups (P > 0.05). In the blank control group, concentrated nuclei were dark blue in color and aggregated, and several round apoptotic bodies were found. In the diazoxide groups, apoptotic bodies were occasionally found, and no significant difference was found among different diazoxide groups. These findings indicate that a certain concentration of diazoxide can reduce cell apoptosis but has no effects on the proliferation of mouse BMSCs under hypoxic environment (10% O₂).

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Cell Hypoxia, Diazoxide, Apoptosis, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李红波，林诗炜，姚江凌，卞阳阳，曲野，王雷涛，彭磊. 二氮嗪对低氧环境下骨髓间充质干细胞增殖活力及凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(9): 1332-1337.

Li Hong-bo, Lin Shi-wei, Yao Jiang-ling, Bian Yang-yang, Qu Ye, Wang Lei-tao, Peng Lei. Diazoxide effects on proliferation and apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells under hypoxic conditions[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(9): 1332-1337.

图/表（结果） 2

2.1 已建系小鼠骨髓间充质干细胞的形态 传代后第1天，骨髓间充质干细胞呈梭形，细胞体型较大，无明显集落生长，密度分布均匀，生长迅速，4-6 d即可长满瓶底达80%以上。传代3次后细胞形态无较大变化，见图1。随着传代次数增多，细胞增殖速度减缓。但一般6 d左右细胞可铺满培养瓶底。

低氧环境下(体积分数为10%O₂)和37 ℃条件下静止培养观察小鼠骨髓间充质干细胞的扩增特点。高倍(×400)倒置显微镜下观察可见骨髓间充质干细胞有两种不同的方式增殖，其中一种为LIS增殖，间充质干细胞表现类似于“吐胞游出”形式增殖，见图2。新的细胞(或为克隆)以类圆形被吐出胞外，残留基质最后脆裂，降解。而另一种则表现为类似于“凋亡”形式的干细胞亚克隆团JIS增殖，不同于LIS增殖，这些干细胞基质先行裂解，而留下多个新的细胞(或为亚克隆)团，不发生迁移，新的细胞(或为亚克隆)团集落生长且集落群保持原有干细胞椭圆形轮廓，倒置荧光显微镜下观察生物红色荧光表现高能量活动信号。

2.2 Mito K_ATP通道激活剂二氮嗪对小鼠骨髓间充质干细胞活力的影响 培养第1，2，4，6，8天，在酶标仪上测定各孔吸光度值，记录结果见表1。组间比较F=0.131，P=0.941 > 0.05，差异无显著性意义。组内吸光度值随着时间不同差异有显著性意义(F=3.536，P=0.007< 0.05)。细胞生长曲线见图3。由图3线性趋势可见，空白对照组对数增殖期较二氮嗪干预组生长较快，但到平台期细胞活力下降明显，终末同一时间相比活力最低。而0.16 μmol/L二氮嗪组对数增殖期、平台期均优于0.8 μmol/L二氮嗪组、4 μmol/L二氮嗪组。但统计学上4组组间暂无明显差异。
2.3 Mito K_ATP通道激活剂二氮嗪对小鼠骨髓间充质干细胞凋亡的影响 干预14 d后进行Hoechst 33258染色，见图4。倒置荧光显微镜下观察可见细胞核染成蓝色，采用随机200倍镜下计数凋亡小体个数分析细胞分化过程中的凋亡情况。空白对照组细胞核浓缩，颜色深蓝，核聚集，发现数个类圆形凋亡小体，二氮嗪组偶发现凋亡小体。空白对照组凋亡指数为0.059±0.010；0.16，0.8，4 μmol/L二氮嗪组凋亡指数为0.037±0.006，0.040±0.010，0.033±0.006，统计学分析，3个二氮嗪组凋亡指数均低于空白对照组(P < 0.05)，而3个二氮嗪组间两两比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

骨组织工程是当前骨科领域的研究热点。对于临床上骨缺损、骨折不愈合、骨损伤修复异常等问题，一些学者探索各种骨替代材料，他们在考虑生物相容性和生物力学特点同时也逐步重视诱导成骨的研究和尝试。骨髓间充质干细胞具有良好生物相容性和成骨诱导分化能力而备受骨材料研究者的关注。在定向诱导骨髓间充质干细胞成骨分化研究中，细胞归巢及细胞在缺血缺氧环境中的增殖活性等问题尚未能解决。探究药物对骨髓间充质干细胞进行缺氧预适应并观察其对骨髓间充质干细胞增殖活力及凋亡的影响是骨组织工程研究中重要的一部分。1978年，斯科菲尔德在研究造血干细胞时首次提出“Niche”的概念。Niche是指干细胞在体内的局部微环境^[1]，这种微环境结构起到平衡细胞自我更新和分化的功能，适当调节这种平衡有助于组织修复和内环境稳态。实际上，在调节骨髓间充质干细胞向骨细胞分化的过程中受到许多因素影响，如细胞因子、生长因子、细胞外基质、氧体积分数等^[2-5]。

氧作为生命活动所必需环境因素，对间充质干细胞的活力、增殖、分化具有重要的调节作用^[6]。不同缺氧状态和条件下对干细胞分化的影响亦有不同，例如低氧能够增加人脂肪干细胞的促软骨再生作用^[7]。正常骨髓中氧张力为1%-6%^[8-9]，因此，推测低氧可能更适合骨髓间充质干细胞的培养。另外，当缺血性心脏病、缺血性脑病等发生时，局部损伤器官多处于低氧微环境中，局部氧体积分数可低于0.2%^[10]，而在骨组织缺损环境中氧含量可能会更低。如何有效干预间充质干细胞进行缺氧预适应使得其移植后发挥应有的疗效是目前急需解决的问题。由于正常氧条件下和缺氧条件下基因表达谱有差异，可能导致细胞增殖能力的差异性^[11]。有研究表明持续或间歇性缺氧可降低NTS神经元中的K_ATP通道功能，K_ATP通道开放剂二氮嗪(200 μmol/L作用3 min)可改善外向电流进而可能减缓细胞缺氧损伤^[6]，二氮嗪预处理开启的缺血预适应也已经广泛应用于模拟心脏的保护研究^[12-13]，提示二氮嗪预处理对间充质干细胞产生积极影响。目前，开展低氧条件预适应对间充质干细胞活力及增殖影响的研究对于间充质干细胞的应用具有非常重要的意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年9月至2016年10月在海南医学院第一附属医院中心实验室、海南医学院第一附属医院创伤中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验试剂 青霉素、链霉素、L-DMEM培养液、PBS(美国GIBICO公司)；体积分数为10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；0.25%胰蛋白酶(美国Sigma公司)；碱性磷酸酶染色试剂盒(北京博奥拓达科技有限公司)；二氮嗪(ENZO Life Sciences)。

1.3.2　实验仪器 数显式电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械厂)；酶标仪(美国宝特公司)；电子秤(梅特勒托利多仪器上海有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞传代培养 取已建系的小鼠骨髓间充质干细胞(购自上海某公司)，加入0.25%胰蛋白酶37 ℃下消化约2 min，然后加入3 mL含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养液中和消化。离心(1 000 r/min，5 min)后去上清液，PBS冲洗2次，再加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养液5 mL轻柔吹打成细胞悬液，取2.5 mL分装入25 mL培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为10%CO₂培养箱培养，2 d半量换液1次，观察细胞形态，传至第3代进行干预实验。

1.4.2 Mito K_ATP通道激活剂二氮嗪对小鼠骨髓间充质干细胞活力的影响

二氮嗪的配置：电子称取0.028 g二氮嗪放入生物安全柜以紫外线照射30 min以上，在无菌条件下配置所需浓度二氮嗪原液。以0.028 g加入30.34 mL PBS中得4 μmol/L二氮嗪，4 μmol/L二氮嗪以PBS稀释5倍得0.8 μmol/L二氮嗪，0.8 μmol/L二氮嗪再同样方式稀释5倍得0.16 μmol/L二氮嗪。实验各孔反应体系的二氮嗪浓度由于底物量不同而不同，体系中二氮嗪浓度会具体说明。

分组干预：取第3代骨髓间充质干细胞，待爬满瓶底80%时加入2 mL胰酶进行消化，在倒置显微镜下观察80%细胞皱缩为圆形时加入等量胎牛血清终止消化约5 min，离心(1 000 r/min，5 min)后去上液，PBS轻柔冲洗2次(避免底部细胞层洗掉)，再加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养液5 mL轻柔吹打成细胞悬液，细胞计数稀释至细胞浓度约5×10⁹ L^-¹接种至24孔板(每孔总量2 mL)。实验分4组：空白组、0.16 μmol/L二氮嗪组、0.8 μmol/L二氮嗪组、4 μmol/L二氮嗪组，每组3孔，放置在体积分数为10% O₂和37 ℃条件下静止培养，于第1，2，4，6，8天倒置显微镜下观察。

1.4.3 MTT检测 细胞培养至第1，2，4，6，8天，每孔加MTT溶液(5 g/L用PBS配比)20 μL，放入37 ℃无菌培养箱继续孵育4 h，小心吸弃孔内培养上清液，PBS冲洗1次，每孔加150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择450 nm波长，用酶标仪测定各孔吸光度值，记录结果，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.4.4 Hoechst 33258染色 取第3代骨髓间充质干细胞，胰酶消化后以1×10⁵个/孔接种于24孔板，分为空白组、0.16 μmol/L二氮嗪组、0.8 μmol/L二氮嗪组、4 μmol/L二氮嗪组，每组3孔。培养12 h细胞贴壁后在体积分数为10% O₂和37 ℃条件下静止培养，于第14天行Hoechst 染色。吸尽培养液，加入0.5 mL固定液固定10 min。去掉固定液，PBS冲洗瓶底2遍，每次3 min。避光下加入0.5 mL Hoechst33258染色液，染色5 min。去掉染色液，PBS冲洗瓶底2遍，每次3 min。吸干冲洗液，滴2滴抗荧光淬灭封固液于瓶底，置于倒置荧光显微镜下观察，计数凋亡小体个数，每个样品随机计数4个视野(×200)，按下列公式计算凋亡指数，凋亡指数=凋亡细胞数/(凋亡细胞数+正常细胞数)。

1.5 主要观察指标 骨髓间充质干细胞的形态，增殖活力及凋亡情况。

1.6 统计学分析 采用IBM SPSS 22.0软件分析，计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。数据图像处理采用Sigma-Plot 13.0。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

随着创伤、感染、先天性畸形矫形、肿瘤等原因所造成的骨缺损的病例越来越多，针对骨缺损的治疗方式也层出不穷，传统的移植材料有自体骨、同种异体骨、异种骨和生物材料替代等^[14]。异体骨移植可能存在排斥反应，花费昂贵，人工骨材料的成骨性能尚不能确定，且分解代谢产物问题及异物排斥反应存在一定风险。虽然自体骨移植仍是治疗骨缺损的金标准。但是自体骨移植也存在二次创伤、感染及骨量不足等问题。近年来骨组织工程的发展为骨缺损的治疗提供了新的契机，为骨缺损的临床治疗开辟了崭新的道路。Arinzeh等^[15]研究以多孔陶瓷为载体将骨髓间充质干细胞种植在犬节段性骨缺损处，显示出良好的成骨能力。而有学者将培养的间充质干细胞种植在成年兔股骨内侧髁大面积骨软骨缺损处，发现间充质干细胞产生的软骨细胞重新覆盖了关节面^[16]。低氧预适应可以保护移植间充质干细胞归巢到缺血心肌局部，有效降低氧化应激反应所致的细胞凋亡^[17]。本研究探讨在Mito K_ATP通道激活剂二氮嗪调节氧自由基的基础上对小鼠骨髓间充质干细胞活力及凋亡的影响，为寻找一种有效的、优化的骨髓间充质干细胞联合复合支架材料治疗骨缺损提供一定的实验数据。

实验采用建系标准骨髓间充质干细胞，细胞纯度较高，细胞形态较统一，部分呈已分化迹象，生长增殖较快，偶可见特异性增殖变化如LIS增殖和JIS增殖。以建系骨髓间充质干细胞在不同浓度Mito K_ATP通道激活剂二氮嗪干预下进行MTT检测，空白对照组各时间点吸光度值与二氮嗪组比较无明显差异，说明加入Mito K_ATP通道激活剂二氮嗪在一定浓度范围内对骨髓间充质干细胞的活力及增殖无明显影响。从各组生长曲线图上观察二氮嗪干预组及空白对照组都表现出细胞的对数增殖期及短暂的平台期。Hoechst 33258染色后可见空白对照组凋亡小体个数明显高于二氮嗪干预组。3个浓度的二氮嗪干预组细胞凋亡无明显差异。抗氧化应激反应降低氧自由基的方式(如使用二氮嗪)对骨髓间充质干细胞增殖没有显著的负面效果，在一定浓度下可能增加骨髓间充质干细胞的凋亡。原因可能是二氮嗪导致的凋亡信号激活(如casepase家族蛋白或线粒体途径)进而启动凋亡程序，也有可能是二氮嗪影响细胞线粒体呼吸链反应进程从而影响凋亡所需的ATP能量代谢。总之，空白对照组细胞凋亡明显高于二氮嗪组，说明在一定浓度范围内Mito K_ATP通道激活剂二氮嗪可以减少骨髓间充质干细胞凋亡的发生。Mito K_ATP通道激活剂二氮嗪有助于减少氧自由基，有利于线粒体ATP能量转换，从而有利于细胞能量代谢和细胞分化^[18]。低氧培养将提高间充质干细胞的迁移能力及黏附能力，并降低细胞凋亡率，促进缺氧区域新生血管形成^[19]。低氧有助于小鼠骨髓源间充质干细胞的定向分化^[20]。但低氧不利于干细胞的增殖和存活，这就给干细胞治疗提出一个难题，干细胞的活力及增殖能力涉及细胞自身特性及所处微环境特点，多项研究表明细胞因子影响干细胞的活力及分化能力。如胰岛素样生长因子1能够促进骨髓间充质干细胞向软骨分化，保护软骨胶原纤维的稳定性^[21]。表皮生长因子、碱性成纤维生长因子均有促进细胞分化作用^[22-24]，二者联合诱导出的神经细胞具备神经元传导所需的结构^[25]。亦有研究发现let-7c增加骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的效率^[26]。骨髓间充质干细胞是一种多潜能成体干细胞，移植人体内后可分化为骨、软骨、肌肉、脂肪、血管内皮、肝脏、神经等多种细胞^[27]，其在临床应用的前景非常广阔，故而目前已成为骨组织工程理想的种子细胞^[28-30]。在一定条件下骨髓间充质干细胞与分化成体细胞间存在反向关系，如骨髓间充质干细胞在向骨细胞及脂肪细胞分化过程中可出现反向^[31]。提高骨髓间充质干细胞活力与数量，减少细胞凋亡与死亡，促进高效归巢是骨髓间充质干细胞用于临床治疗中的重要基础。本实验发现，二氮嗪各浓度组细胞凋亡无明显差异，综合细胞活力测定及生长曲线来看，Mito K_ATP通道激活剂二氮嗪浓度≥0.16 μmol/L最有利于减少细胞凋亡、不影响细胞活力。

实验表明一定浓度Mito K_ATP通道激活剂二氮嗪可以为模拟低氧预处理骨髓间充质干细胞移植提供保护。不论是LIS分裂出的细胞(亚克隆)团，还是基质降解残留的细胞(亚克隆)团，暂时称之为LIS体或JIS体，它们时而受到微环境静电差或者电场力影响而迁移、排列分布。LIS体或JIS体这种易感特性推测其自身可能存在静电或场力极性。然而在实验中这种现象不是经常被发现，可能这种分裂及分裂子体独特特性具有时空依赖性。在其他相关实验原代SD幼鼠骨髓间充质干细胞培养中，越幼龄(约2周)的小鼠这两种分裂相对多见。周龄越大越少见，愈小也少见且分裂形式多元化，目前只做到SD鼠骨髓间充质干细胞，其他种属动物有待进一步探究。

随着干细胞相关研究的不断深入，使骨髓间充质干细胞移植成为一个真正有效治疗并广泛应用是相关科研人员的共同梦想。发现简单安全策略提高移植细胞的存活，找到更有利于分化为新的适合组织修复的干预措施依然是当前干细胞临床治疗研究的难点和热点。缺氧预处理已经证明能抵抗细胞死亡，促进增殖和向特定细胞谱系分化。然而，明确的药理处理等关键技术去改善干细胞的移植却是一个复杂而又困难的工程。因为组织中已成稳态的干细胞微环境虽然同体外实验有类似的低氧张力环境，然而体内低氧微环境可能通过刺激组织其他因子或刺激其他细胞组织旁分泌等方式产生级联放大效应。其次低氧微环境对干细胞和组织细胞的损伤作用也是不可规避的问题。例如，骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死，发现其改善心脏收缩性是基于骨髓间充质干细胞持续释放生长因子而不是转分化为心肌细胞^[32]。骨髓间充质干细胞的预防性适应局部缺氧条件可改善细胞移植的有效性。此外，提供缺氧细胞培养生物反应器的高通量细胞产量室可以用来预先处理这些再生移植治疗组织^[33-34]。未来的跨学科研究会导致升级这些基础研究为临床所用以此为干细胞的治疗提供新契机。

随着骨材料基础研究不断向前发展，未来结合患者自体骨髓间充质干细胞、成骨分化促进物质(如二氮嗪)、基质材料打印出骨支撑材料有望应用于临床治疗中。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

二氮嗪对低氧环境下骨髓间充质干细胞增殖活力及凋亡的影响

Diazoxide effects on proliferation and apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells under hypoxic conditions

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